cDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建

cDNA和基因組文庫DNA的構(gòu)建第1頁/共61頁基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體；cDNA文庫是指含有所有重組cDNA的克隆群體。

基因組文庫：來源于基因組DNA，反映基因組的全部信息，用于基因組物理圖譜的構(gòu)建，基因組序列分析，基因在染色體上的定位，基因組中基因的結(jié)構(gòu)和組織形式等。

cDNA文庫：來源于細(xì)胞表達(dá)出的RNA，反映基因組表達(dá)的基因序列信息，用于研究特定細(xì)胞中基因的表達(dá)狀態(tài)和表達(dá)基因的功能等。

基因文庫＝基因組文庫＋cDNA文庫第2頁/共61頁一、載體的種類和特征：受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片段舉例質(zhì)粒E.coli環(huán)狀很小，<8kbpUC18/19,T-載體,

pGEM3zλ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀<10kbM13系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbBACE.coli環(huán)狀約300kbPACE.coli環(huán)狀100-800kbPCYPACYAC酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC哺乳動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀>1000kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒，第3頁/共61頁二、cDNA文庫的構(gòu)建分為六個(gè)階段：

階段1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈

階段2：cDNA第二鏈的合成

階段3：cDNA的甲基化

階段4：接頭或銜接子的連接

階段5：Sepharose

CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接

第4頁/共61頁cDNA文庫的構(gòu)建mRNA

反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補(bǔ)DNA）第二條DNA鏈第5頁/共61頁1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈

1.1.在置于冰上的無菌微量離心管內(nèi)混合下列試劑進(jìn)行cDNA第一鏈的合成：

poly(A)

RNA

(1μg/μl)

10μl

寡核苷酸引物(1μg/μl)

1μl

1mol/L

Tris-HCl

(pH8.0,

37℃)

2.5μl

1mol/L

KCl

3.5μl

250

mmol/L

MgCl2

2μl

dNTP溶液（含4種dNTP，每種5mmol/L）

10μl

0.1

mol/L

DTT

2μl

RNase抑制劑（選用）

25單位

加H2O至

48μl

1.2.當(dāng)所有反應(yīng)組在0℃混合后，取出2.5μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)0.5ml微量離心管內(nèi)。在這個(gè)小規(guī)模反應(yīng)管中加入0.1μl

[α-32P]

dCTP（400

Ci/mmol,

10mCi/ml）。

第6頁/共61頁1.3.大規(guī)模和小規(guī)模反應(yīng)管都在37℃溫育1h。

1.4.溫育接近結(jié)束時(shí)，在含有同位素的小規(guī)模反應(yīng)管中加入1μl

0.25mol/L

EDTA，然后將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到冰上。大規(guī)模反應(yīng)管則在70℃溫育10

min，然后轉(zhuǎn)移至冰上。

1.5.測(cè)定0.5μl小規(guī)模反應(yīng)物中放射性總活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合適的DNA分子質(zhì)量參照物通過堿性瓊脂糖凝膠電泳對(duì)小規(guī)模反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析是值得的。

1.6.按下述方法計(jì)算cDNA第一鏈的合成量[摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一鏈(μg)

1.7.盡可能快地進(jìn)行cDNA合成的下一步驟。第7頁/共61頁2：cDNA第二鏈的合成

2.1：cDNA第二鏈的合成將下列試劑直接加入大規(guī)模第一鏈反應(yīng)混合物中、10mMol/Lmgcl270ul2mM/LTris-Hcl(PH7.4)5ul

10

mCi/ml[α-32P]

dCTP（400

Ci/mmol）

10μl

1

mol/L

(NH4)2SO4

1.5μl

RNase

H

(1000單位/ml)

1μl

大腸桿菌DNA聚合酶I

(10

000單位/ml)

4.5μl

溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機(jī)稍離心，以除去所有氣泡。在16℃溫育2~4h。

