大腸桿菌耐藥株的體外誘導(dǎo)及其acrA與marA基因分析

大腸桿菌耐藥株的體外誘導(dǎo)及其acrA和marA基因分析張海旺1鄧旭明2*張煜1蘇杰1胡仲明3

（1.河北北方學(xué)院，河北張家口，075131；2.中國人民解放軍軍需大學(xué)，吉林長春；130062；3.軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春；130062）摘要：目的檢測大腸桿菌在某些抗菌素的環(huán)境壓力下耐藥性的變化及其與acrA和marA基因突變的關(guān)系。方法分別用四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星對大腸桿菌質(zhì)控株ATCC25922進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，測定誘導(dǎo)前后多種抗菌藥的MIC的變化；對各菌株的acrA和marA基因進(jìn)行克隆和測序。結(jié)果四環(huán)素誘導(dǎo)株產(chǎn)生多重耐藥，氯霉素和環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)引起單藥耐藥；四環(huán)素誘導(dǎo)株、氯霉素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株的acrA和marA基因序列均與ATCC25922的一致。結(jié)論四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)培養(yǎng)并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突變，誘導(dǎo)引起的大腸桿菌耐藥性變化是由于其acrA和marA基因突變以外的其他原因所致。關(guān)鍵詞：大腸桿菌多重耐藥外輸泵acrAmarA由于抗菌藥物的廣泛、持續(xù)和不當(dāng)使用，各種病原菌對抗菌藥物的耐藥性日趨嚴(yán)重?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞膜上的外輸泵（effluxpump）的表達(dá)水平提高，能主動(dòng)將擴(kuò)散入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的藥物或其他底物泵出菌體外，從而使細(xì)菌獲得非特異性的耐藥性。大腸桿菌是畜禽的重要致病菌，是發(fā)現(xiàn)外輸泵最多的細(xì)菌，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了約30種外輸泵。一般認(rèn)為AcrAB_TolC是大腸桿菌主要的外輸泵［1］。它包括藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB、周質(zhì)融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC［2］。MarA是一個(gè)正調(diào)控蛋白，可增強(qiáng)acrAB和tolC的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)用四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星通過人工體外誘導(dǎo)大腸桿菌使之產(chǎn)生耐藥性，對AcrA和MarA的基因acrA和marA進(jìn)行測序分析，檢測耐藥性產(chǎn)生與acrA和marA突變的關(guān)系。1材料和方法1.1材料菌株：大腸桿菌質(zhì)控株ATCC25922,購自吉林省衛(wèi)生監(jiān)督檢測中心?？咕帲侯^孢唾肟、青霉素鉀等，均為標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌?，中國藥品生物制品檢定所出品；鹽酸環(huán)丙沙星，對照品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所出品。染色試劑：結(jié)晶紫酒精飽和溶液、草酸銨溶液、革蘭氏碘溶液、石碳酸復(fù)紅溶液等按《藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊》［3］進(jìn)行配制。載體與質(zhì)粒：克隆載體為pGEM_T，Promega公司產(chǎn)品。酶與試劑：T4DNA連接酶、ExTaqTMDNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、溶菌酶、蛋白酶K均為TaKaRa公司產(chǎn)品。其他試劑：乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）、焦碳酸二乙酯（DEPC），Sigma公司產(chǎn)品；dNTP、5—漠_4—氯_3—吲哚半乳糖苷（X_gal）、異丙基_B_D_硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp）、瓊脂糖、羥基甲基氨基甲烷（Tris）等均為TaKaRa公司產(chǎn)品；飽和酚、氯仿、異丙醇'CaJ葡萄糖、甲基紅等，均為國產(chǎn)分析純試劑；DNA片段凝膠回收試劑盒（AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0），TaKaRa公司產(chǎn)品；國家自然基金資助項(xiàng)目，No30270999作者介紹：張海旺，生于1956年，博士，教授。