分子生物學研究方法和技術

本人基本情況1984年獲湖南農學院農學學士學位。1987年獲中國科學院遺傳研究所理學碩士學位，專業(yè):分子遺傳。1999年11月-200２年11月受國家科技部派遣，在日本農林水產(chǎn)省北海道國家農業(yè)研究中心博士后特別研究員；主要從事基因定位和功能基因的篩選。１９８４－１９９９年：主要從事水稻細胞質雄性不育機理研究；水稻分子育種技術研究。１９９９－２０１4：主要從事雜交水稻種子純度快速鑒定技術研究；水稻品種ＤＮＡ指紋研究；基因定位和分子育種技術研究。當前1頁，總共93頁。當前2頁，總共93頁。

1、分子生物學的發(fā)展歷程

1871年，首次發(fā)現(xiàn)DNA（鮭精DNA）。

1943年，證明DNA為遺傳分子，而不是蛋白（1944，OTAvery）1953年，DNA雙螺旋模型提出（JDWatson（美）和FHCCrick（英），1962年或諾貝爾生理學、醫(yī)學獎）。從而為分子生物學這一學科奠基。

1961年，合成mRNA，破譯第一個遺傳密碼（MWNirenberg（美），1968年獲諾貝爾生理學、醫(yī)學獎）

——基礎研究的創(chuàng)新，與推動人類文明的進步。

（以上被稱為理論上的三大發(fā)現(xiàn)）當前3頁，總共93頁。1970年，分離出第一個限制性內切酶（WArber（瑞士），1978年獲諾貝爾醫(yī)學獎）1970年，Baltimore和Temin發(fā)現(xiàn)了逆轉錄酶——長期的基礎研究積累迎來了突飛猛進的高潮。1973年，Cohen把質粒作為基因工程的載體使用——基礎研究向應用研究的拓展。（以上被稱為生物工程技術的的三大發(fā)明）當前4頁，總共93頁。3個事例：（1）1976年，重組DNA成功（HBoyer和SNColen，1981年獲諾貝爾化學獎）——勇敢的科學精神。（2）1982年，美國一制藥公司在2000升發(fā)酵液中提取出100克精制胰島素。相當于從1600磅動物胰腺中的提取量——效率、成本、質量、競爭。（3）荷蘭最早把分子生物學產(chǎn)品“豬牛痢疾疫苗”投放市場，比以上美國的胰島素早半年——后來居上。當前5頁，總共93頁。人類對生命現(xiàn)象的認識

20世紀個體→染色體→基因→DNA→SNP生物與非生物間的界限消失了！21世紀基因克隆，拼結→組裝植物、動物、嬰兒！當前6頁，總共93頁。數(shù)、理、化相關學科生物學實驗技術滲透交叉近代生物學生物學個性共性宏觀生物學（生態(tài)學為核心）微觀生物學（分子生物學為核心）細胞水平分子水平結構生物學，發(fā)育生物學，神經(jīng)生物學等新興學科發(fā)展生物多樣性研究資源保護與利用人類生態(tài)環(huán)境的保護工農業(yè)生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展現(xiàn)代生物學的發(fā)展當前7頁，總共93頁。分子生物學分子結構生物學分子發(fā)育生物學分子神經(jīng)生物學分子育種學分子腫瘤學分子細胞生物學分子免疫學分子病毒學分子生理學分子考古學分子遺傳學分子數(shù)量遺傳學分子生態(tài)學分子進化學…………….分子生物學滲透到生物學幾乎所有學科分子生物學成為現(xiàn)代生命科學的共同語言

分子生物學的延伸當前8頁，總共93頁。2分子生物學的概念2.1分子生物學的定義2.2分子生物學的三大原則2.3分子生物學研究的三大主要領域2.4分子生物學發(fā)展的三大支撐學科當前9頁，總共93頁。2.1分子生物學的定義

