功能基因序列分析郭燕

功能基因序列分析郭燕第1頁/共28頁一背景介紹微生物功能基因組學(xué)研究包括微生物基因組內(nèi)每個基因的作用或功能，以及基因的調(diào)節(jié)及表達(dá)，旨在從整個基因組及其全套蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能、機(jī)理的高度去了解微生物生命活動的全貌。在細(xì)菌基因組中，既有編碼在極端環(huán)境下起催化作用酶的基因，也有編碼分解化學(xué)污染物酶的基因，這些基因在真核細(xì)胞是不存在的。通過微生物功能基因組學(xué)研究，還能發(fā)現(xiàn)藥物靶位和疫苗抗原。微生物基因的功能及表達(dá)研究結(jié)果也能為研究復(fù)雜生物的基因功能提供參考。由于微生物的種類繁多，功能基因組研究的內(nèi)容較豐富。已有75種(株)微生物的基因組完成測序，160多種(株)微生物的基因組測序正在進(jìn)行中。第2頁/共28頁二已知功能基因的鑒定_以PQQ為例PQQ是一種氧化還原酶的輔酶，廣泛分布于植物、動物、微生物及周圍環(huán)境中，具有多種生物學(xué)功能。早在20世紀(jì)60年代，科學(xué)界開始對PQQ展開研究：先后在醋酸桿不動桿菌、熒光假單胞菌、歐文氏菌（Erwinia）等屬中發(fā)現(xiàn)GDH含有一種相同的輔酶。它熱穩(wěn)定性好，能與親核分子如氨基酸、巰基、氨等相互作用。應(yīng)用光譜、質(zhì)譜等技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)蘋果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶也有這種輔酶，晶體結(jié)構(gòu)分析表明，該輔基是一個含有三個羧酸基團(tuán)的醌類，確定其結(jié)構(gòu)式為4,5-二氫-4,5-二氧-1氫-吡咯并（2,3-f）喹啉-2,7,9-三羧酸，命名為“吡咯喹啉醌”簡稱PQQ。第3頁/共28頁PQQ只能在某些革蘭氏陰性菌中合成，具有生物學(xué)功能如下：Ⅰ刺激細(xì)胞生長刺激微生物細(xì)胞生長：縮短菌體的遲緩期，類似菌體必需生長因子，隨著濃度增長，加快菌體生長速度，提高菌體細(xì)胞產(chǎn)量；縮短菌體的遲緩期，不影響菌體細(xì)胞的生長速度。刺激植物細(xì)胞生長：刺激花粉萌發(fā)，其模式與刺激微生物生長的模式大致相同，即通過縮短生長停滯期以達(dá)到刺激植物生長的目的。第4頁/共28頁PQQ能夠促進(jìn)煙草種子萌發(fā)，提高脂肪酶活性和種子呼吸速率，

還能夠通過促進(jìn)生長素和細(xì)胞分裂素合成，促進(jìn)分子水平基因調(diào)控，從而提高植物細(xì)胞新陳代謝而發(fā)揮促進(jìn)植物生長的作用。在冬小麥花退化高峰的孕穗期和生長代謝旺盛期，噴灑PQQ可以提高葉片中葉綠素含量，加快植物的光合作用，提高谷丙轉(zhuǎn)氨酶和硝酸還原酶的活性，從而調(diào)節(jié)植株體內(nèi)生理代謝功能，有益于改善植株營養(yǎng)供給，減少穗部小花敗育，提高麥穗結(jié)實率。2008年，Choi等報道了一種植物根際促生長細(xì)菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR)PseudomonasfluorescensB16，該菌株為合成PQQ的野生型菌株，協(xié)和培養(yǎng)該菌與植物可以增加西紅柿花數(shù)量、植株高度、果實數(shù)量和果實總重量，而所有不能合成PQQ的突變型菌株則沒有此作用效果。因此，推測PQQ是PGPR發(fā)揮作用的重要原因之一。例子第5頁/共28頁刺激人體細(xì)胞生長：Naito等報道低濃度PQQ(0.003～30μM)顯著增強(qiáng)人成纖維細(xì)胞DNA的合成，并且顯著增加細(xì)胞密度，相比之下，PQQ的刺激作用優(yōu)于成纖維細(xì)胞生長因子和胰島素等生長因子，與上皮細(xì)胞生長因子的作用相當(dāng)；但當(dāng)PQQ濃度達(dá)到750～1500μM時，DNA合成受到抑制引起細(xì)胞死亡。國內(nèi)（熊順華等）也先后報道了適量濃度的PQQ對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元和海馬區(qū)神經(jīng)元的生長速度有促進(jìn)作用，但PQQ的濃度過高會產(chǎn)生毒性。第6頁/共28頁