研究方向：耐藥機(jī)理。*通訊作者E-mail：zhw5148@分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物：DNAMarkerDL2,000、入』indIIIdigestDNAMarker，均為TaKaRa公司產(chǎn)品。引物：根據(jù)GenBank中acrA、marA基因序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物：acrA的上游引物（PACR_F）序列為5'_ATGAACAAAAACAGAGGGTTTACGC（_3'；下游引物（PACR_R）5'_TTAAGACTTGGACTGTTCAGGCTG_3',marA的上游引物（PMAR_F）序列為5'_ATGACGATGTCCAGACGCAATAC_3',下游引物（PMAR_R）5'_CTAGCTGTTGTAATGATTTAATG（_3'。上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。儀器：生物顯微鏡，OLYMPUS產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀，TC_25/H型，杭州DAHETHERMO_MAGNETICSCO.LTD產(chǎn)品；電泳儀，DYY_6B型，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；空氣浴振蕩器，HZQ_C，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；高速臺式冷凍離心機(jī)，TGL_16M，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)等。1.2.方法1.2.1菌株鑒定對購進(jìn)的菌株作生化和形態(tài)鑒定，以確保菌株的可靠性：用營養(yǎng)肉湯作復(fù)蘇培養(yǎng)，再將菌液接種于瓊脂平板37oC培養(yǎng)至長出菌落；取上一步得到的單菌落進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）、靛基質(zhì)試驗(yàn)、M.R試驗(yàn)、V—P試驗(yàn)鑒定及革蘭氏染色的光鏡觀察。鑒定確認(rèn)為ATCC25922的菌株作后續(xù)實(shí)驗(yàn)之用。1.2.2MIC測定按照NCCLS（NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards）規(guī)定的方法配制包括誘導(dǎo)劑（氯霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星）在內(nèi)的各種受試抗菌藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液；用2倍連續(xù)稀釋法配制各種含抗菌藥的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，抗菌藥的首選濃度范圍為0.125?4.0rg/ml培養(yǎng)基（據(jù)細(xì)菌生長情況再作升或降的調(diào)整）。在1ml培養(yǎng)基中接種100ul菌液（約為105CFU）；37oC培養(yǎng)24h，確定MIC。1.2.3誘導(dǎo)分別在三種含1/2XMIC誘導(dǎo)劑的麥康凱培養(yǎng)基接種適量培養(yǎng)物（約105CFU），37oC培養(yǎng)24h，挑選生長良好的菌落，接種于1XMIC誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基37oC培養(yǎng)24h，以此類推，逐漸提高培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑的濃度直到誘導(dǎo)前MIC的128倍（據(jù)細(xì)菌生長情況誘導(dǎo)劑濃度提高幅度可在1?2倍于原濃度的范圍適當(dāng)調(diào)整，也可當(dāng)細(xì)菌生長不良時(shí)在同一個(gè)濃度重復(fù)傳代培養(yǎng)）。1.2.4耐藥譜的確定上一步最后獲得的誘導(dǎo)劑濃度達(dá)到128XMIC的耐藥株，作4次無誘導(dǎo)劑傳代培養(yǎng)后，再分別測定三個(gè)誘導(dǎo)株對所有受試抗菌藥的MIC，以確定三個(gè)誘導(dǎo)株的多重耐藥譜。1.2.5受試菌株acrA>marA基因序列的檢測據(jù)上一步耐藥譜檢測結(jié)果，氯霉素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株的耐藥譜相近，而四環(huán)素誘導(dǎo)株的耐藥譜與之差異較大，故選擇四環(huán)素誘導(dǎo)株（名為SEMR）、環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株（名為SEICI）和質(zhì)控株（ATCC25922）作acrA.marA基因序列的檢測。目的基因（acrA>marA）的獲取DNA提取：按盧圣棟等［4］的方法提取SEMR、SEICI和ATCC25922的基因組DNA。acrA、marA基因的PCR擴(kuò)增：以大腸桿菌染色體DNA為模板，用引物PACR_F和PACR_R擴(kuò)增acrA（全長1194bp），用PMAR_F和PMAR_R擴(kuò)增marA（全長390bp）。取5glPCR產(chǎn)物在0.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳觀察PCR結(jié)果。