Molecularbiologyisthestudyofgenesandtheiractivitiesatthemolecularlevel,includingtranscription,translation,DNAreplication,recombinationandtranslocation.分子生物學是研究核酸、蛋白質等生物大分子的形態(tài)、結構特征及其重要性、規(guī)律性和相互關系的科學，是人類從分子水平上真正揭示生物世界的奧秘，由被動地適應自然界轉向主動地改造和重組自然界的基礎學科。當前10頁，總共93頁。分子生物學與生物化學之間的關系與區(qū)別分子生物學—研究生物大分子的結構、功能及信息傳遞過程，從分子水平研究生命現(xiàn)象。生物化學—生物體內的化學運動，包括化學組成、變化、結構與功能，生物分子間的物質與能量轉換過程。分子生物學≠生物化學當前11頁，總共93頁?！飿嫵缮锎蠓肿拥膯误w是相同的★生物遺傳信息的表達的中心法則相同DNARNApolypeptidesproteincharacter高級結構生物大分子之間的互作個性2.2分子生物學的三大原則共同的核酸語言共同的蛋白質★生物大分子單體的排列（核苷酸，氨基酸）當前12頁，總共93頁。結構生物學基因分子生物學生物技術理論論與應用2.3分子生物學研究的三大主要領域生物大分子的結構與功能生物大分子之間的互作DNA—proteinHormone—receptorEnzyme--substrate基因的概念基因的結構基因的復制基因的表達基因的重組基因的突變基因工程細胞工程酶工程發(fā)酵工程蛋白質工程狹義的分子生物學——分子遺傳學當前13頁，總共93頁。2.4分子生物學發(fā)展的三大支撐學科當前14頁，總共93頁。1839-1847年MatthiasSchleiden&TheodorSchwann細胞的化學組成，細胞器的結構，細胞骨架，生物大分子在細胞中的定位及功能分子生物學發(fā)展的三大支撐學科之一生物體由細胞組成所有組織的最基本單元----形狀相似，高度分化的細胞細胞的發(fā)生與形成是生物界普遍和永久的規(guī)律CytologyMolecularCellbiology

當前15頁，總共93頁。GregorMendel1864年GeneticsMolecularGeneticsGenestructureGeneduplicationGeneexpressionGenerecombinationGenemutation

分子生物學發(fā)展的三大支撐學科之二遺傳因子假說Genetics當前16頁，總共93頁。BiochemistryNucleicAcidChemistryProteinChemistry(1936年JamesSumner)分子生物學發(fā)展的三大支撐學科之三Enzymaticnatureofcrystalline（晶體）ProteinBiochemistry當前17頁，總共93頁。321世紀分子生物學展望3.1自然科學歷史舞臺角色的重大變化3.2未來生物學形成的新熱點及領域3.3應用生物學發(fā)展3.4

21世紀—生命科學的世紀當前18頁，總共93頁。3.1

自然科學歷史舞臺角色將發(fā)生重大變化引導自然科學向物質運動最高層次突破的帶頭學科物理學

生物學當前19頁，總共93頁。3.2未來生物學形成的新熱點及領域當前20頁，總共93頁。生物大分子的高級三維結構與功能的統(tǒng)一生物大分子之間的互作基因表達，基因互作器官發(fā)生胚胎形成個體發(fā)育結構生物學（StructuralBiology）

分子發(fā)育生物學（MolecularDevelopingBiology）當前21頁，總共93頁。個體細胞分子整體論細胞中的定位細胞分化神經(jīng)基質神經(jīng)通道信息傳遞大分子克隆一級結構分析三維結構重建思維感情記憶科學解釋分子細胞生物學(MolecularCellBiology)分子神經(jīng)生物學（MolecularNeurobiology）當前22頁，總共93頁。計算機語言

分辨，提取，分析，比較，預測生物信息

生物大分子的結構與功能信息

基因的識別與鑒定基因功能信息的提取與證實基因表達譜的繪制(microarray)蛋白質水平上基因互作的探測

功能基因組學(FunctionalGenomicsorpost—Genomics)

