細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用及前景PPT講述

細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用及前景PPT講述第一頁，共二十三頁，2022年，8月28日概述

細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)以及免疫學(xué)是現(xiàn)代三大前沿生物科學(xué)，發(fā)展異常迅速。細胞培養(yǎng)是細胞生物學(xué)研究中最常用的方法之一。由于在體外培養(yǎng)中和機體內(nèi)，細胞行為的基本規(guī)律是一樣的，因此許多研究可以在體外進行。更重要的是，在培養(yǎng)條件下，人們可以有目的的、有選擇地控制細胞生長的環(huán)境，因此可以研究在某些特殊條件下的細胞生物學(xué)行為。本講主要目的是介紹動物細胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用。第二頁，共二十三頁，2022年，8月28日一分類1.組織培養(yǎng)(TissueCulture)指的是從體內(nèi)取出組織摹擬體內(nèi)生理環(huán)境,在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下,使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。2.細胞培養(yǎng)(CellCulture):培養(yǎng)物是單個細胞和細胞群。3.器官培養(yǎng)（OrganCulture）：培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官,使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法.組織培養(yǎng)的分類和基本概念第三頁，共二十三頁，2022年，8月28日歷史

1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng),材料是雞胚神經(jīng)板,采用生理鹽水為培養(yǎng)液,并首次采用組織培養(yǎng)這個術(shù)語。1907年Harrison和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法,用于研究離體動物細胞的培養(yǎng)。第四頁，共二十三頁，2022年，8月28日體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展大致可分三個時期：50年代之前是細胞培養(yǎng)在多個領(lǐng)域發(fā)展期；50年代是細胞培養(yǎng)迅猛發(fā)展期，多種培養(yǎng)技術(shù)相繼建立；50年代后是體外培養(yǎng)技術(shù)與生命科學(xué)其他技術(shù)結(jié)合發(fā)展的新時期，誕生了多種培養(yǎng)的應(yīng)用技術(shù)。第五頁，共二十三頁，2022年，8月28日

由于組織培養(yǎng)在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，如抗病毒疫苗的生產(chǎn)等，現(xiàn)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一門精細技術(shù)。許多細胞株、細胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細胞系，如Hela細胞系（Gey，1952），可用來進行一系列研究，更加促進了組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。第六頁，共二十三頁，2022年，8月28日1)細胞內(nèi)部的種種活動,如DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、能量代謝;2)細胞內(nèi)部的流動,如RNA從細胞核向細胞質(zhì)方向運轉(zhuǎn),激素受體復(fù)合物的易位等;3)生態(tài)學(xué),如營養(yǎng)、感染、病毒或化學(xué)誘變、藥物作用;4)細胞與細胞之間的相互作用,如胚胎誘導(dǎo)、細胞群體的動力學(xué)等.組織培養(yǎng)中感興趣的研究領(lǐng)域第七頁，共二十三頁，2022年，8月28日1）理化環(huán)境可以調(diào)控2）細胞經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)形成細胞系，其特征基本相同，對外界影響因素的反應(yīng)也較為一致。3）培養(yǎng)物可直接暴露在預(yù)測的試劑中，預(yù)測樣品用量少，并可直接觀測反應(yīng)。4）可通過繁殖擴增，提供大量均勻的細胞備用，供比較不同因素或同一因素不同劑量對同一細胞株的作用。5）可以人工篩選具有一定特征變異的細胞株或細胞融合，有利于基因功能的研究。6）組織培養(yǎng)結(jié)合縮時電影技術(shù)，可以直接觀察細胞的活動和對外界作用的反應(yīng)。細胞培養(yǎng)應(yīng)用的優(yōu)點第八頁，共二十三頁，2022年，8月28日體內(nèi)外細胞的差異當(dāng)人工條件和體內(nèi)實際情況不完全相同時,細胞在體外培養(yǎng)后,一旦失去神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和細胞間相互影響,生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中,發(fā)生變化則是必然.細胞最多見的表現(xiàn)是:返祖（Atavism）現(xiàn)象——失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)、分化減弱或不顯、細胞趨單一化、不死性、惡性狀。第九頁，共二十三頁，2022年，8月28日培養(yǎng)細胞的分化不適應(yīng)（Deadaption）——細胞在體內(nèi)時所擁有的分化特性減弱或不顯。例如肝細胞在體外喪失了產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶的特性.脫分化和去分化（Dedifferentiation）——由于基因變異而使細胞失去分化能力。如肝細胞失掉產(chǎn)生精氨酸酶及氨基酸轉(zhuǎn)移酶的特性后,儲存肝糖元的能力喪失,并很難再現(xiàn).所以說,不適應(yīng)和脫分化兩個概念不同.不適應(yīng)是因為生存條件改變而使分化發(fā)生抑制;從分子水平考慮,脫分化很可能是基因變異所致.第十頁，共二十三頁，2022年，8月28日培養(yǎng)細胞的形態(tài)

1.貼附型：

1）成纖維細胞：心肌細胞，血管內(nèi)皮細胞等2）上皮型細胞：消化管外皮細胞，肝臟上皮細胞等3）游走型細胞：神經(jīng)膠質(zhì)細胞4）多形型細胞：神經(jīng)組織細胞2.懸浮型：如癌細胞和血液白細胞第十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日組織培養(yǎng)細胞的生長和增殖

1.原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）階段：原代培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng)，嚴格的說即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，但實際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)

，隨不同的組織時間長短不一，一般為1-4w。2.傳代培養(yǎng)（Subculture）階段：或稱繼代培養(yǎng)。也就是細胞系（Cellline）階段。細胞增殖旺盛，一般細胞可傳代10-50代）。二倍體細胞系（Diploidcellline）：即細胞保持二倍體核型。