PCR產(chǎn)物的回收：用DNA片段凝膠回收試劑盒回收acrA和marA基因的PCR產(chǎn)物，方法按試劑盒使說明書進(jìn)行。acrA>marA基因的克隆.1目的基因片段與載體的連接：將回收的PCR產(chǎn)物連接到pGEM_T載體上。反應(yīng)體系為：2XRapidLigationBuffer，5pl；PCR產(chǎn)物（2ng/pl），3pl；pGEM—Tvector（50ng/pl）,1pl；T4DNALigase,1pl。16°C連接過夜。.2感受態(tài)菌的制備：CaCl2法制備DH5冬感受態(tài)細(xì)胞［5］。.3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：參照《分子克隆指南》［5］進(jìn)行。.4陽性克隆的篩選：利用a互補(bǔ)法（藍(lán)/白菌落篩選法）進(jìn)行陽性克隆的初步篩選⑸。重組質(zhì)粒的鑒定.1提取質(zhì)粒：堿裂解法［5］提取質(zhì)粒，作0.7%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察并拍照。.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定：用NcoI和Not1雙酶切鑒定acrA—pGEM—T和marA—pGEM—T質(zhì)粒。將經(jīng)過電泳篩選出的疑似陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行NcoI和Not1雙酶切反應(yīng)，同時(shí)做陰性克隆質(zhì)粒的酶切對照。酶切反應(yīng)體系為：克隆質(zhì)粒，5pl；10XHBuffer,1pl；0.1%BSA,2pl；NcoI,1gl；NotI1gl；ddH2O,10plo37C恒溫水浴2?4h。0.7%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀下觀察電泳結(jié)果并拍照。.3重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增鑒定：利用PCR反應(yīng)，對經(jīng)過上述鑒定的疑似陽性質(zhì)粒再作PCR擴(kuò)增鑒定。用引物PACR—F和PACR—R擴(kuò)增鑒定acrA—pGEM—T質(zhì)粒；用PMAR—F和PMAR—R擴(kuò)增鑒定marA—pGEM—T質(zhì)粒。取5glPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果并進(jìn)行拍照。重組質(zhì)粒的核苷酸序列測定與分析對經(jīng)上述鑒定后均符合要求的陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行序列測定（上海博亞生物技術(shù)有限公司完成），用DNAsis軟件分析測序結(jié)果。2結(jié)果2.1受試藥物的MIC包括三種誘導(dǎo)劑（氯霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星）在內(nèi)的各種受試抗菌藥對于質(zhì)控株的MIC見表1o2.2誘導(dǎo)株的耐藥性變化四環(huán)素、環(huán)丙沙星和氯霉素三個(gè)誘導(dǎo)株的MIC變化詳見表2o從表中可見，在四環(huán)素誘導(dǎo)株，除小諾霉素、妥布霉素、阿米卡星和鏈霉素的MIC沒有明顯的提高外，青霉素鉀、頭孢噻肟、四環(huán)素、土霉素、氯霉素、利福平、甲砜霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和頭孢西丁的MIC提高幅度都有達(dá)到或超過4倍（經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理，MIC變化值N4XMIC為具有顯著性意義）；在環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株，只有頭孢噻肟MIC提高倍數(shù)達(dá)到或超過了4,而其它受試抗菌藥的MIC變化都沒有顯著性意義;氯霉素誘導(dǎo)株與環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株相似，只有頭孢噻肟的MIC提高具有顯著性意義，而其他藥物沒有顯著意義。2.3acrA>marA基因檢測結(jié)果SEMR、SEICI和ATCC25922基因組DNA的提取結(jié)果從ATCC25922、SEMR、SEICI中提取的染色體DNA作0.7%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察到一條特異帶，大于23kb。見圖1oSEMR、SEICI、ATCC25922acrA、marA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果acrA.marA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，以DNAMarkerDL2,000為對照，結(jié)果在約1194bp和390bp處分別出現(xiàn)特異的目的片段，與預(yù)計(jì)的片段大小吻合。