生物信息學(Bioinformatics)當前23頁，總共93頁。3.3應用生物學發(fā)展

生物技術

診斷試劑治療藥物植物品種環(huán)境工程食品加工生物塑料廢物處理再生能源……當前24頁，總共93頁。3.421世紀——生命科學的世紀當前25頁，總共93頁。二十一世紀生命科學的世紀當前26頁，總共93頁。分子生物學理論的突破生物技術的有效應用新舊技術的有機結合人口與糧食能源與資源環(huán)境與生態(tài)健康與疾病當前27頁，總共93頁。更加深刻更為明確闡明生物大系統(tǒng)

生長發(fā)育

遺傳變異

繁殖死亡

生命本質更加主動更為有效利用生物技術

改造生物

創(chuàng)造生物

新興產(chǎn)業(yè)

推動工，農，醫(yī)的發(fā)展

學習分子生物學的意義當前28頁，總共93頁。第一章RNA的分離純化當前29頁，總共93頁。主要內容

前言一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級結構的完整性（二）防止核酸的生物降解二、分離提取核酸的主要步驟（一）細胞的破碎（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除（三）核酸的沉淀

(四）核酸的濃度測定（五）核酸的保存當前30頁，總共93頁。

核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質基礎。無論是進行核酸結構還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化。核酸樣品質量將直接關系到實驗的成敗。前言當前31頁，總共93頁。一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級結構的完整性

1意義遺傳信息全部儲存在一級結構之中，核酸的—級結構還決定其高級結構的形式以及和其他生物大分子結合的方式。

2分離核酸原則：

1）溫度不要過高；

2）控制一定的pH值范圍(pH值5-9);

3）保持一定的離子強度;

4）減少物理因素對核酸降解的機械剪切力.當前32頁，總共93頁。（二）防止核酸的生物降解

細胞內或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結構。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。當前33頁，總共93頁。1.DNA酶抑制劑1）金屬離子螯合劑：

DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉；2）陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質變性，并與變性蛋白結合成帶負電荷的復合物，該復合物在高鹽溶液中沉淀。當前34頁，總共93頁。2.RNA酶（RNAase)抑制劑

RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。

(1)皂土（bentonite

）作用機制：皂土帶負電荷，能吸附RNase，使其失活。當前35頁，總共93頁。

(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。

作用機制：與蛋白質中His結合使蛋白變性。

使用注意：

1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質變性的濃度大100～1000倍。

2）容易降解，保存在4℃或液氮中；

3）提RNA時，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。

4）劇毒。當前36頁，總共93頁。（3)肝素（4）復合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)當前37頁，總共93頁。二分離提取核酸的主要步驟（一）細胞的破碎

1高速組織搗碎機搗碎

2玻璃勻漿器勻漿

3超聲波處理法

4液氮研磨法

5化學處理法(SDS、吐溫80等）

6生化法（溶菌酶、纖維素酶等）當前38頁，總共93頁。（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質的結合力主要是正負靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結合的蛋白質分開，同時避免核酸降解。當前39頁，總共93頁。

常用方法：

1.加入濃鹽溶液（如NaCl）核酸-蛋白質加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；

2.加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質上游離出來的功能；

當前40頁，總共93頁。

3.酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯仿：異戊醇=25：24：1）。當前41頁，總共93頁。

1）使用注意酚通常是透明無色的結晶，如果酚結晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。

2）安全操作酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應戴手套。使用酚時應注意當前42頁，總共93頁。（三）核酸的沉淀

沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優(yōu)點：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質。當前43頁，總共93頁。1.核酸沉淀的鹽類及濃度當前44頁，總共93頁。2.有機沉淀劑

（1）乙醇優(yōu)點：

對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實驗。缺點：

需要量大，一般要求低溫操作。當前45頁，總共93頁。（2）異丙醇優(yōu)點：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。當前46頁，總共93頁。（3）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質量的DNA片段。應用6000相對分子質量的PEG進行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。當前47頁，總共93頁。（4）精胺

精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀DNA。

原理是：精胺與DNA結合后，使DNA在溶液中結構凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質雜質與DNA分開，達到純化DNA的目的。當前48頁，總共93頁。3.核酸沉淀的溫度和時間一般強調，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達到實驗要求。當前49頁，總共93頁。(四）核酸的濃度測定