2.2.溫育結(jié)束，將下列試劑加到反應(yīng)混合物中：

β-NAD

(50

mmol/L)

1μl

大腸桿菌DNA連接酶(1000~4000單位/ml)

1μl

室溫溫育15min。

第8頁/共61頁2.3.溫育結(jié)束，加入1μl含有4種dNTP的混合物和2μl

T4噬菌體DNA聚合酶。反應(yīng)混合物室溫溫育15分鐘。

2.4.取出3μl反應(yīng)物，按步驟7和8描述的方法測(cè)定第二鏈DNA的質(zhì)量。

2.5.將5μl

0.5

mol/L

EDTA

(pH8.0)加入剩余的反應(yīng)物中，用酚：氯仿和氯仿分別抽提混合物一次。在0.3

mol/L(pH5.2)乙酸鈉存在下，通過乙醇沉淀回收DNA，將DNA溶解在90μl

TE(pH7.6)溶液中。

2.6.將下列試劑加到DNA溶液中：

10×T4多核苷酸激酶緩沖液

10μl

T4多核苷酸激酶（3000單位/ml）

1μl

室溫溫育15分鐘。

2.7.測(cè)定從上面步驟4取出的3μl反應(yīng)物中放射性活度，測(cè)定1μl第二鏈合成產(chǎn)物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。

第9頁/共61頁2.8.用下面公式計(jì)算第二鏈反應(yīng)中所合成的cDNA量。要考慮到已摻入到DNA第一鏈種的dNTP的量。

[第二鏈反應(yīng)中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)]*(66μg

-xμg)=cDNA第二鏈合成量/μg

x表示cDNA第一鏈量。CDNA第二鏈合成量通常為第一鏈量的70~80%

2.9.用等量酚：氯仿對(duì)含有磷酸化cDNA（來自步驟6）的反應(yīng)物進(jìn)行抽提。2.10.

Sephadex

G-50用含有10

mmol/L

NaCl的TE(pH7.6)溶液進(jìn)行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的dNTP和cDNA分開。

第10頁/共61頁2.11.

加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的cDNA，將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量離心機(jī)上以最大速度4℃離心15分鐘，回收沉淀DNA。用手提微型監(jiān)測(cè)儀檢查，是否所有放射性都沉淀下來。

2.12.

用70%乙醇洗滌沉淀物，重復(fù)離心。

2.13.

小心吸出所有液體，空氣干燥沉淀物。

2.14.

如果需要用EcoR

I甲基化酶對(duì)cDNA進(jìn)行甲基化，可將cDNA溶解于80μl

TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要將cDNA直接與Not

I或Sal

I接頭或寡核苷酸銜接子相連，可將cDNA懸浮在29μl

TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，盡快進(jìn)行cDNA合成的下一步驟。第11頁/共61頁3：cDNA的甲基化3.1.在cDNA樣品中加入以下試劑：

2

mol/L

Tris-HCl

(pH8.0)

5μl

5

mol/L

NaCl

2μl

0.5

mol/L

EDTA(pH8.0)

2μl

20

mmol/L

S-腺苷甲硫氨酸

1μl

加H2O至

96μl

3.2.取出兩小份樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為1號(hào)和2號(hào)，置于冰上。

3.3.在余下的反應(yīng)混合液中加入2μl

EcoR

I

甲基化酶（80

000單位/ml），保存在0℃直至步驟4完成。

3.4.再從大體積的反應(yīng)液中吸出另外兩小分樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為3號(hào)和4號(hào)。

第12頁/共61頁3.5.在所有四小份樣品（來自步驟2和步驟4）加入100

ng質(zhì)粒DNA或500

ng的λ噬菌體DNA。這些未甲基化的DNA在預(yù)實(shí)驗(yàn)中用作底物以測(cè)定甲基化效率。

3.6.所有四份小樣實(shí)驗(yàn)反應(yīng)和大體積的反應(yīng)均在37℃溫育1h。

3.7.于68℃加熱15min，用酚：氯仿抽提大體積反應(yīng)液一次，再用氯仿抽提一次。

3.8.在大體積反應(yīng)液中加入0.1倍體積的3

mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，混勻后貯存于-20℃直至獲得小樣反應(yīng)結(jié)果。第13頁/共61頁

3.

