流式細(xì)胞應(yīng)用

流式細(xì)胞應(yīng)用 -細(xì)胞存活之檢測傳統(tǒng)檢測細(xì)胞存活方法多以鏡檢得知大概情形 ，無法有效直接反應(yīng)出細(xì)胞死活真實狀況 ，尤其是細(xì)菌死活之辨識常因細(xì)菌培養(yǎng)太過耗時而失去時效性 。而那些生長緩慢的細(xì)菌或是無法培養(yǎng)的活菌等，若使用傳統(tǒng)方法，解析能力差，無法獲得立即細(xì)胞資訊。流式細(xì)胞分析技術(shù)的發(fā)展提供一快速檢測且可靠的方法定量真核細(xì)胞及原核細(xì)胞懸浮液中存活的細(xì)胞數(shù)目 1-3,7,8。大家一般所熟悉的是使用 PI來偵測細(xì)胞存活或死亡，此篇文章則是介紹若是再加入另一個螢光染劑，利用雙參數(shù)可以多檢測出受傷的細(xì)胞。實驗原理BDCellViabilityKit 使用立即可用之 thiozoleorange(TO) 及propidiumiodide(PI) 二種螢光染劑組合，應(yīng)用流式細(xì)胞儀即可分辨活細(xì)胞、死細(xì)胞及受傷的細(xì)胞；此法可取代傳統(tǒng)人工鏡檢方法4-6?；罴?xì)胞的細(xì)胞膜完整，像 PI等染劑是無法進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)的。 TO則具有浸透性，雖然會進(jìn)入所有的細(xì)胞體內(nèi)，但是活細(xì)胞與死亡細(xì)胞呈現(xiàn)出的螢光強度則有程度上差別；所以，即使那些被細(xì)胞碎片黏著的活細(xì)胞也可輕易地被識出。舉凡周邊血單核細(xì)胞 (PBMC)、哺乳動物細(xì)胞株、細(xì)菌、及酵母菌等均適用此應(yīng)用。此試劑組包含了：1.Thiozoleorange(TO),42MinDMSO–會進(jìn)入所有的細(xì)胞內(nèi)2.Propidiumiodide(PI),4.3mMinwater–僅會進(jìn)入死細(xì)胞使其呈色3.計數(shù)用螢光微球inbufferwith0.1%NaN3–絕對計數(shù)之用不含於此試劑組但仍必需之其他材料如下述：Stainingbuffer–PBSwith0.2%Pluronic?F-68(BASFCorporation,MountOlive,NJ,Cat.#51554728) ，經(jīng)0.22 m濾過使用。F-68為非溶解性界面活性劑，常使用於細(xì)胞培養(yǎng)液中，可降低樣品的背景值。2. 1mMEDTA(Sigma,St.Louis,MO,Cat.#ED2SS) ，經(jīng)0.22 m濾過使用。EDTA也可降低背景值，但是更重要的是 EDTA可以打開格蘭氏陰性菌之 LPS，協(xié)助染劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。陽BDBiosciences,COE性菌亦適用。註：細(xì)菌染色時，可使用 0.01%Tween?-20(Sigma,Cat.#P-1379) 代替F-68，此stainingbuffer也必須經(jīng)過 0.22 m濾過。實驗方法螢光染劑用量：TO及PI染劑用量，依檢測之細(xì)胞類型不同而異。細(xì)胞濃度：1. 以PBMC為例，使用 stainingbuffer 稀釋細(xì)胞，製備成 5X105–107cells/mL。培養(yǎng)的細(xì)菌，最佳濃度為5X105–9X106bacterial/mL。其他類型細(xì)胞，例如製藥用取樣、食品或環(huán)境取樣之檢體，製備成之濃度以流式細(xì)胞儀可偵測到至少 100cells/mL 為主，再反推應(yīng)製備之起始濃度為何。細(xì)菌及酵母菌：每種染劑各添加5L於500L細(xì)胞懸浮液中。振盪後，於室溫下作用5分鐘即可上機。染劑最終濃度：TO=420nM，PI=43M。哺乳動物細(xì)胞：取4LTO及2LPI加入2mL細(xì)胞懸浮液中。振盪後，於室溫下作用5分鐘即可上機。染劑最終濃度：TO=105nM，PI=11M。公牛精液：每種染劑各取2L加入2mL細(xì)胞懸浮液中。振盪後，於室溫下作用5分鐘即可上機。染劑最終濃度： TO=53nM，PI=11 M。注意：當(dāng)併用計數(shù)微球時，微球須回溫使用。取微球前，必須先振盪 30秒後，再使用反向取樣法(reversepipetting) 取50 L於每個樣品管內(nèi)。須振盪後再上機分析。BDBiosciences,COE資料收取與分析1. 閾值參數(shù)設(shè)定哺乳動物細(xì)胞分析 –設(shè)於FSC微生物細(xì)胞分析 –設(shè)於SSC參數(shù)之放大模式一般動物細(xì)胞：FSC–LIN,SSC–LIN,FLs–LOG微生物：所有參數(shù)均以 LOG放大3. 使用SSCvsFL2 圈選欲分析之細(xì)胞群並作設(shè)門 (Gating)4-6。利用螢光強度區(qū)別活細(xì)胞與死亡細(xì)胞：使用FL1表示TO，F(xiàn)L3表示PI。(TO螢光強度主要呈現(xiàn)於FL1及FL2，PI主要由FL3呈現(xiàn))若使用絕對計數(shù)用螢光微球，則細(xì)胞濃度計算方程式為：細(xì)胞區(qū)域之個數(shù)預(yù)知之螢光微球總數(shù)(包裝上顯示)微球區(qū)域之個數(shù)×樣品取樣體積(L)×稀釋倍數(shù)=細(xì)胞濃度使用低流速(LO)上機。7.每秒鐘通過雷射區(qū)的流速1000events。8.若使用螢光微球，則螢光微球至少要收取1000顆。分析結(jié)果：圖一顯示 E.coli細(xì)胞存活結(jié)果，R4為活細(xì)胞區(qū)域，R5為受傷細(xì)胞， R6則為死亡細(xì)胞。此實驗使用LE.coli樣品，加入5LTO及5LPI，另也加入50L微球。圖中未顯示微球。BDBiosciences,COE圖二顯示 PBMC細(xì)胞存活結(jié)果， R5為活細(xì)胞區(qū)域，R3為死亡細(xì)胞，R4為微球區(qū)域。此實驗使用2mLPBMC 樣品，加入 4LTO及2LPI，另也加入50 L微球。圖三顯示 Raji細(xì)胞存活結(jié)果，R5為活細(xì)胞區(qū)域 ，R3為死亡細(xì)胞， R4為微球區(qū)域。此實驗使用 2mLPBMC樣品，加入4LTO及2LPI，另也加入 50 L微球。圖四顯示解凍後公牛精液細(xì)胞存活結(jié)果， R3為活細(xì)胞區(qū)域，R2為死亡細(xì)胞，二群中間為受傷細(xì)胞。實驗使用2mL解凍後公牛精液樣品(20L解凍後公牛精液加入2mLstainingbuffer)，加入2LTO及2LPI。產(chǎn)品介紹：產(chǎn)品 編號 產(chǎn) 品 名 稱 包 裝349483 BDCellViabilityKit 100tests349480 BDCellViabilityKitwithBDLiquidCountingBeads 100testsBDBiosciences,COE適用範(fàn)圍：1-4快速檢測計數(shù)細(xì)菌或其他微生物之存活率消毒劑殺菌效力之鑑定