ⅡPQQ是動物生長、發(fā)育和繁殖必需的營養(yǎng)因子

作為賴氨酰氧化酶的輔助因子：Kasahara和Kato在前人研究基礎(chǔ)上，通過比對酵母、果蠅以及小鼠參與賴氨酸代謝通路的同源蛋白，間接地證明了小鼠體內(nèi)的賴胺酰氧化酶是以PQQ作為輔助因子，建議將PQQ作為一種新的B族維生素。然而，F(xiàn)elton、Anthony和Ｒucker分別發(fā)表文章否定了Kasahara和Kato得出的實驗結(jié)論。Ｒucker等認(rèn)為，從藥理與營養(yǎng)學(xué)角度來分析，PQQ定義為一種維生素的證據(jù)還不足，只能說它是一種重要的生物因子。因為不同物種對于維生素的需求存在較大差異，例如，維生素C是人類、靈長類生物必需的，但是鼠卻不需要。因此，對人類來說PQQ是否是一種維生素，需要進(jìn)一步研究證實。第7頁/共28頁

ⅢPQQ對自由基有清除作用，可以保護(hù)機(jī)體減少氧化損傷在正常生理條件下，生物體保持一種自穩(wěn)態(tài)，自由基的產(chǎn)生和清除維持動態(tài)平衡狀態(tài)，自由基產(chǎn)生過少或過多都會對機(jī)體健康產(chǎn)生影響。PQQ能夠在沒有谷胱甘肽(GSH)參與下直接清除過量的自由基。PQQ清除自由基的效力是抗壞血酸的50～100倍。如下3個方面：保護(hù)心臟免受氧化損傷：PQQ能夠清除由缺氧再灌注產(chǎn)生的ROS(reactiveoxygenspecies），顯著降低心臟中乳酸脫氫酶的釋放，在黃素還原酶催化作用下，催化產(chǎn)物還能夠降低血紅蛋白過氧化狀態(tài)，消除缺氧再灌注對心肌的損傷。Tao等報道，PQQ能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞ＲOS的產(chǎn)生、線粒體膜電位的降低，降低氧化應(yīng)激、抑制線粒體功能的失活和保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞等作用。第8頁/共28頁防止眼晶狀體損傷及肝臟脂質(zhì)過氧化：白內(nèi)障的發(fā)生與自由基水平升高有關(guān)。PQQ能夠提高晶狀體中GSH水平防止氧化應(yīng)激對晶狀體的損傷，保證晶狀體代謝的正常進(jìn)行，從而避免了因晶狀體蛋白變性而發(fā)生的混濁，緩解白內(nèi)障癥狀。同樣的原理，PQQ可以通過提高肝臟中GSH水平，從而抑制肝臟內(nèi)脂質(zhì)過氧化發(fā)生，促進(jìn)膽綠素通過膽小管向膽囊分泌，減少其在肝臟中的停留。抑制化學(xué)發(fā)光及炎癥產(chǎn)生：化學(xué)發(fā)光是突發(fā)性氧化作用，PQQ通過抑制突發(fā)性氧化作用及誘發(fā)ＲOS的失活抑制化學(xué)發(fā)光的作用；PQQ亦可抑制炎癥的產(chǎn)生，將鼠爪中注射角叉藻膠，可引起溫度升高及局部水腫等炎癥反應(yīng)。如果先在小鼠腹腔注射PQQ，然后注射角叉藻膠，可明顯發(fā)現(xiàn)局部水腫受到抑制，功效則與消炎痛(indomethacin)相當(dāng)。第9頁/共28頁抗氧化，保護(hù)肝臟損傷：PQQ對由某些肝細(xì)胞毒素造成的肝損傷具有保護(hù)作用，在大鼠實驗中，如由硫代乙酰胺、四氯化碳、D－半乳糖胺等造成的肝損傷通過使用PQQ可顯著降低肝臟血清膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的水平但不影響肝臟的重量。即使肝損傷已發(fā)生，PQQ的作用仍十分明顯，健康大鼠的血糖、血尿氮等血、尿常規(guī)生化指標(biāo)亦不受影響。330μM的GSH和21μM的維生素E的作用與3μM濃度PQQ的對肝臟的保護(hù)效果相同。第10頁/共28頁PQQ發(fā)揮抗氧化作用的其他功效：乙醛是乙醇代謝的有害中間產(chǎn)物，也是乙醇中毒的重要原因。PQQ通過加快乙醛氧化的速度來降低乙醛的含量，進(jìn)而降低小鼠乙醇中毒的危險。PQQ在保護(hù)植物方面同樣有功效，在冷脅迫條件下，可以利用PQQ減緩過氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(AsAPOD)活性，促使GSH含量的下降，從而一定程度上減輕低溫脅迫對黃瓜幼苗的傷害。第11頁/共28頁Ⅳ提供神經(jīng)營養(yǎng)和保護(hù)作用促進(jìn)神經(jīng)生長因子生成：PQQ能夠促進(jìn)許多細(xì)胞合成和分泌NGF，并且胞內(nèi)的NGFmRNA濃度提高，PQQ在NGF轉(zhuǎn)錄前發(fā)揮促合成的作用。保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)免受有害物質(zhì)損傷：PQQ對由6-OHDA誘導(dǎo)構(gòu)建的帕金森模型的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的具有神經(jīng)毒性修復(fù)作用。PQQ在治療中風(fēng)方面亦具有潛在的應(yīng)用價值，Jensen等對7日齡大鼠腦缺氧/缺血模型的研究報道，損傷前30min腹腔注射PQQ，可以顯著減少腦梗死范圍，并且不產(chǎn)生神經(jīng)行為副作用。PQQ作為一種具有優(yōu)良性能的神經(jīng)保護(hù)藥物，在老年癡呆癥、治療帕金森癥、中風(fēng)等方面具有開發(fā)前景。第12頁/共28頁小結(jié)PQQ在自然界中廣泛分布，它不僅參與氧化還原反應(yīng)，同時還具有多種生物學(xué)功能，已有證據(jù)表明PQQ在增強(qiáng)動物免疫功能、提高繁殖力等方面發(fā)揮重要的作用。PQQ作為一種具有多種生理功能的生物活性物質(zhì)，在炎癥、溶血性貧血、傳輸神經(jīng)興奮失調(diào)、肝病和骨質(zhì)疏松癥等疾病的治療方面具有很大的潛力，因此具有良好的藥用開發(fā)前景。目前主要靠化學(xué)方法合成PQQ，其步驟繁雜，收率低，副產(chǎn)物多，后續(xù)處理困難，且成本高，產(chǎn)量低，價格昂貴，因此闡明其生物合成機(jī)理、研究PQQ的生物合成、構(gòu)建高產(chǎn)菌株具有重要意義。為提高PQQ產(chǎn)量，篩選和分離新型PQQ產(chǎn)生菌株將成為該領(lǐng)域重點研究的方向之一。第13頁/共28頁報道已知微生物菌屬如Pseudomonas、Erwinia等屬的一些菌株具有合成PQQ的基因。PQQ、有機(jī)酸和解磷菌的解磷作用密切相關(guān)，P.fluorescensB16,thePQQ操縱子由11個基因組成,pqqA,-B,-C,-D,-E,-F,-H,-I,-J,-K,andpqqM.微生物功能基因序列分析方法第14頁/共28頁分析方法——已知基因1拼接序列——SeqMan2翻譯蛋白——MEGA設(shè)計引物-PCR擴(kuò)增-測序第15頁/共28頁第16頁/共28頁3比對蛋白序列——NCBI第17頁/共28頁4下載模式菌株第18頁/共28頁Another——直接以核苷酸序列比對第19頁/共28頁第20頁/共28頁第21頁/共28頁5比對建樹——MEGA第22頁/共28頁