9.按下述方法分析4個(gè)小樣對(duì)照反應(yīng)：

a.

在每一對(duì)照反應(yīng)中分別加入：

0.1

mol/L

MgCl2

2μl

10×EcoR

I

緩沖液

2μl

加H2O至

20μl

b.

在2號(hào)和4號(hào)反應(yīng)管中分別加入20單位EcoR

I。

c.

四個(gè)對(duì)照樣品于37℃溫育1h，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

3.10.

微量離心機(jī)以最大速度離心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。棄上清，加入200μl

70%乙醇洗滌沉淀，重復(fù)離心。

3.11.

用手提式微型探測(cè)器檢查是否所有放射性物質(zhì)均被沉淀。小心吸出乙醇，在空氣中晾干沉淀，然后將DNA溶于29μl

TE（pH8.0）。

3.12.

盡可能快地進(jìn)行cDNA合成的下一階段。

第14頁/共61頁4：接頭或銜接子的連接

cDNA末端的削平

4.1.cDNA樣品于68℃加熱5

min。

4.2.將cDNA溶液冷卻至37℃并加入下列試劑：

5×T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液

10μl

dNTP溶液，每種5

mmol/L

5μl

加H2O至

50μl

4.3.加入1~2單位T4噬菌體DNA聚合酶（500單位/ml），37℃溫育15min。

4.4.加入1μl

0.5mol/L

EDTA(pH8.0)，以終止反應(yīng)。

第15頁/共61頁4.5.用酚：氯仿抽提，再通過Sephadex

G-50離心柱層析，除去未摻入的dNTP。

4.6.在柱流出液中加入0.1倍體積的3

mol/L

乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇，樣品于4℃至少放置15

min。

4.7.在微量離心機(jī)上以最大速度離心15

min(4℃)，回收沉淀的cDNA。沉淀經(jīng)空氣干燥后溶于13μl的10

mmol/L

Tris-HCl

(pH8.0).接頭-銜接子與cDNA的連接

第16頁/共61頁4.8.將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：

10×T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液

2μl

800~1000

ng的磷酸化接頭或銜接子

2μl

T4噬菌體DNA連接酶（105

Weiss單位/ml）

1μl

10

mmol/L

ATP

2μl

混勻后，在16℃溫育8~12h。

4.9.從反應(yīng)液中吸出0.5μl貯存于4℃，其余反應(yīng)液于68℃加熱15min以滅活連接酶。第17頁/共61頁5：Sepharose

CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

Sepharose

CL-4B柱的制備

5.1.用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉拭的一半推進(jìn)1ml滅菌吸管端部，用無菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并棄去，再用濾過的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。

5.2.將一段無菌的聚氯乙烯軟管與吸管窄端相連，將吸管寬端浸于含有0.1

mol/L

NaCl的TE（pH7.6）溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸，直至吸管內(nèi)充滿緩沖液，用止血鉗關(guān)閉軟管。

第18頁/共61頁5.3.在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，讓糊狀物靜置數(shù)分鐘，放開止血鉗，當(dāng)緩沖液從吸管滴落時(shí)，層析柱亦隨之形成。如有必要，可加入更多的Sepharose

CL-4B，直至填充基質(zhì)幾乎充滿吸管為止。

5.4.將幾倍柱床體積的含0.1

mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)洗滌柱子。洗柱完成后，關(guān)閉柱子底部的軟管。