56發(fā)酵中酵母菌存活率之檢測計算細(xì)胞培養(yǎng)之存活細(xì)胞濃度流式細(xì)胞分析前之細(xì)胞濃度與存活率之檢測哺乳動物細(xì)胞或是微生物細(xì)胞生物反應(yīng)器之細(xì)胞計數(shù)與存活率檢測不孕癥研究之精子存活力檢測

7,8樣品製備時產(chǎn)生過多細(xì)胞碎片之細(xì)胞存活率檢測參考文獻(xiàn)：Nebe-von-CaronG,StephensPJ,BadleyAR.Bacterialdetectionanddifferentiationbycytometryandfluorescentprobes.ProcRoyalMicrobialSociety.1999;34:321-327Nebe-von-CaronG,StephensPJ,HewittCj,PowellJR,BadleyRA.Analysisofbacterialfunctionbymulti-colorfluorescenceflowcytometryandsinglecellsorting.JMicrobialMeth.2000;42:97-114.DaveyHM,KellDB.Flowcytometryandcellsortingofheterogeneousmicrobialpopulations:theimportanceofsingle-cellanalyses.MicrobialRev.1996;60:641-696.AlsharifR,GodferyW.Bacterialdetectionandlive/deaddiscriminationbyflowcytometry.MicrobialCytometryApplicationNote.BDBiosciences,ImmunocytometrySystems;SanJose,CA.2002.AlsharifR,TapiaM,GodfreyW,WanalundJ,NagarM.Bacterialdisinfectantefficacyusingflowcytometry.MicrobialCytometryApplicationNote.BDBiosciences,ImmunocytometrySystems;SanJose,CA.2002.ThorntonR,GodfreyW,GilmourL,AlsharifR.Evaluationofyeastviabilityandconcentrationduringwinefermentationusingflowcytometry.MicrobialCytometryApplicationNote.BDBiosciencesImmunocytometrySystems;SanJose,CA.2002.GrahamJK.Assessmentofspermquality:aflowcytometricapproach.AnimReprodSci.2001;68: