熒光壽命測定的現(xiàn)代方法與應(yīng)用

熒光壽命測定的現(xiàn)代方法與應(yīng)用第一頁，共二十六頁，2022年，8月28日七彩的熒光第二頁，共二十六頁，2022年，8月28日熒光及熒光分光光度計(jì)的發(fā)展熒光壽命的基本原理熒光壽命測定的現(xiàn)代方法及數(shù)據(jù)處理測定熒光壽命的一些應(yīng)用測定熒光壽命的儀器主要內(nèi)容第三頁，共二十六頁，2022年，8月28日

Theemissionoflightfromanysubstanceiscalledluminescence.Someofthefirstscientificreportsofluminescenceappearedinthemiddleofthe18thcentury.In1845,Herschelobservedthatanotherwisecolourlesssolutionofquinine(quinineabsorbsintheUVregion)inwateremittedabluecolourundercertaincircumstances.In1852SirG.G.Stokesstudiedthesamecompoundandfoundthattheemittedlighthasalongerwavelengththanthelightabsorbed,theso-calledStokes’shift.(firstdescribedfluorescence)Inthe1920sand1930sJab?ońskiinvestigatedpolarizedlightandfluorescenceandwasabletoshowthatthetransitionmomentsinabsorptionandemissionaretwodifferentthings.TheDevelopmentofFluorescence第四頁，共二十六頁，2022年，8月28日Thefirstfluorescencemicroscopesweredevelopedbetween1911and1913byGermanphysicistsOttoHeimsttandHeinrichLehmannasaspin-offfromtheultravioletinstrument.Itwasn'tuntiltheearly1940sthatAlbertCoonsdevelopedatechniqueforlabelingantibodieswithfluorescentdyes,thusgivingbirthtothefieldofimmunofluorescence.Bytheturnofthetwenty-firstcentury,thefieldoffluorescencemicroscopywasresponsibleforarevolutionincellbiology,couplingthepoweroflivecellimagingtohighlyspecificmultiplelabelingofindividualorganellesandmacromolecularcomplexeswithsyntheticandgeneticallyencodedfluorescentprobes.

TheDevelopmentofFluorescenceMicroscopes

第五頁，共二十六頁，2022年，8月28日

Basictheoryoffluorescence

Lifetime

Thephotophysicalprocessesthatoccurfromabsorptiontoemissionareoftenshowninaso-calledJab?ońskidiagram.第六頁，共二十六頁，2022年，8月28日第七頁，共二十六頁，2022年，8月28日

熒光是分子吸收能量后其基態(tài)電子S0被激發(fā)到單線激發(fā)態(tài)S1或S2后由第一單線激發(fā)態(tài)S1回到基態(tài)S0時(shí)所發(fā)生的。

熒光壽命是指分子在單線激發(fā)態(tài)S1所平均停留的時(shí)間，或者說處于激發(fā)態(tài)S1的分子數(shù)目衰減到原來的1/e所經(jīng)歷的時(shí)間。

由于熒光現(xiàn)象多發(fā)生在納秒級(jí),這正好是分子運(yùn)動(dòng)所發(fā)生的時(shí)間尺度,因此利用熒光技術(shù)可以“看”到許多復(fù)雜的分子間作用過程,例如超分子體系中分子間的簇集、固液界面上吸附態(tài)高分子的構(gòu)象重排、蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化等。熒光壽命的概念第八頁，共二十六頁，2022年，8月28日熒光壽命測定的現(xiàn)代方法

熒光壽命測定的現(xiàn)代方法主要有以下幾種，即時(shí)間相關(guān)單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting，TCSPC)

、頻閃技術(shù)(StrobeTechniques)、相調(diào)制法(PhaseModulationMethods)

、條紋相機(jī)法(StreakCameras)和上轉(zhuǎn)換法(Upcon-versionMethods)。第九頁，共二十六頁，2022年，8月28日時(shí)間相關(guān)單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)

