培養(yǎng)細胞的觀察和檢測

培養(yǎng)細胞的觀察和檢測第1頁/共25頁一、培養(yǎng)細胞的常規(guī)觀察細胞在體外培養(yǎng)過程中需要每天進行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察，及時了解細胞生長狀態(tài)、數(shù)量改變、細胞形態(tài)、細胞有無移動、有無污染、培養(yǎng)液pH是否變酸、變黃是否更換等。細胞常規(guī)檢查觀察的內(nèi)容為：

第2頁/共25頁1、培養(yǎng)液培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化正常情況下，培養(yǎng)液pH介于7.2～7.4之間，呈桃紅色清亮透明。隨著細胞生長時間的延長，細胞代謝產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物會使培養(yǎng)液pH值下降，引起顏色變淺變黃。正常情況生長穩(wěn)定的細胞2～3天換液一次，生長緩慢的細胞3～4天換液一次。第3頁/共25頁培養(yǎng)液中加Hepes或用5%CO2溫箱培養(yǎng)可使pH維持穩(wěn)定，利于細胞生長。用含磷酸鹽緩沖系統(tǒng)培養(yǎng)時，可因瓶及塞子漏氣，CO2溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶塞洗刷不潔、殘留堿性物，使培養(yǎng)液變堿發(fā)紅，只致使細胞難以生長，甚至死亡。細胞換液傳代后，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液很快變黃，要注意是否有細菌污染或培養(yǎng)器皿沒有洗干凈。貼壁細胞培養(yǎng)時若出現(xiàn)混濁，多為污染。懸浮培養(yǎng)的細胞，應(yīng)將瓶豎起靜置1小時，若培養(yǎng)基混濁示為污染，也可在顯微鏡下仔細觀察有無污染現(xiàn)象出現(xiàn)。

第4頁/共25頁2、細胞生長情況生長良好的細胞，在顯微鏡下可觀察到細胞透明度大，折光性強，輪廓不清。若細胞生長狀態(tài)不良，可見細胞輪廓增強，細胞折光性變?nèi)?，細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)，細胞之間空隙增大，細胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細胞的特點，產(chǎn)生圓縮脫落，有時細胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。第5頁/共25頁若細胞營養(yǎng)不良狀況沒有得到及時糾正，進一步發(fā)展可見到部分細胞死亡，崩解漂浮在培養(yǎng)液中。發(fā)現(xiàn)這種情況應(yīng)及時處理，只有生長良好的細胞才能進行傳代培養(yǎng)和實驗研究。

第6頁/共25頁3細胞生長狀態(tài)細胞培養(yǎng)時，經(jīng)初代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)，都有一長短不同的潛伏期，在培養(yǎng)過程中注意觀察細胞增殖生長的狀態(tài)極為重要。各種細胞增殖的時間不盡一致。傳代細胞系，胚胎組織或幼體細胞潛伏期短，一般在接種培養(yǎng)第二天即可見細胞生長增殖，3～4天便可連接成片。成體組織的潛伏期長，老年組織和癌組織潛伏期更長，可達一周左右。第7頁/共25頁原代細胞培養(yǎng)中最先可見從組織塊中邊緣“長出”細胞，這種細胞是從原代組織塊中游走出來的，并不是細胞增殖產(chǎn)生。這種早期游出的細胞多以成纖維細胞為主，其易生長，適應(yīng)性強，呈放射狀或旋渦狀分布，很快生長并互相連接成網(wǎng)狀。傳代細胞在傳代后，一般經(jīng)過懸浮、貼壁伸展很快進入潛伏期，對數(shù)生長期，細胞大量繁殖，逐漸相連成片而長滿瓶底。一旦發(fā)現(xiàn)細胞長滿瓶底80%就應(yīng)及時傳代，否則會影響細胞生長甚至脫落。懸浮細胞當(dāng)發(fā)現(xiàn)生長顯著、密度增大、分布稠密、培養(yǎng)液變黃時也應(yīng)及時傳代。

第8頁/共25頁4、微生物污染

細胞接種、傳代、換液加藥后應(yīng)經(jīng)常觀察，密切注意是否有微生物污染發(fā)生。一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液混濁、液體內(nèi)漂浮著菌絲或細菌，或生長明顯變緩，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，有中毒表現(xiàn)等應(yīng)懷疑是否有微生物污染，進一步觀察檢查并及時處理。