依據(jù)大小分離回收DNA

第19頁/共61頁5.5.用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose

CL-4B上層的液體，將cDNA加到柱上（體積50μl或更?。?，放開止血鉗，使cDNA進(jìn)入凝膠。用50μl

TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA的微量離心管，將洗液亦加于柱上。用含0.1

mol/L

NaCl的TE(pH7.6)充滿泡沫管。

5.6.用手提式小型探測(cè)器監(jiān)測(cè)cDNA流經(jīng)柱子的進(jìn)程。放射性cDNA流到柱長(zhǎng)2/3時(shí)，開始用微量離心管收集，每管2滴，直至將所有放射性洗脫出柱為止。

5.7.用切侖科夫計(jì)數(shù)器測(cè)量每管的放射性活性。

5.8.從每一管中取出一小份，以末端標(biāo)記的已知大?。?.2kb~5kb）的DNA片斷作標(biāo)準(zhǔn)參照物，通過1%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行分析，將各管余下部分貯存于-20℃，直至獲得瓊脂糖凝膠電泳的放射自顯影片。第20頁/共61頁5.9.電泳后將凝膠移至一張Whatman

3MM濾紙上，蓋上一張Saran包裝膜，并在凝膠干燥器上干燥。干燥過程前20min至30min于50℃加熱凝膠，然后停止加熱，在真空狀態(tài)繼續(xù)干燥1~2h.

5.10.

置-70℃加增感屏對(duì)干燥的凝膠繼續(xù)X射線曝光。

5.11.

在cDNA長(zhǎng)度≥500bp的收集管中，加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用微量離心機(jī)于4℃以12

000g離心15min，以回收沉淀的cDNA。

第21頁/共61頁5.12.

將DNA溶于總體積為20μl的10

mmol/L

Tris-HCl(pH7.6)中。

5.13.

測(cè)定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計(jì)算可用于λ噬菌體臂相連接的DNA總量。

[選定組分的總活度值(cpm)/摻入到第二鏈的活度值(cpm)]*2xμg

cDNA第二鏈合成量=可用于連接的cDNA

第22頁/共61頁6：cDNA與λ噬菌體臂的連接6.1.按下述方法建立4組連接-包裝反應(yīng)：連接A(μl)B(μl)C(μl)D(μl)λ噬菌體DNA(0.5μg/μl)1.01.01.01.010×T4DNA連接酶緩沖液1.01.01.01.0cDNA0ng5ng10ng50ngT4噬菌體DNA連接酶（105Weiss單位/ml）0.10.10.10.110mmol/LATP1.01.01.01.0加H2O至10101010連接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA儲(chǔ)存于-20℃。

6.2.按包裝提取物廠商提供的方法，從每組連接反應(yīng)物中取5μl包裝到噬菌體顆粒中。

6.3.包裝反應(yīng)完成后，在各反應(yīng)混合物中加入0.5mlSM培養(yǎng)基。

第23頁/共61頁6.4.預(yù)備適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌株新鮮過夜培養(yǎng)物，包裝混合物做100倍稀釋，各取10μl和100μl涂板，于37℃或42℃培養(yǎng)8~12小時(shí)。

6.5.計(jì)算重組噬菌斑和非重組噬菌斑，連接反應(yīng)A不應(yīng)產(chǎn)生重組噬菌斑，而連接反應(yīng)B、C和D應(yīng)產(chǎn)生數(shù)目遞增的重組噬菌斑。

6.6.根據(jù)重組噬菌斑的數(shù)目，計(jì)算cDNA的克隆效率。

6.7.挑取12個(gè)重組λ噬菌體空斑，小規(guī)模培養(yǎng)裂解物并制備DNA，以供適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化。

6.8.通過1%瓊脂凝膠電泳分析cDNA插入物的大小，用長(zhǎng)度范圍500bp~5kb的DNA片段作為分子質(zhì)量參照。第24頁/共61頁注意要點(diǎn)cDNA雙鏈合成的注意要點(diǎn):所有合成cDNA第一條鏈的方法都要依賴于ＲＮＡ的ＤＮＡ聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）來催化反應(yīng)，合成中有兩個(gè)關(guān)鍵因素，一個(gè)是mＲＮＡ模板，一個(gè)是反轉(zhuǎn)錄酶．第25頁/共61頁