TCSPC是目前主要應(yīng)用的熒光壽命測定技術(shù)，1975年由PTI(PhotonTechnologyInternational)公司首先商品化。此外,EdinburghInstruments、IBH、HORIBA等公司也在生產(chǎn)基于TCSPC的時(shí)間分辨熒光光譜儀。

第十頁，共二十六頁，2022年，8月28日時(shí)間相關(guān)單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)TCSPC的工作原理如圖所示電信號(hào)電信號(hào)累積電壓信號(hào)停止工作熒光第十一頁，共二十六頁，2022年，8月28日以光子數(shù)對(duì)時(shí)間作圖可得到如圖所示的直方圖,此圖經(jīng)過平滑處理得到熒光衰減曲線。時(shí)間相關(guān)單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)第十二頁，共二十六頁，2022年，8月28日時(shí)間相關(guān)單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)

實(shí)際測定中,必須調(diào)節(jié)樣品的熒光強(qiáng)度,確保每次激發(fā)后最多只有一個(gè)熒光光子到達(dá)終止光電倍增管。否則會(huì)引起“堆積”效應(yīng)(PileupEffect)?！岸逊e”效應(yīng)是指熒光衰減曲線向短壽命一方偏移的現(xiàn)象。

為了避免堆積效應(yīng),實(shí)際測定時(shí),多道分析儀存儲(chǔ)的光子數(shù)大致只有光源脈沖數(shù)的1%。也就是說,光源100次脈沖,大約只有1次所引發(fā)的熒光被檢測。第十三頁，共二十六頁，2022年，8月28日

TCSPC法的突出優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、測定結(jié)果準(zhǔn)確、系統(tǒng)誤差小,是目前最流行的熒光壽命測定方法。但是這種方法所用儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價(jià)格昂貴、而且測定速度慢,無法滿足某些特殊體系熒光壽命測定的要求。時(shí)間相關(guān)單光子記數(shù)法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)第十四頁，共二十六頁，2022年，8月28日

頻閃技術(shù)(StrobeTechniques)

頻閃技術(shù)也叫脈沖取樣技術(shù)(PulseSam-plingTechniques)，1987年P(guān)TI公司將納秒級(jí)頻率熒光壽命測定儀商品化。最近PTI公司推出了新一代頻閃分時(shí)光譜儀。脈沖取樣法測定熒光壽命工作原理如下圖所示。(a)工作原理圖(b)檢測時(shí)間門與熒光衰減關(guān)系示意圖第十五頁，共二十六頁，2022年，8月28日頻閃技術(shù)(StrobeTechniques)的優(yōu)缺點(diǎn)：新一代頻閃分時(shí)光譜儀有著TCSPC的準(zhǔn)確性，比相調(diào)制測定速度更快，操作也很方便，儀器價(jià)格也大大降低。不過脈沖法得到的熒光衰減曲線包含噪音的水平尚無法知道，在數(shù)據(jù)分析時(shí)應(yīng)當(dāng)有所估計(jì)。頻閃技術(shù)(StrobeTechniques)第十六頁，共二十六頁，2022年，8月28日

熒光壽命測定中的數(shù)據(jù)處理

1、熒光壽命及其含義

假定一個(gè)無限窄的脈沖光(δ函數(shù))激發(fā)n0

個(gè)熒光分子到其激發(fā)態(tài),處于激發(fā)態(tài)的分子將通過輻射或非輻射躍遷返回基態(tài)，兩種衰減躍遷速率分別為Γ和knr

，可得到激發(fā)態(tài)物種的單指數(shù)衰減方程。n(t)=n0exp(-t/τ)(1)式中τ為熒光壽命。由于熒光強(qiáng)度正比于衰減的激發(fā)態(tài)分子數(shù),因此可將上式改寫為:I(t)=I0exp(-t/τ)(2)其中I0