1.紫外分光光度法測定DNA和RNA的含量

前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應大于0.25μg/ml。

結論：在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。當前50頁，總共93頁。紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟a．吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉入分光光度計的石英比色杯中。b．分光光度計先用一定量的水校正零點。c．測定待測樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。d．計算濃度。

雙鏈DNA樣品濃度(μg/μl)=OD260×核酸稀釋倍數(shù)×50；RNA樣品濃度(μg/μl)=OD260×核酸稀釋倍數(shù)×40。e．分析純度。當前51頁，總共93頁。A：測DNA：

純的DNA樣品OD260/OD280應為1.8，OD260m／OD230應大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。2)小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出現(xiàn)既含蛋白質又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。測定結果分析當前52頁，總共93頁。B：測RNA

純的RNA樣品其OD260／OD280應介于之間，OD260/OD230比值應大于2.0。1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說明有蛋白質或酚的污染；2）比值大于2.0時，可能被異硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。當前53頁，總共93頁。

2.溴乙錠熒光法測定核酸的含量

如果DNA和RNA的量很少或有較多雜質的情況下，其含量可用溴乙錠熒光法測定。原理：DNA、RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標準對照，可比較出被測DNA溶液濃度。

注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。當前54頁，總共93頁。（五）核酸的保存對DNA保存：①DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；

②長期保存樣品中可加入1滴氯仿。對RNA

保存：①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;②

長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;

③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復合物)凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。當前55頁，總共93頁?？俁NA提取目的1．了解某一特定組織或細胞某一特定mRNA轉錄量的變化，如PCR、Northernblot等。2．了解某一特定組織或細胞全部mRNA轉錄量的變化，如DD-PCR、基因芯片等。3．獲得某一特定組織或細胞全部mRNA，以便建立cDNA庫等。4．獲得某一特定組織或細胞全部RNA。以上工作的前提是制備純凈且完整的RNA。當前56頁，總共93頁。根據(jù)生物學“中心法則”原理，基因的表達包括轉錄與翻譯兩個階段。其中，由DNA到RNA的轉錄過程受到各種因素的調節(jié)，其調節(jié)水平反映出某種或某些特定的因素對相關基因表達的調節(jié)能力。RNA主要由rRNA（占總量的80-85％），tRNA和核內小分子RNA（占總量的10-15％）以及mRNA（占總量的1-5％）所構成。理論上認為每克組織（或108個培養(yǎng)細胞）可提取5-10mgRNA。當前57頁，總共93頁。提取總RNA的方法有多種，比如：1)酚/SDS法

2）采用Trizol試劑盒或類似的方法，稱為一步法，方便而快捷。缺點是RNA的獲得量偏低，質量不夠純凈。3）超離心方法，可以獲得豐富且質量高的RNA。缺點是實驗時間比較長，要求離心過夜。4）其它一些試劑盒，主要是利用某些特定的介質吸附RNA，洗去其它雜質，最后洗脫純凈的RNA。可以在短時間內獲得純凈的RNA。但是價格比較昂貴。當前58頁，總共93頁。植物總RNA提取(酚/SDS法

)當前59頁，總共93頁。材料

液氮研磨緩沖液：0.18mol/L

Tris0.09mol/LLiCL4.5mmol/LEDTA1%（W/V）SDS

用HCL調PH至8.2當前60頁，總共93頁。1mol/LTris的配法：在800雙蒸水中溶解121克Tris堿，用濃鹽酸調PH值，混勻后加水至1升。當前61頁，總共93頁。

要獲得所需PH值的1M

TrisHCL，可通過將一定數(shù)量的10MHCL和1升Tris堿混合，如下表所示:

當前62頁，總共93頁。0.5MEDTA的配制：在700ML雙蒸水中溶解186.1克Na2EDTA.2H2O，用NaOH調PH8.0（1000ML0．5MEDTA需加入20克NaOH），補加雙蒸水至1升。當前63頁，總共93頁。TLE緩沖液平衡酚TLE溶液:0.2mol/L