見圖2、圖3o表1受試藥物的MIC(ug/ml)Table1MICofantibacteriala(aug/ml)抗菌藥antibacterialagentsMIC抗菌藥antibacterialagentsMIC抗菌藥antibacterialagentsMIC青霉素鉀Benzylpenicillin64氧氟沙星Ofloxacin0.5甲颯霉素Clinfenicol16頭孢噻肟Antibacterial0.25諾氟沙星Norfloxacin0.25阿米卡星Amikacin32四環(huán)素Tetracycline4頭孢西丁Cefoxitin0.5環(huán)丙沙星Ciprofloxacin0.25土霉素Oxytetracycline8鏈霉素Streptomycin64妥布霉素Tobramycin8氯霉素Chloramphenicol16小諾霉素Micronomicin1利福平Rifampicin32表2誘導(dǎo)菌株的MIC變化Table2ChangeforMICofinducedstrains__誘導(dǎo)后MIC提高倍數(shù)受試藥物IncreasingpowerofMICafterinductionantibacterialagents四環(huán)素誘導(dǎo)株環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株氯霉素誘導(dǎo)株l青霉素鉀BenzylpenicillinK802頭孢噻肟Antibacterial25688四環(huán)素Tetracycline12820土霉素Oxytetracycline1620氯霉素Chloramphenicol420利副平Rifampicin400甲颯霉素Clinfenicol1600環(huán)丙沙星Ciprofloxacin400氧氟沙星Ofloxacin822諾氟沙星Norfloxacin822頭孢西丁Cefoxitin410鏈霉素Streptomycin100小諾霉素Micronomicin122妥布霉素Tobramycin000阿米卡星Amikacin0012.3.1陽性克隆的篩選結(jié)果轉(zhuǎn)化平板經(jīng)過16~20h37C的倒置培養(yǎng)，出現(xiàn)了稀疏的藍(lán)色和白色的克隆菌落。其中藍(lán)色菌落為陰性克隆，為T載體自身環(huán)化所產(chǎn)生。白色的菌落為疑似陽性克隆，需做進(jìn)一步的鑒定。2.3.2克隆質(zhì)粒的PCR鑒定分別利用擴(kuò)增引物，PCR鑒定各克隆質(zhì)粒，結(jié)果可見到特異目的帶，見圖4。2.3.3克隆質(zhì)粒的酶切鑒定將經(jīng)過PCR鑒定篩選出的疑似陽性克隆質(zhì)粒acrA_pGEM_T和marA_pGEM_T進(jìn)行NcoI和Not!雙酶切，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果在約2974bp、1220bp和416bp處分別出現(xiàn)特異的載體、acrA和marA的目的片段。見圖5、圖6。2.3.4icrA、marA基因序列的測序結(jié)果由DNAsis軟件分析測序結(jié)果表明，acrA和marA克隆質(zhì)粒序列，在ATCC25922、SEMR和SEICI都一致，與GenBank中發(fā)表序列同源性為100%,acrA和marA基因在四環(huán)素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株均沒有發(fā)生突變。3討論普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，抗菌藥物的使用是病原菌產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵所在。由于抗菌藥物的廣泛、持續(xù)和不當(dāng)使用，給細(xì)菌的生存環(huán)境造成了選擇性壓力，這種環(huán)境壓力因素可以通過多種機(jī)制導(dǎo)致病原菌對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。藥物外輸泵是一類位于細(xì)胞膜上的具有特殊結(jié)構(gòu)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，其作用機(jī)理為當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度聚集達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，藥物外輸泵系統(tǒng)相關(guān)mRNA的表達(dá)增加，結(jié)果使細(xì)胞膜上外輸泵的數(shù)量增加，使細(xì)胞內(nèi)的藥物被泵出，從而使細(xì)菌耐藥。由于外輸泵種類較多，作用底物廣泛(包括抗菌藥、染料、消毒劑、洗滌劑、有機(jī)溶劑、親脂陽離子、脂類、抗微生物多肽類、化學(xué)藥物等)，所以主動(dòng)外輸系統(tǒng)介導(dǎo)的耐藥性呈現(xiàn)多重耐藥的特點(diǎn)［6網(wǎng)。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)細(xì)菌耐藥性的原因和機(jī)理，人為造成一種抗菌藥的選擇性壓力環(huán)境，對大腸桿菌質(zhì)控株進(jìn)行體外選擇性誘導(dǎo)培養(yǎng)，以期產(chǎn)生耐藥性。從誘導(dǎo)前后多種抗菌藥MIC的變化結(jié)果看，四環(huán)素誘導(dǎo)株，除小諾霉素、妥布霉素、阿米卡星和鏈霉素的MIC沒有明顯的提高外，青霉素鉀等11種抗菌藥的MIC都有明顯提高，即表現(xiàn)了不同程度的耐藥。從耐藥譜看，產(chǎn)生耐藥的抗菌藥分屬于幾類在結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理上各不相同的類別，說明四環(huán)素誘導(dǎo)株產(chǎn)生了多重耐藥。