是時(shí)間為零時(shí)的熒光強(qiáng)度。于是,熒光壽命定義為衰減總速率的倒數(shù):τ=(Γ+knr)-1(3)也就是說熒光強(qiáng)度衰減到初始強(qiáng)度的1/e時(shí)所需要的時(shí)間就是該熒光物種在測定條件下的熒光壽命。實(shí)際上用熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)對(duì)時(shí)間作圖,直線斜率即為熒光壽命倒數(shù)的負(fù)值。熒光壽命也可以理解為熒光物種在激發(fā)態(tài)S1的統(tǒng)計(jì)平均停留時(shí)間。第十七頁，共二十六頁，2022年，8月28日

3、卷積積分

實(shí)際測定得到的熒光衰減曲線N(tk

)是儀器響應(yīng)函數(shù)L(

tk

)和真實(shí)熒光衰減函數(shù)I(t)的卷積。即N(tk)=L(tk)Θ

I(t)

第三條曲線是實(shí)測熒光強(qiáng)度衰減曲線的擬合函數(shù)Nc(tk)。熒光壽命測定中的數(shù)據(jù)處理時(shí)間/ns光子數(shù)上圖

給出用TCSPC法測得的閃爍體(Scintil-lator)2,5-二苯基-1,3,4-二唑(2,5-diphenyl-1,3,4-oxadiazole,PPD)的熒光強(qiáng)度衰減曲線及其擬合。第十八頁，共二十六頁，2022年，8月28日

4、數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析的目的在于,通過擬合實(shí)驗(yàn)所得熒光衰減曲線,建立一種最能揭示熒光衰減本質(zhì)、描述衰減過程的理論模型,從而對(duì)所研究體系作出深刻的理解。隨著時(shí)間分辨熒光技術(shù)日益發(fā)展,人們相繼提出了多種熒光衰減數(shù)據(jù)分析方法。例如:非線性最小二乘法、矩法、Laplace變換法、最大熵法以及正弦變換法等。熒光壽命測定中的數(shù)據(jù)處理

利用解卷積的辦法可得到脈沖響應(yīng)函數(shù)I(t),進(jìn)而求得描述樣品熒光衰減本質(zhì)的熒光壽命(τ)等有關(guān)參量。

第十九頁，共二十六頁，2022年，8月28日

熒光壽命測定的應(yīng)用

熒光技術(shù)分為靜態(tài)熒光技術(shù)和時(shí)間分辨熒光技術(shù)。靜態(tài)熒光技術(shù)固然重要,但是靜態(tài)技術(shù)給出的只是平均化結(jié)果,平均化過程丟掉了有關(guān)分子運(yùn)動(dòng)的動(dòng)態(tài)信息。所以時(shí)間分辨熒光技術(shù)較為常用.時(shí)間分辨熒光技術(shù)的應(yīng)用:1、可以揭示熒光猝滅是自由擴(kuò)散控制還是特異性結(jié)合控制。2、研究供體和受體間的能量轉(zhuǎn)移時(shí),不僅可以得到能量轉(zhuǎn)移效率,而且可以揭示受體在供體周圍的分布形式。3、揭示熒光猝滅是自由擴(kuò)散控制還是特異性結(jié)合控制。4、研究許多分子間或分子內(nèi)的弱相互作用信息,特別是動(dòng)態(tài)信息。5、對(duì)于表面活性劑類兩性分子在溶液或界面上的組裝、納米材料在儲(chǔ)存過程中的相互聚集、蛋白質(zhì)或其它大分子在固液界面吸附過程中的構(gòu)象調(diào)整、大分子與大分子,大分子與小分子,大分子與金屬離子等相互作用所引起的大分子構(gòu)象變化以及這種變化發(fā)生的程度和部位位等重要問題可能通過時(shí)間分辨熒光技術(shù)進(jìn)行深入研究。第二十頁，共二十六頁，2022年