第9頁/共25頁二、細胞生長曲線的測定生長曲線是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數(shù)生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入平頂期，然后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述整個過程中細胞數(shù)目的動態(tài)變化，需連續(xù)對細胞進行計數(shù)。通常計數(shù)7d。為精確起見，一般每次計數(shù)3瓶細胞并取平均值。典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，斜率較大的指教生長期，呈平臺狀的平頂期及退化衰亡4個部分。以存活細胞數(shù)(萬／mL)對培養(yǎng)時間(h或d)作圖，即得生長曲線。第10頁/共25頁除使用計數(shù)法測定細胞的生長曲線外，還可用MTr比色法間接測量之。MTT比色法的主要原理是：MTr被活細胞中線粒體琥珀酸脫氫酶還原后，生成暗藍色甲瓚，甲瓚被助溶劑溶解后，可在酶標(biāo)儀上讀取光吸收值(OD)，在一定范圍內(nèi)光吸收值(OD)與活細胞數(shù)量呈線性關(guān)系。所以可以通過測量OD值，間接測量活細胞數(shù)量。生長曲線常用于測定藥物等外來因素對細胞生長的影響。一般在對數(shù)生長期的1/3－1/2處加藥。細胞計數(shù)的時間和次數(shù)則依實驗?zāi)康亩?。?1頁/共25頁三、細胞培養(yǎng)的污染檢測及其排除凡混入細胞培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應(yīng)視為污染

細胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性。

第12頁/共25頁細胞污染的分類

物理污染

化學(xué)污染

生物污染（支原體污染）

控制污染

掌握良好的無菌操作技術(shù)

建立細胞庫

合理應(yīng)用抗生素

保持工作區(qū)清潔

建立良好的規(guī)章制度

檢測細胞污染

第13頁/共25頁1、污染途徑

空氣：每立方米含菌數(shù)不應(yīng)超過1－5個

器材：

操作：

血清：

組織樣本：

第14頁/共25頁2、對細胞的影響生長緩慢，分裂相減少，細胞變粗糙，輪廓增強，胞漿多顆粒狀物。重者細胞增殖停止，分裂相消失，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細胞變圓或崩解，從瓶壁脫落。

細胞污染的種類和判定

細胞培養(yǎng)中常見的污染物有細菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以下情況時培養(yǎng)的細胞可能有污染：

培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變。

培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。

光鏡觀察到菌絲和顆粒。

細胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等。

第15頁/共25頁3、污染物的檢測

1）.真菌污染

常見真菌種類：多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等

真菌污染判斷：

肉眼可見培養(yǎng)液中見白色或黃色漂浮物，

倒置鏡下見細胞間縱橫交錯，絲狀、管狀、樹枝懸浮飄蕩的菌絲或形態(tài)呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長，

培養(yǎng)液多不混濁。第16頁/共25頁2）.細菌污染

常見細菌種類：大腸桿菌、白色葡萄球菌、假單孢菌等

細菌污染判斷：

培養(yǎng)液顏色變黃，出現(xiàn)混濁

鏡下觀察，大量圓球狀顆立漂浮，細胞表面和周圍有大量細菌

細胞生長停止，并有中毒表現(xiàn)

第17頁/共25頁細菌和真菌污染的檢測：

涂片染色鏡檢；

接種培養(yǎng)：Trypticase大豆肉湯、BHI、Thioglycocollate肉湯和血瓊脂板適于廣泛的細菌檢測；Sabouraud肉湯、YM肉湯和營養(yǎng)肉湯適于檢測真菌。

檢測到陽性結(jié)果后，應(yīng)高壓滅菌處理污染的培養(yǎng)物及其用具

第18頁/共25頁3）.支原體:

常見而棘手。

支原體污染細胞后，能抑制細胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細胞的抗原性，引起細胞染色體改變，干擾病毒的復(fù)制，以及具有類病毒作用。在培養(yǎng)細胞初期，由于支原體對細胞的繁殖影響較小而往往被忽略。第19頁/共25頁支原體檢測方法和處理：

熒光技術(shù)檢測：支原體含有DNA，能與熒光染料Hoechest33258特異性的結(jié)合，可根據(jù)細胞表面的熒光來顯示細胞是否污染有支原體。

相差顯微鏡：相差油鏡下呈暗色微小顆粒。

電鏡觀察：SEM，TEM。

DNA分子雜交：檢出率高但復(fù)雜。

檢測完畢后，所有實驗用具均應(yīng)經(jīng)過高壓消毒處理。

第20頁/共25頁污染支原體后的處理：

抗生素處理：如加入泰樂菌素等。

共培養(yǎng)法：與巨噬細胞共培養(yǎng)。

重新克隆法：抗生素處理后，將細胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養(yǎng)液，4-5周后，重復(fù)克隆2次。

過濾法：0.22µm孔徑濾膜正壓過濾。

第21頁/共25頁4）.污染病毒的檢測

致細胞病變效應(yīng)（CPE）或集落的檢測：采用相差顯微鏡檢測

血細胞吸附試驗；

雞胚接種。第22頁/共25頁4、細胞間交叉污染為避免細胞間交叉污染，應(yīng)注意：

了解各細胞系的特征；

培養(yǎng)各細胞系的操作手續(xù)要快速；

培養(yǎng)各細胞系不用同一瓶的培養(yǎng)液和酶等；

吸過培養(yǎng)液和細胞懸液的吸管，不能放回儲存培養(yǎng)液和酶的瓶內(nèi)；

經(jīng)常檢查培養(yǎng)物特征，注意任何突然的形態(tài)學(xué)改變，通過染色體或同工酶譜分析，檢查是否有交叉污染。

第23頁/共25頁5、微生物污染的防治