臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)：3細(xì)菌生化反應(yīng)

概念：不同細(xì)菌所具有的酶系統(tǒng)各不相同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用能力各異，它們?cè)诖x過(guò)程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，利用生物化學(xué)方法直接或間接檢測(cè)細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，從而鑒別細(xì)菌的反應(yīng)稱(chēng)之為細(xì)菌生化反應(yīng)。學(xué)習(xí)目標(biāo)：

掌握每個(gè)生化試驗(yàn)原理及結(jié)果觀察！2023/3/91細(xì)菌的生物化學(xué)鑒定技術(shù)生化反應(yīng)分類(lèi)碳水化合物的代謝試驗(yàn)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)碳源和氮源利用試驗(yàn)呼吸酶類(lèi)試驗(yàn)其他生化試驗(yàn)2023/3/93細(xì)菌的生物化學(xué)鑒定技術(shù)（一）碳水化合物的代謝試驗(yàn)1.糖（苷、醇）類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)作用：是鑒定細(xì)菌最主要和最基本的試驗(yàn)，特別對(duì)腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要2023/3/94原理：酶不分解（－）糖（苷、醇）產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（＋）產(chǎn)酸產(chǎn)氣＋常用糖（苷、醇）類(lèi)底物：?jiǎn)翁牵浩咸烟?、果糖、半乳糖等雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖等多糖：淀粉、糊精、肝糖等醇類(lèi)：甘露醇、衛(wèi)矛醇、山梨醇等苷類(lèi)：七葉苷、水楊素等常用指示劑及顏色變化

pH域

酸色堿色酚紅6.8--8.4黃

紅溴麝香草酚藍(lán)6.0--7.6黃

藍(lán)溴甲酚紫5.2--6.8黃

紫甲基紅4.2--6.2紅

黃中性紅6.8--8.0紅

黃2023/3/96指示劑：溴甲酚紫酸性：黃色堿性：紫色指示劑：酚紅酸性：黃色堿性：紅色結(jié)果：2023/3/972．氧化―發(fā)酵試驗(yàn)（O/F試驗(yàn)）作用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者通常為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌間的鑒別。2023/3/98原理：有些細(xì)菌僅能在有氧的情況下分解

葡萄糖（氧化型）

有些細(xì)菌在有氧無(wú)氧的情況下都可

以分解葡萄糖（發(fā)酵型）

有些細(xì)菌在有氧無(wú)氧的情況下都不

分解葡萄糖（產(chǎn)堿型）結(jié)果：氧化發(fā)酵產(chǎn)堿

注意：需加無(wú)菌石蠟油隔絕空氣！

2023/3/99指示劑為溴甲酚紫或溴麝香草酚蘭2023/3/9103．β―半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG試驗(yàn)）迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌ONPG試驗(yàn)均為陽(yáng)性，而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本試驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。2023/3/911細(xì)菌正常分解乳糖必需具備半乳糖苷滲透酶

(主動(dòng)運(yùn)輸乳糖，乳糖進(jìn)入細(xì)胞速度快）和-半乳糖苷酶（分解乳糖）。

遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌因?yàn)閮H有-半乳糖苷酶，沒(méi)有半乳糖苷滲透酶，所以乳糖進(jìn)入細(xì)胞只能依靠被動(dòng)滲入，速度慢，表現(xiàn)為發(fā)酵乳糖的速度也很慢。原理：-半乳糖苷酶試驗(yàn)是用鄰硝基酚半乳糖苷（ONPG，本身無(wú)色）代替乳糖，由于其分子量小，不需要半乳糖滲透酶就可直接快速進(jìn)入菌細(xì)胞，被-半乳糖苷酶水解后生成黃色的鄰－硝基酚，可快速檢測(cè)細(xì)菌是否具有-半乳糖苷酶（即細(xì)菌能否發(fā)酵乳糖）。結(jié)果：黃色（+）2023/3/912細(xì)菌正常利用乳糖一般需要兩個(gè)酶：促使乳糖進(jìn)入細(xì)菌的半乳糖苷透過(guò)酶(galactosidepermease)和催化乳糖分解第一步的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。2023/3/9ONPG(+)(-)

-

-

+4.七葉苷水解試驗(yàn)(esculintest)

＋－七葉苷pH<7β-D-葡萄糖七葉素黑色沉淀

(檸檬酸鐵)