大腸桿菌是發(fā)現(xiàn)外輸泵最多的一種細(xì)菌，在埃希氏大腸桿菌上發(fā)現(xiàn)了約30種外輸泵，但一般認(rèn)為AcrAB—TolC是最主要的外輸泵口。"有人報(bào)導(dǎo)大腸桿菌外輸泵AcrAB的作用底物包括吖啶橙、結(jié)晶紫、漠乙啶、鐮孢菌酸、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、紅霉素、夫西地酸、SDS、萘啶酸、氨比西林、氟喹諾酮類、B—內(nèi)酰胺類、利福平、吐溫X—100等多種制劑［9、11］。本實(shí)驗(yàn)的耐藥譜在受試的抗菌藥范圍內(nèi)耐藥譜與AcrAB的作用底物大體一致。這個(gè)結(jié)果提示，四環(huán)素誘導(dǎo)大腸桿菌株多重耐藥性的產(chǎn)生可能是由于激活了它的包括AcrAB在內(nèi)的主動(dòng)外排系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)中另外的氯霉素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株只對頭孢噻肟一種抗菌藥產(chǎn)生了耐藥。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因我們還不能確切定論，參考有關(guān)資料推測，假定AcrAB激活是多重耐藥產(chǎn)生的直接機(jī)制，則acrAB又受到mar等的調(diào)控，有實(shí)驗(yàn)表明環(huán)丙沙星不是操縱子mar的誘導(dǎo)因子，但是操縱子Mar的誘導(dǎo)能力對藥物產(chǎn)生低水平的耐藥性；Hachler認(rèn)為，大腸桿菌操縱子突變體能被選擇，選擇時(shí)用環(huán)丙沙星選擇的頻率大大低于能被接受的誘導(dǎo)物如四環(huán)素等的頻率12］。由此可以認(rèn)為抗菌藥的選擇性壓力與主動(dòng)外輸系統(tǒng)的交互作用在一定程度活范圍內(nèi)是有特異性的。四環(huán)素能較容易地誘導(dǎo)大腸桿菌產(chǎn)生多重耐藥這一結(jié)果還提示，四環(huán)素類抗菌藥的使用要慎重或不提倡使用，特別是對于腸桿菌疾病的治療。由此還可以聯(lián)想到，在目前人們對付病原菌耐藥性尚沒有確實(shí)有效的辦法的情況下，倒可以如世界衛(wèi)生大會(WorldHealthAssembly,WHA)［13］敦促的那樣，在消除對病原菌人為的選擇性環(huán)境壓力，減少對耐藥性的誘導(dǎo)方面多下些功夫。這不僅在現(xiàn)在，即使在將來人們逐漸找到了一些對付病原菌耐藥性的辦法，仍然不失為具有戰(zhàn)略意義的對策。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生了耐藥的抗菌藥其MIC的提高幅度不盡一致。對此種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，推測是由于不止一種外輸泵的激活，或是可能還有其他的耐藥機(jī)制的作用。因?yàn)榧?xì)菌的耐藥有著多種而復(fù)雜的機(jī)制［14］，一種或幾種機(jī)制可能同時(shí)作用于某一種/一類抗菌藥，多種耐藥機(jī)制錯(cuò)綜的作用于不同的各類藥物，可能是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)中這種耐藥的不整齊性的主要原因。特別是四環(huán)素的MIC提高幅度達(dá)128倍，極有可能存在另外的四環(huán)素耐藥機(jī)制，比如四環(huán)素排出系統(tǒng)(Tet)的參與。本實(shí)驗(yàn)對多重耐藥株、單藥耐藥株和質(zhì)控株對編碼AcrAB—TolC外輸泵組分之一AcrA［2］的acrA基因和其調(diào)控基因marA［15］作了完整的克隆和側(cè)序，二者的測序結(jié)果在上述的3個(gè)菌株都是一致的，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果的同源性均為100%，說明SEMR和SEICI的acrA和marA基因都沒有堿基的改變，四環(huán)素、環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)培養(yǎng)引起菌株的藥敏變化是在acrA和marA基因沒有突變的情況下發(fā)生的，即SEMR菌株多重耐藥性的產(chǎn)生是由于除acrA和marA突變以外的其他原因。參考文獻(xiàn)：［1］SulavikMC,HouseweartC,CramerC.AntibioticsusceptibilityprofilesofEscherichiacolistrainslackingmultidrugeffluxpumpgenes..AntimicrobAgentsChemother,2001,45:1126.FralickJAEvidencethatTolCisrequiredforfunctioningoftheMar/AcrABeffluxpumpofEscherichiacoli.JBacteriol,1996,178:5803.馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊.北京:科學(xué)出版社,2001,142盧圣棟，等.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yà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