Tris0.1mol/LLiCL5mmol/LEDTA用HCL調PH至8.2，用等體積的PH8.0的TLE溶液抽提，然后再用TLE溶液至少抽提2次當前64頁，總共93頁。氯仿：異戍醇（24：1）8MOL/L和2MOL/LLICL溶液（DEPC處理，焦碳酸二乙酯）3MOL/L乙酸鈉（DEPC處理），將408克NaAc.3H2O溶于水，用3MOL/L乙酸調PH5.2，補加水至1升95%乙醇DEPC處理水當前65頁，總共93頁。試驗步驟：1、用液氮冷卻研缽，取15g低溫冷凍的植物組織，迅速置于研缽中，不時加入液氮以防止研磨過程中葉片融化，充分研磨后，立即轉移到一個盛有150ML研磨緩沖液和50mlTLE緩沖液平衡酚的500ml離心管中。2、加入50ml氯仿：異戍醇，于50℃加熱20min。18000g,4℃，離心20min。當前66頁，總共93頁。3、將上層水相轉移到一個新的離心管中，加入50mlTLE緩沖液平衡酚的500ml，混勻，再加入50ml氯仿：異戍醇，18000g,4℃，離心20min。當前67頁，總共93頁。4、用TLE緩沖液平衡酚抽提水相，直至兩面相間界面干凈為止，水相再以氯仿抽提。5、吸取上清液，加1/3體積的8M/LLiCL混合至終濃度為2M/L，4℃沉淀過夜，然后15000g，4℃，離心20min，沉淀以2-3ml2M/LLiCL溶液沖洗。6、沉淀以5ml水重溶，加入1/3體積的8M/LLiCL混合至終濃度為2M/L，于4℃深沉RNA兩小時以上。當前68頁，總共93頁。7、

15000g，4℃，離心20min，沉淀用2ml2M/LLiCL溶液沖洗，重溶于2ml雙蒸水，加入200ul3MOL/L乙酸鈉溶液和5.5ml無水乙醇，-20℃沉淀過夜或在干冰/乙醇中沉淀30min。8、18000g,4℃，離心15min，沉淀用1ml雙蒸水溶解，取10ul稀釋至1ml測OD260和OD280當前69頁，總共93頁。Trizol試劑盒方法原理本實驗類似于“異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用強RNA酶抑制劑異硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白質變性。離心后，RNA選擇性地進入無DNA和蛋白質的水相。之后通過異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌等，便可得到較為完整與純潔的總RNA。當前70頁，總共93頁。實驗步驟1．取50毫克植物細嫩組織，加入1mlTrizol液，剪碎，快速勻漿。2．22℃，靜置5min。3．加入氯仿0.2ml，顛倒15s。4．22℃，靜置3min。5．離心：4℃×15000轉/分×15min。6．取上清液0.45ml。7．加入0.45ml異丙醇，混勻。當前71頁，總共93頁。8．22℃，靜置10min。9．離心：4℃×15000轉/分×10min。10．棄上液。11．加入1ml4℃75%乙醇。12．離心：4℃×10000轉/分×5min。13．棄上液，真空干燥5min。14．用高壓消毒過的去離子水25ul水冰上溶解，-70℃保存。15．紫外分光光度計測定RNA的含量：當前72頁，總共93頁。取樣本5ul加入石英比色杯內，加入蒸水1ml，充分混勻。與蒸鎦水對照。讀260nm、280nm兩個測得值，記錄。計算：OD260為1時，為40ugRNA，所以計算如下：樣本RNA含量（ug/ul）=OD260*200*40/1000當OD值260/280<1.8時，提示有蛋白或酚的污染。當前73頁，總共93頁。實驗結果得到比較純凈的植物組織總RNA。分光光度計讀數(shù)260/280值為1.85±0.04。當前74頁，總共93頁。植物RNA提取中的一些特殊方法1、多酚類植物的RNA提?。?/p>

蘋果、棉花等多酚類植物提取RNA用TRIZOL一般提不出來。用下述方法提取的RNA純度不是特別高,但是用作northern足夠。（1）1.5ml離心管用液N2冷凍后加入0.1g樣品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,劇烈振蕩1-2min,冰上放置5min.