應(yīng)用：D群鏈球菌和腸球菌的鑒定。2023/3/9155、甲基紅試驗(yàn)（MR試驗(yàn)）、VP試驗(yàn)

原理：

葡萄糖

丙酮酸

乙酰甲基甲醇混合酸

KOH+空氣氧化

二乙酰pH4.5

-奈酚（+胍基）

甲基紅指示劑

紅色化合物

紅色（VP試驗(yàn)陽(yáng)性）

(甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性)

結(jié)果：紅色為陽(yáng)性

培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水

注意：兩種試驗(yàn)看結(jié)果前均需加試劑！MR試驗(yàn)（－）

（＋）葡萄糖甲基紅試劑丙酮酸甲酸，乙酸等大量混合酸pH降至4.5以下培養(yǎng)基變紅甲基紅試驗(yàn)

MethylRedVP試驗(yàn)（－）

（＋）葡萄糖二乙酰V-P試劑

(KOH+α-萘酚)脫羧丙酮酸乙酰甲基甲醇培養(yǎng)基變紅VP試驗(yàn)

Voges-ProskauerTest

2023/3/918（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)1．吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)

注意：觀察結(jié)果前需加吲哚試劑！色氨酸酶色氨酸對(duì)二甲基氨基苯甲醛靛基質(zhì)（吲哚）玫瑰吲哚吲哚(-)(+)吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)(Indoletest)原理主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種鑒別2.硫化氫試驗(yàn)原理-+含硫氨基酸(胱氨酸等)硫化氫黑色沉淀分解

Fe2+/Pb2+

2023/3/9213.尿素分解試驗(yàn)(Ureasetest)主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定。

-+尿素尿素酶氨+CO2培養(yǎng)基變紅色pH酚紅2023/3/923尿素分解試驗(yàn)（指示劑為酚紅）（－）（＋）4.苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)（phenylalaninedeaminasetest）主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅菲登斯菌屬和摩根菌屬細(xì)菌均為陽(yáng)性，腸桿菌科中其他細(xì)菌均為陰性。苯丙氨酸苯丙氨酸脫氨酶苯丙酮酸10％三氯化鐵綠色化合物＋

－5.氨基酸脫羧酶試驗(yàn)(aminoaciddecarboxylationtest)

應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。＋

－氨基酸(鳥(niǎo)氨酸，賴(lài)氨酸，精氨酸）pH（）脫羧酶胺（腐胺，尸胺，精胺）

+CO2培養(yǎng)基變紫或紅色溴甲酚紫或酚紅＋

－2023/3/9262023/3/927（三）碳源和氮源利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)應(yīng)用：用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。原理：有些細(xì)菌能利用枸櫞酸鹽作為唯一的碳源獲得能量也能利用銨鹽作為唯一的氮源，同時(shí)生成氨，使培養(yǎng)基堿化。結(jié)果：指示劑為溴麝香草酚蘭2023/3/928（＋）（－）枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)

（－）（＋）

細(xì)胞色素氧化酶參與的細(xì)菌呼吸途徑中電子傳遞1.氧化酶試驗(yàn)（Cytochromeoxidasetest）（四）呼吸酶類(lèi)試驗(yàn)細(xì)胞色素C細(xì)胞色素氧化酶氧化的細(xì)胞色素C二甲基對(duì)苯二胺（還原）四甲基對(duì)苯二胺（還原）無(wú)色無(wú)色二甲基對(duì)苯二胺（氧化）四甲基對(duì)苯二胺（氧化）藍(lán)色紅色應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的鑒別。間接法直接法氧化酶試驗(yàn)（Cytochromeoxidasetest）結(jié)果試管法玻片法2.過(guò)氧化氫酶（觸酶）試驗(yàn)(Catalasetest)應(yīng)用：用于革蘭陽(yáng)性球菌的初步分群。觸酶H2O2H2O出現(xiàn)氣泡+O23.硝酸鹽還原試驗(yàn)(Nitratereductiontest)原理

對(duì)氨基苯磺酸-萘胺-萘胺偶氮苯磺酸亞硝酸鹽2023/3/933原理：有些菌可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽或氨和氮等，前者可與-萘胺和對(duì)氨基苯磺酸反應(yīng)，生成紅色偶氮化合物。硝酸鹽還原試驗(yàn)就是測(cè)定還原過(guò)程中所產(chǎn)生的亞硝酸鹽。