保證獲得足夠數(shù)量和高質(zhì)量的起始ＲＮＡ

模板mＲＮＡ的質(zhì)量直接影響到cDNA合成的效率，完成和均一是衡量mＲＮＡ質(zhì)量的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)．

反轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄效率是關(guān)鍵中的關(guān)鍵．

第26頁/共61頁cDNA文庫構(gòu)建后期的注意要點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄后至包裝噬菌體外殼蛋白之前的諸多步驟操作按部就班，但其中的cDNA層析柱分級(jí)很重要．注重載體與cDNA的連接效率、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率第27頁/共61頁

三、基因組DNA文庫的構(gòu)建將總DNA經(jīng)過酶解，經(jīng)蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳分離不同長(zhǎng)短的DNA片段。包含的基因組片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上，轉(zhuǎn)染細(xì)菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因組文庫。第28頁/共61頁

1.基因組文庫構(gòu)建步驟

第29頁/共61頁1.1載體DNA的制備：

高分子量的外源DNA

100-150kb1.2載體DNA酶切反應(yīng)（常用BamHI）1.3載體臂的純化（蔗糖密度梯度離心）

1.4載體脫磷處理

（堿性磷酸酶）

載體：

l噬菌體：48.5kb,插入型(最多可容納9kb)、取代型(可容納38-51kb，最適19-20kb)，

EMBL,

Charon粘性質(zhì)粒(Cosmid)：4-6kb,

質(zhì)粒+噬菌體的性質(zhì)，可容納大片段的外源基因，最多可容納46kb。

酵母人工染色體克隆體系（YAC，Yeast

Artificial

Chromosome

Cloning

System）

插入大小200—1000kb

·

第30頁/共61頁1.5連接和包裝：外源片段與兩臂之間的比例，包裝蛋白

感染宿主菌：選擇合適的宿主菌，LE392,

NM538,

NM539,KW251等

1.6克隆文庫的保存和擴(kuò)增：完整性和代表性

測(cè)滴度，要在106fu以上;

保存，氯仿4℃，7%

DMSO

-70℃

第31頁/共61頁

人類染色體3X109，平均插入片段大小17

kb第32頁/共61頁生物芯片生物芯片簡(jiǎn)單地說，生物芯片就是在一塊指甲大小的玻片、硅片、尼龍膜等材料上放上生物樣品，然后由一種儀器收集信號(hào)，用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)結(jié)果。目前制備芯片的固相材料有玻片、硅片、金屬片、尼龍膜等。目前較為常用的支持材料是玻片，因?yàn)椴Ｆm合多種合成方法，而且在制備芯片前對(duì)玻片的預(yù)處理也相對(duì)簡(jiǎn)單易行。第33頁/共61頁生物芯片是八十年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)，它主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固格體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。常用的生物芯片分為三大類：即基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和芯片實(shí)驗(yàn)室。生物芯片的主要特點(diǎn)是高通量、微型化和自動(dòng)化。芯片上集成的成千上萬的密集排列的分子微陣列，能夠在短時(shí)間內(nèi)分析大量的生物分子，使人們快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的生物信息，效率是傳統(tǒng)檢測(cè)手段的成百上千倍。它將是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠(yuǎn)意義的科學(xué)技術(shù)革命。第34頁/共61頁進(jìn)入二十一世紀(jì)，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，電子技術(shù)和生物技術(shù)相結(jié)合誕生了半導(dǎo)體芯片的兄弟——生物芯片，這將給我們的生活帶來一場(chǎng)深刻的革命。這種革命對(duì)于我國(guó)，乃至全世界的可持續(xù)發(fā)展都會(huì)起到不可估量的貢獻(xiàn)。第35頁/共61頁1.生物芯片的種類

