金屬離子螯合層析專家講座

目錄一、親和層析二、金屬離子親和層析三、金屬離子親和層析應(yīng)用四、金屬離子親和層析局限金屬離子螯合層析專家講座第1頁一、親和層析

親和層析是利用配基、配體之間專一可逆結(jié)合性質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)分離方法,所以其專一性、選擇性是極高。金屬離子螯合層析專家講座第2頁金屬離子螯合層析專家講座第3頁金屬離子螯合層析專家講座第4頁親和層析過程1、尋找可與底物專一可逆結(jié)合配基2、將配基經(jīng)過共價鍵偶聯(lián)到基質(zhì)，并要求偶聯(lián)后配基與配體親和力不變3、配基與配體吸附并與雜質(zhì)分離，將雜質(zhì)洗出4、洗脫目標(biāo)物金屬離子螯合層析專家講座第5頁親和層析分類1、生物親和層析2、免疫親和層析3、金屬離子親和層析4、有機(jī)染料親和層析5、擬生物親和層析金屬離子螯合層析專家講座第6頁二、金屬離子親和層析（IMAC）金屬離子親和層析是建立在蛋白質(zhì)表面暴露一些氨基酸殘基與固定化金屬離子親和力不一樣來進(jìn)行蛋白質(zhì)分離純化一項技術(shù)金屬離子：鋅、銅、鐵等氨基酸殘基：組氨酸咪唑基、半胱氨酸巰基、色氨酸吲哚基金屬離子螯合層析專家講座第7頁金屬離子親和層析優(yōu)點1、配基簡單，吸附容量大2、價格廉價，投資低3、通用性強(qiáng)4、分離條件溫和5、金屬離子配基含有很好穩(wěn)定性，且層析柱可長久連續(xù)使用，易于再生。金屬離子螯合層析專家講座第8頁三、金屬離子

親和層析應(yīng)用純泰Ni-NTA金屬螯合His蛋白純化介質(zhì)填料（His鎳柱）金屬離子螯合層析專家講座第9頁（一）、用于分離純化變性蛋白金屬離子親和層析復(fù)性中，蛋白質(zhì)能可逆吸附在固相介質(zhì)上，可防止伸展多肽分子之間形成聚集體。在高濃度變性劑存在情況下，組氨酸尾依舊含有吸附在金屬離子親和層析介質(zhì)上能力，所以可在IMAC介質(zhì)上同時實現(xiàn)復(fù)性與純化。蛋白質(zhì)吸附在IMAC介質(zhì)上后，先逐步降低變性劑濃度，使蛋白質(zhì)折疊，然后提升咪唑濃度把折疊后蛋白質(zhì)洗脫出來。對于TNF蛋白，使用IMAC可取得90％復(fù)性收率。金屬離子螯合層析專家講座第10頁（二）、用于蛋白質(zhì)分析判定1、1）科學(xué)家經(jīng)過金屬離子親和層析對糖基化造成α一胰凝乳蛋白酶結(jié)構(gòu)改變進(jìn)行了研究，證實糖基化作用產(chǎn)生兩個截然不一樣蛋白質(zhì)，他們對金屬離子親和性完全相反。2）蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化是生命體代謝調(diào)控主要機(jī)制，已發(fā)覺IMAC能判定磷酸化蛋白，其中Fe3-IMAC已被用來選擇性純化和濃縮磷酸化蛋白和多肽。金屬離子螯合層析專家講座第11頁2、IMAC與重組技術(shù)相結(jié)合能夠使帶六聚組氨酸蛋白質(zhì)固定在基質(zhì)上，從而為研究蛋白質(zhì)相互作用開辟了新路徑。

例：Celia等用Ni2+負(fù)載金屬螯合脂質(zhì)定向膜捕捉組氨酸MHC分子，再經(jīng)過表面等離子體共振技術(shù)考查它們對T細(xì)胞受體結(jié)合。金屬離子螯合層析專家講座第12頁（三）、用于提取目標(biāo)蛋白

在基因重組過程中加入聚組氨酸六肽作為親和標(biāo)識物來分離純化目標(biāo)蛋白金屬離子螯合層析專家講座第13頁（四）、用于核苷酸純化IMAC也能夠應(yīng)用于核苷酸純化，比如用組氨酸標(biāo)識PCR產(chǎn)品，單鏈、雙鏈核苷酸及嘌呤等

例：從質(zhì)粒DNA產(chǎn)物中除去被損壞染色體DNA金屬離子螯合層析專家講座第14頁（五）、其它應(yīng)用過渡金屬親和吸附蛋白特征也成功應(yīng)用在生物傳感器和蛋白質(zhì)芯片領(lǐng)域。例：Zhu等提到了將帶有6個組氨酸蛋白質(zhì)固定于鍍鎳玻璃板上，得到了比常規(guī)醛處理表面更高質(zhì)量蛋白質(zhì)芯片。金屬離子螯合層析專家講座第15頁四、金屬離子親和層析局限1、對蛋白質(zhì)特異性差，會發(fā)生非特異性吸附2、載體上金屬離子在操作過程中有可能脫落而混入產(chǎn)品