（2）4℃12000rpm離心15min,上清轉入新管,加氯仿異戊醇抽提一次

（3）取600ul異丙醇,-20℃沉淀20min.

（4）12000rpm離心10min

（5）沉淀用70%乙醇洗

（6）8000rpm5min

（7）沉淀晾干,溶于30ulDEPC水

當前75頁，總共93頁。2、纖維組織：

心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關鍵在于徹底破碎組織。這些組織細胞密度低，單位重量的組織RNA的含量就少，建議用盡可能多的起始量。使用TRNzol法可以提取纖維組織終RNA，由于纖維組織終RNA含量較少，可按照增加的起始量成比例增加TRNzol的用量，并在液氮中將組織徹底磨碎，同時適當減少溶解RNA的溶液體積。當前76頁，總共93頁。3、蛋白/脂肪含量高的組織：

動物的腦和某些特殊的植物組織中，脂肪或者蛋白的含量很高，可以采用TRNzol來提取此類樣品中的RNA。在該提取過程中，用氯仿抽提后，如上清仍含白色絮狀物，必須用氯仿再次對上清進行抽提。使用TRNzol提取脂肪含量高的組織中RNA時，使用氯仿抽提后會分成油滴、水相（含RNA）、DNA中間層、有機相四層，應用移液管小心吸取水相液體，避免吸到油滴層和DNA層。當前77頁，總共93頁。4、核酸/RNase含量高的組織：

脾、胸腺、胰臟等組織的核酸和核酸酶含量很高，可以在液氮中碾磨組織，再快速勻漿。如果裂解液太粘稠（因為核酸含量高的緣故），酚/氯仿抽提不能有效分層，可以加入更多裂解液以解決此類問題。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成則表明有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提，去除DNA污染。

當前78頁，總共93頁。5、植物組織和真菌組織：植物組織和真菌組織比動物組織更為復雜，因此為了避免出現(xiàn)內源酶作用使RNA降解的現(xiàn)象，一般選擇在液氮條件下對植物或者真菌材料進行碾磨。如果降解問題不能解決，基本上是由于樣品中的內含雜質導致。許多植物和真菌中的內含雜質如多糖、多酚等都會殘留，因為這些雜質分子與RNA有一些相似性，可以與RNA同時沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的RNA提取過程中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑（RNAplant）來去除多糖多酚等雜質的干擾和污染。當前79頁，總共93頁。病毒RNA提取方法異硫氰酸胍提取法:

實驗步驟：

1、取200ul樣品數(shù)+陰性對照+陽性對照個1.5ml滅菌eppendorf管。

2、加600ul異硫氰酸胍，然后加入對照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻。

3、13000rpm離心15min。

4、在第3步離心快結束時，另取同樣多eppendorf管，加入400ul-20度預冷的異丙醇。當前80頁，總共93頁。5、取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結束往外拿的時候，管子盡量不要傾斜）轉移到第4步準備的管中，顛倒混勻。

6、13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體。

7、加600ul75％乙醇，顛倒數(shù)次以洗滌殘存異丙醇。

當前81頁，總共93頁。8、13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體。9、4000rpm離心10s，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干，室溫干燥2－3min（不可過分干燥，防止下一步RNA不溶解）。10、加入20ulDEPE水(加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水)，輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5s，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ詈?小時內使用，以免RNA降解）。當前82頁，總共93頁。RNA提取注意事項一些RNA提取方法，在進行具體實驗時，應根據(jù)研究對象的性質，提取核酸的用途而對上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。

1、在核酸提取時，為了增加細胞的裂解度，增加核蛋白復合體破碎度，以釋放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在確保沒有核酸水解酶存在的前提下，酶反應時間越長越好。

當前83頁，總共93頁。2、有時在使用蛋白酶時，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL，并且可將反應溫度提高到50－60℃，并將反應時間縮短到15－25min，但酶用量必須提高10－20倍。溶菌酶使用時緩沖液中需加EDTA，因游離金屬離子對酶有抑制。

當前84頁，總共