3.衰退階段：細胞增殖減慢或不增殖，甚至最后凋亡。但少數(shù)情況下，在這三期的任何一點，由于某種因素影響，細胞發(fā)生自發(fā)性轉(zhuǎn)化。（物理化學(xué)病毒等因素〕第十二頁，共二十三頁，2022年，8月28日1）潛伏期（Latentphase）：細胞從接種到貼壁生長繁殖的一段時間。2倍體細胞該期時間長（24-96h），連續(xù)細胞系時間短（10-30min）。一代周期內(nèi)細胞生長的三個時期第十三頁，共二十三頁，2022年，8月28日2)指數(shù)生長期（Logarthmicgrowthphase）：細胞增殖最旺盛時期，一般用細胞分裂指數(shù)（MitoticindexMI）表示：即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)介于0.1-0.5%，且受細胞種類培養(yǎng)液成分、pH、溫度等影響。指數(shù)生長期是細胞活力最好的時期，在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)生長期持續(xù)3-5d后，隨細胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，細胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制（Contactinhibition）。而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細胞標(biāo)志之一。但癌細胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（Densityinhibition）。第十四頁，共二十三頁，2022年，8月28日3）停滯期（Stagnatephase）：即細胞數(shù)量達到飽和密度后，細胞與營養(yǎng)液的交換面積減少,代謝產(chǎn)物積累,PH下降細胞停止增殖，進入停滯期。在此時應(yīng)及時進行換液傳代，否則因細胞中毒受損，大量細胞出現(xiàn)死亡，至少再傳1-2代后，細胞才能恢復(fù)。第十五頁，共二十三頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個問題

1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物:一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細胞生長,不能盲目增加每單位體積的細胞濃度.2）PH:7.2-7.4>7.6或<6.0細胞損傷、退變或死亡3）培養(yǎng)瓶內(nèi)的空間:一般培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10.4）容積、深度、表面面積:5）去除死細胞:6)溫度控制：動物細胞培養(yǎng)對溫度波動較為敏感。溫度低于36.5C，細胞生長緩慢，高于38C，細胞失去活力。第十六頁，共二十三頁，2022年，8月28日1.據(jù)CCTV4報道，13年10月中國臺灣地區(qū)臺北榮民總醫(yī)院在干細胞研究方面有重大突破，研究人員利用干細胞已分化出網(wǎng)膜和心肌細胞，目前該研究正處于臨床實驗階段，未來有望生產(chǎn)干細胞藥品有效治療失明、心臟病等。細胞培養(yǎng)的應(yīng)用第十七頁，共二十三頁，2022年，8月28日2.一口好牙不但能給出一個美麗的笑容，還是健康的標(biāo)志。但由于疾病或意外事故，我們可能失去牙齒。鑲顆金牙吧，有損整體美觀?，F(xiàn)在好了，科學(xué)家成功利用人的尿液衍生的細胞誘導(dǎo)形成干細胞獲得再生牙齒雛形。7月30日，這項研究成果刊登在學(xué)術(shù)期刊《細胞再生》上，同時也引發(fā)國際社會廣泛討論。

第十八頁，共二十三頁，2022年，8月28日

3.中化新網(wǎng)訊

科學(xué)家13年8月表示，他們已利用干細胞，培養(yǎng)出能在培養(yǎng)皿上自發(fā)收縮的人類心臟組織，意味在尋求制造移植器官方面獲致進展。

美國賓州匹茲堡大學(xué)研究團隊利用取自人類皮膚細胞得出的誘導(dǎo)性多功能干細胞（iPS），制作出名為MCPs的心臟前驅(qū)細胞。第十九頁，共二十三頁，2022年，8月28日4.2013年7月，利用誘導(dǎo)性多功能干細胞（iPSCs），日本科學(xué)家首次成功培育出具有功能的人類肝臟。這項發(fā)表在《自然》上的研究結(jié)果轟動了整個科學(xué)界。當(dāng)前急需器官移植的患者眾多，器官的捐獻率卻常年處于低位。iPS細胞培養(yǎng)的器官有望成為移植臟器的新來源，減少患者對于捐贈器官的依賴。研究小組利用人類誘導(dǎo)性多功能干細胞（iPSCs），在體外培育出簡單的人類肝臟，移植到小鼠體內(nèi)后，這些肝臟成功血管化并正常行使功能。這是科學(xué)界首次用誘導(dǎo)性多功能干細胞（iPSCs）培育出具有功能的人類器官。第二十頁，共二十三頁，2022年，8月28日5.CLS生物治療的原理是利用自身免疫殺滅腫瘤細胞。2011年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎獲得者斯坦曼博士在1973年發(fā)現(xiàn)了激活免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細胞DC細胞。在20世紀80年代，科學(xué)家又培養(yǎng)出了具有腫瘤強殺傷效應(yīng)的CIK細胞。這兩種細胞是腫瘤生物治療的關(guān)鍵。CLS生物治療通過體外實驗萬倍擴增這兩類細胞，再輸回患者體內(nèi)實現(xiàn)腫瘤大面積殺傷治療。CLS多細胞生物免疫治瘤-有效延長生命長度3-5年,保證提升生物質(zhì)量,實現(xiàn)瘤自我康復(fù).第二十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日細胞培養(yǎng)前景胚胎干細胞是人體發(fā)展的初始階段，胚胎干細胞被認為是治療修復(fù)人體的最好材料。美國奧巴馬總統(tǒng)上任后的第一個科技政策就是支持鼓勵胚胎干細胞研究，并認為干細胞研究會影響