通常的生物化學(xué)反應(yīng)過程包括三步，即樣品的制備，生化反應(yīng)、結(jié)果的檢測(cè)和分析?？蓪⑦@三步不同步驟集成為不同用途的生物芯片，所以據(jù)此可將生物芯片分為不同的類型。例如用于樣品制備的生物芯片，生化反應(yīng)生物芯片及各種檢測(cè)用生物芯片等?，F(xiàn)在，已經(jīng)有不少的研究人員試圖將整個(gè)生化檢測(cè)分析過程縮微到芯片上，形成所謂的“芯片實(shí)驗(yàn)室”(Lab-on-chip)?！靶酒瑢?shí)驗(yàn)室”通過微細(xì)加工工藝制作的微濾器、微反應(yīng)器、微泵、微閥門、微電極等以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品從制備、生化反應(yīng)到檢測(cè)和分析的全過程，從而極大地縮短的檢測(cè)和分析時(shí)間，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)材料。

第36頁/共61頁樣品制備芯片的目的是將通常需要在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的多個(gè)操作步驟集成于微芯片上。目前，樣品制備芯片主要通過升溫、變壓脈沖以及化學(xué)裂解等方式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，通過微濾器、介電電泳等手段實(shí)現(xiàn)生物大分子的分離。

生化反應(yīng)芯片即在芯片上完成生物化學(xué)反應(yīng)。與傳統(tǒng)生化反應(yīng)過程的區(qū)別主要在于它可以高效、快速地完成生物化學(xué)反應(yīng)。例如，在芯片上進(jìn)行PCR反應(yīng)，可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)試劑，提高反應(yīng)速度，并可完成多個(gè)片段的擴(kuò)增反應(yīng)。當(dāng)前，由于檢測(cè)和分析的靈敏度所限，通常在對(duì)微量核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)必需事先對(duì)其進(jìn)行一定程度的擴(kuò)增。所以用于PCR的芯片無疑為快速大量擴(kuò)增樣品多個(gè)DNA片段提供了有力的工具。

第37頁/共61頁檢測(cè)芯片顧名思義是用來檢測(cè)生物樣品的。例如用毛細(xì)管電泳芯片進(jìn)行DNA突變的檢測(cè)，用于表達(dá)譜檢測(cè)、突變分析、多態(tài)性測(cè)定的DNA微點(diǎn)陣芯片（也稱DNA芯片、基因芯片），用于大量不同蛋白檢測(cè)和表位分析的蛋白或多肽微點(diǎn)陣芯片（也稱蛋白或多肽芯片）。

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芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。它將樣品的制備、生化反應(yīng)到檢測(cè)分析的整個(gè)過程集約化形成微型分析系統(tǒng)?，F(xiàn)在，已經(jīng)有由加熱器、微泵、微閥、微流量控制器、微電極、電子化學(xué)和電子發(fā)光探測(cè)器等組成的芯片實(shí)驗(yàn)室問世，并出現(xiàn)了將生化反應(yīng)、樣品制備、檢測(cè)和分析等部分集成的芯片。例如可以將樣品的制備和PCR擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)完成于一塊小小的芯片之上。再如GeneLogic公司設(shè)計(jì)制造的生物芯片可以從待檢樣品中分離出DNA或RNA，并對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后當(dāng)樣品流過固定于柵欄狀微通道內(nèi)的寡核苷酸探針時(shí)便可捕獲與之互補(bǔ)的靶核酸序列。應(yīng)用其自己開發(fā)的檢測(cè)設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)對(duì)雜交結(jié)果的檢測(cè)與分析。這種芯片由于寡核苷酸探針具有較大的吸附表面積，所以可以靈敏地檢測(cè)到稀有基因的變化。同時(shí)，由于該芯片設(shè)計(jì)的微通道具有濃縮和富集作用，所以可以加速雜交反應(yīng)，縮短測(cè)試時(shí)間，從而降低了測(cè)試成本。