結(jié)果：立即出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性；若沒(méi)有紅色出現(xiàn)，原因可能為：①真正陰性，可加鋅粉于陰性反應(yīng)物中，變成紅色，為真正陰性；②或假陰性（真陽(yáng)性），加鋅粉不變色，因生成的亞硝酸鹽被進(jìn)一步還原成NH3、N2

等。

鋅硝酸鹽亞硝酸鹽硝酸鹽沒(méi)有被還原硝酸鹽還原試驗(yàn)(幾種結(jié)果演示)硝酸鹽培養(yǎng)基變紅不變紅色硝酸鹽亞硝酸鹽硝酸鹽氨+氮+試劑（對(duì)氨基苯磺酸、-萘胺）Zn變紅不變紅色（）硝酸鹽亞硝酸鹽Zn本試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中廣泛應(yīng)用。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌等非發(fā)酵菌可還原硝酸鹽產(chǎn)生氮?dú)狻?+-2023/3/9351．DNA酶試驗(yàn)在革蘭陽(yáng)性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生DNA酶，在腸桿菌科中沙雷氏菌產(chǎn)生此酶。（五）其他生化試驗(yàn)2023/3/936

DNA酶試驗(yàn)原理：

DNA酶

長(zhǎng)鏈DNA寡核苷酸鏈

（可被酸沉淀：白色）（可溶于酸：透明）2.血漿凝固酶試驗(yàn)作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標(biāo)，也是葡萄球菌鑒別時(shí)常用的一個(gè)試驗(yàn)。致病性葡萄球菌具有兩種凝固酶:結(jié)合凝固酶（結(jié)合在菌細(xì)胞壁上，相當(dāng)于纖維蛋白原的受體）游離凝固酶（作用類(lèi)似凝血酶原，激活后可使血漿凝固）纖維蛋白原纖維蛋白凝固酶血漿液態(tài)凝固（－）（＋）（－）（＋）（Coagulasetest）

玻片法試管法2023/3/9383．CAMP試驗(yàn)在鏈球菌中，只有B群鏈球菌產(chǎn)生CAMP因子，可促進(jìn)葡萄球菌產(chǎn)生的beta-溶血素溶解紅細(xì)胞的能力。金黃色葡萄球菌4.膽汁溶菌試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生自溶酶使細(xì)菌溶解，而膽汁能激活自溶酶加快細(xì)菌溶解。應(yīng)用：肺炎鏈球菌的鑒定5.卵磷脂酶試驗(yàn)原理：有的細(xì)菌產(chǎn)生卵磷脂酶(α-毒素)，在鈣離子存在時(shí)，此酶可迅速分解卵磷脂，生成渾濁沉淀狀的甘油酯和水溶性磷酸膽堿

應(yīng)用：主要用于厭氧菌鑒定。被檢菌劃線(xiàn)接種或點(diǎn)種于卵黃瓊脂平板上，于35℃培養(yǎng)3--6h2023/3/941（1）O/129抑菌試驗(yàn)用于弧菌科的屬間鑒別，弧菌屬、鄰單胞菌屬對(duì)O/129敏感，而氣單胞菌屬耐藥。（2）桿菌肽試驗(yàn)用于A群鏈球菌與非A群鏈球群的鑒別（抑菌圈直徑≥10mm敏感）（3）奧普托欣（Optochin）試驗(yàn)主要用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別（抑菌圈≥14mm為敏感）。6.常見(jiàn)抑菌試驗(yàn)肺炎鏈球菌對(duì)optochin敏感

（抑菌圈≥14mm)A群鏈球菌對(duì)桿菌肽敏感

（抑菌圈≥10mm)2023/3/9437.復(fù)合生化試驗(yàn)

44克氏雙糖鐵培養(yǎng)基②分解葡萄糖+乳糖產(chǎn)酸(乳糖多，產(chǎn)酸多）

斜面和底層均變黃

(KliglerIronAgar,KIA)組成：無(wú)糖培養(yǎng)基+1份葡萄糖+10份乳糖+鐵鹽+酚紅

營(yíng)養(yǎng)底物底物底物指示劑原理：①只分解葡萄糖產(chǎn)酸（葡萄糖少，產(chǎn)酸量少）斜面產(chǎn)生的酸被氧化、揮發(fā)、中和，呈紅色底層缺氧，不氧化，黃色③產(chǎn)生硫化氫+鐵鹽FeS黑色沉淀

應(yīng)用：檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌對(duì)乳糖、葡萄糖