GY34D

ErwiniamallotivoraT（EXU75606）

ErwiniaamylovoraT（WP004170874）

GY35D

GY32D

GY33D

PseudomonassynxanthaT（WP005792079）

GY34C

ErwiniabillingiaeT（YP003743151）

Pseudomonassp.（AEN80176）

GY32C

GY33C

Pseudomonassp.（WP007949605）100801458821009677100490.2第23頁/共28頁利用SSCP技術(shù)分析甘藍(lán)型油菜功能基因序列差異

李媛媛等利用DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)技術(shù),對10對功能基因特異性引物進(jìn)行多態(tài)性分析,每對引物均檢測到1個多態(tài)性位點。結(jié)果表明,SSCP標(biāo)記能夠真實代表原始功能基因，甘藍(lán)型油菜功能基因序列在不同材料間高度保守，其遺傳變異類型主要來源于SNP。第24頁/共28頁SSCP檢測與分析

PCR產(chǎn)物最先在1.5%(W/V)的瓊脂糖凝膠上檢測,擴(kuò)增帶型明顯,沒有拖尾,并且比較明亮，就被用于SSCP分析。電泳時,溫度控制在4℃左右,電壓恒定在500V。電泳完成后,銀染和顯色；回收片段及再擴(kuò)增；克隆片段的測序及其序列分析SSCP分析：采用6%(W/V)的非變性聚丙稀酰胺凝膠電泳，對上述10對引物的變性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析,每對引物PCR產(chǎn)物所形成的單鏈在甘藍(lán)型油菜SI-1300和Eagle間均檢測到1個清晰的多