綜觀生物芯片的發(fā)展，檢測(cè)用生物芯片的發(fā)展最為迅猛。目前，檢測(cè)用生物芯片主要為微點(diǎn)陣技術(shù)。第39頁/共61頁cDNAArray和MicroArraycDNAArray即cDNA列陣，或譯作矩陣，由排列在96孔板大小的少到幾十個(gè)，多至上萬個(gè)不同基因的cDNA點(diǎn)組成。MicroArray被譯作“基因芯片”，或譯作“微矩陣”，這個(gè)矩陣由點(diǎn)在大如載玻片，小如指甲大小面積的固定介質(zhì)表面的上百至數(shù)千個(gè)特定的基因組成。是cDNAArray的微型化。第40頁/共61頁第41頁/共61頁第42頁/共61頁第43頁/共61頁MicroArray的工作原理是將欲研究細(xì)胞組織的RNA通過不同的方式轉(zhuǎn)錄成cDNA，轉(zhuǎn)錄過程中或之后給予熒光等標(biāo)記，制成探針，然后在嚴(yán)格的條件下使該探針與微矩陣上的基因雜交，雜交后，把未雜交的基因洗脫，在一定的條件下，觀察雜交結(jié)果，以了解某特定組織中基因轉(zhuǎn)錄的多寡和特征。如果兩個(gè)組織的RNA用不同發(fā)光色彩的熒光標(biāo)記，同時(shí)進(jìn)行雜交，由于兩個(gè)組織雜交后所激發(fā)的熒光色彩不同，微矩陣上與甲組織特有探針結(jié)合則產(chǎn)生甲探針的光色，與乙組織特有探針結(jié)合則產(chǎn)生乙探針的光色，兩種探針同時(shí)結(jié)合則產(chǎn)生相兼色。這樣在一塊基因芯片上就可以方便、迅速、大規(guī)模地觀察兩個(gè)不同組織基因轉(zhuǎn)錄的異同。第44頁/共61頁在基因芯片問世的短短幾年來，一些改進(jìn)型的基因芯片技術(shù)陸續(xù)問世，并迅速形成產(chǎn)品。比如GeneChip。其特點(diǎn)為：1）容量大，每個(gè)芯片上可以達(dá)39000個(gè)基因，因此，單位時(shí)間內(nèi)識(shí)別的基因多且快；2）在基因矩陣上每個(gè)點(diǎn)由上下兩排更小的矩陣組成，每排由16-20個(gè)與某一mRNA不同區(qū)域?qū)?yīng)的25個(gè)寡核苷酸組成。上下兩行中，上行為正常基因序列，下行為中間有點(diǎn)突變的序列。這樣在相同嚴(yán)格的雜交和洗脫條件下，上行基因16-20個(gè)點(diǎn)應(yīng)該全部陽性反應(yīng)，而下行基因因含有點(diǎn)突變，退火結(jié)合后不夠穩(wěn)定，會(huì)被洗脫。因而這樣僅上行呈陽性的雜交才算有效。所以在避免假陽性方面具有別的芯片所無法比擬的優(yōu)勢(shì)。還如discoveryARRAY。該芯片把RFDD-PCR（限制性片段差異展示PCR）技術(shù)與MicroArray技術(shù)結(jié)合在一道。由于mRNA拷貝為PCR所放大，極大豐富地?cái)U(kuò)增了一些微量轉(zhuǎn)錄的mRNA，使之得以清晰地反映在Array上。我國(guó)也開始了基因芯片的研制和開發(fā)。第45頁/共61頁通過對(duì)現(xiàn)狀的回顧，可以看出，當(dāng)前的基因芯片技術(shù)還有以下一些問題：1．要求專門設(shè)備，國(guó)內(nèi)尚未普及。2．研究成本高。3．不是所有常用生物均有全RNA組芯片。4．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)龐大。5．大量的基因功能還不明朗。第46頁/共61頁雖然如此，基因芯片技術(shù)已展現(xiàn)出絢麗的前景：1．已經(jīng)出品了人類全套基因組芯片，使基因芯片完全實(shí)用。2．當(dāng)基因芯片生產(chǎn)技術(shù)趨于成熟，開始象轎車、家用電器生產(chǎn)的批量化、規(guī)模化，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)降低生產(chǎn)成本，降低售價(jià)，便于普及。3．一旦類似高效的蛋白芯片技術(shù)的解決，與基因芯片的配套使用，將會(huì)對(duì)生命科學(xué)研究取得質(zhì)的突破。4．生物計(jì)算技術(shù)的發(fā)展，芯片結(jié)果自動(dòng)化分析程度增加，將使人類更好、更快地駕馭基因芯片的海量信息。5．不同基因功能研究的積累，以及基因功能研究技術(shù)的發(fā)展與普及，使基因芯片研究的后續(xù)工作得以有效的開展，基因芯片的學(xué)術(shù)價(jià)值將得到革命性的發(fā)展。6．互聯(lián)網(wǎng)海量生物信息開放和不斷豐富，以及有關(guān)計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)的發(fā)展與升級(jí)，使芯片結(jié)果的分析與深入研究空前的便利。第47頁/共61頁與基因芯片原理類似的有cDNAArray。CLONTECHLaboratories公司的AtlascDNAExpressionArrays是其代表。其cDNAArray的矩陣點(diǎn)由肉眼可見大小的cDNA點(diǎn)組成，點(diǎn)于96孔板大小的硝酸纖維素膜上。工作原理是，抽提組織的總RNA或進(jìn)一步分離mRNA，用反轉(zhuǎn)錄酶和同位素反轉(zhuǎn)錄mRNA成cDNA探針，與膜上的cDNA雜交，放射自顯影。不同的組織分別用一張膜。其放射自顯影結(jié)果可以用肉眼識(shí)別。該公司還配套有分析軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果掃描后可以通過軟件比較不同組織基因轉(zhuǎn)錄的差異。因此該Array的優(yōu)點(diǎn)為1）不要求專用儀器設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室均可以操作。2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果肉眼可以識(shí)別，以便調(diào)整曝光時(shí)間，以獲取最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3）配套有分析軟件，可以借助普通掃描儀和計(jì)算機(jī)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第48頁/共61頁第49頁/共61頁第50頁/共61頁第51頁/共61頁但是我們使用下來有以下一些缺點(diǎn)：1）一般組織絕大部分的RNA豐度不夠，導(dǎo)致大多數(shù)雜交的重復(fù)性差。由此造成定量的困難和錯(cuò)誤，給后續(xù)研究帶來困難。2）制膜的技術(shù)性問題。比如小鼠Array的雜交背景高，影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。3）軟件在消除背景方面的智能化技術(shù)尚不成熟，影響到結(jié)果的分析。第52頁/共61頁4）Array的基因數(shù)量少，約1200個(gè)。遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能與一般組織大量轉(zhuǎn)錄的mRNA匹配。與此技術(shù)類似的Array，有單病種Array（如前面所介紹，也可以是MicroArray），但是制作在硝酸纖維膜上的Array以其價(jià)廉方便似乎更有優(yōu)勢(shì)。其原理是，通過對(duì)某一疾病基因譜改變的了解，依據(jù)若干不同基因譜變化的特征，設(shè)計(jì)出針對(duì)單病種的Array。這些Array上所含的基因有限，包含了某一病種不同基因譜的關(guān)鍵基因，因而成本低，適用于臨床的輔助診斷。第53頁/共61頁中科院上海細(xì)胞研究所德國(guó)馬普學(xué)會(huì)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室曾開發(fā)cDNAArray，在96孔板大小的纖維素膜上點(diǎn)制成含16000個(gè)左右基因的Array。信