細胞內(nèi)細胞因子的流式細胞儀檢測

細胞內(nèi)細胞因子的流式細胞儀檢測一、簡介（limitingdilutionLDA）和單細胞PCR，應用原位雜交技術和免疫組化方法觀察細胞因子蛋白表達及mRNA表達可以識別Th1Th2細胞，此方法可獲得較強的細胞內(nèi)信號，但此方法工作量大、主觀性強，難以進行大樣本檢測，且人肉眼識別能力有很大的局限性，而ELISPOT及單細胞PCR技術，技術性強T－與些研究很難外推，因為T細胞與體內(nèi)T細胞功能相關性還未被揭示。與Picker采用了monensinPMA等藥物預孵，用Brefeldin(BFA)Monensin阻斷了胞內(nèi)高爾基體介導的轉運的方法使得細胞因子聚集淋巴細胞產(chǎn)生少量的細胞因子，通常要對T淋巴細胞體外活化進行研究。在體外淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子已釋放出來，胞內(nèi)細胞因子信號較弱，難以進行檢測。這1型與2(TBNK)不能分泌細胞因子。胞內(nèi)流式分析法是用抗細胞因子抗體與細胞表面或胞內(nèi)特定亞群標志組合景。具有其它方法難以比擬的優(yōu)點：???????快速：流式定量檢測細胞內(nèi)細胞因子可在一天內(nèi)完成，實驗流程需6-8小時，實際操作時間為1-2小時，快速簡便；????????簡便：無需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無需分離PBMCs；???????靈敏度高：高度靈敏的熒光標記與檢測系統(tǒng)；???????高效：可以在同一個細胞內(nèi)同時檢測兩種或更多種細胞因子，也可根據(jù)細胞免疫表型區(qū)分分泌細胞因子的細胞的亞型，進行多參數(shù)相關分析；???????安全：減少樣本處理與生物源性污染????????接近生物體的分析條件：全血檢測保留細胞及生化微環(huán)境更準確反映了體內(nèi)狀況。二、所需儀器1.流式上樣管及細胞培養(yǎng)皿或板2.25%CO2，37℃孵箱?混勻振蕩器離心機?Tips流式細胞儀三、常用的標本類型和處理方法全血EDTAACD8小時內(nèi)分析，超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少。如不能在8內(nèi)檢測，應將真空采血管水平室溫放置。自身血漿中外周血單個核細胞(PBMCs)：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時內(nèi)分析。Ficoll分離10%(FBS)的RPMI－16402×106細胞/ml。細胞系與T細胞克?。赫{(diào)節(jié)細胞濃度2×106細胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中。PBMCs1×紅細胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBSBSA10%的DMSO的PBS℃凍存。溶化后細胞置于染色管中，加上2～3mL5分鐘后，用破膜劑對細胞進行破膜和染色。四、所需試劑1、細胞表面染色的熒光標記的單抗試劑依據(jù)實驗需要選擇特殊表面標志CD45CD3圈定T淋巴細胞CD4圈定T輔助淋巴細胞亞群CD8圈定T抑制淋巴細胞亞群CD19/CD20圈定BCD56圈定NK淋巴細胞CD14圈定單核細胞2提供FITC、PEAPC標記的細胞因子抗體3、溶血素：用外周全血檢測時需使用溶血素（R&D目錄號WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目錄號00-4333）溶解紅細胞4、激活劑①?????Phorbol12-Myristate13Acetate(PMA)（Alexis，目錄號ALX-445-004-M001）DMSO0.1mg/mL分裝(20L)，－20℃儲存。勿反復凍融每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS1：100D.PMA25ng/mL細胞懸液②Ionomycin?（Alexis,目錄號ALX-450-006-M001）A.??????0.5mg/mLB.??????－20℃儲存C.?????每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS1：10稀釋儲存液D.?????Ionomycin終濃度1g/mL細胞懸液③?????StaphylococcalenterotoxinB(SEB)(Sigma,CatalogNo.S-4881)A.????無菌無疊氮鈉PBS0.5mg/mLB.????4℃儲存C.???SEB終濃度10g/mL細胞懸液④?????CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉運抑制劑存在下活化未稀釋的血液細胞⑤?????CD28：加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應，濃度一般為10ug/ml5、阻斷劑阻斷高爾基體介導的轉運作用，使得刺激細胞表達的細胞因子聚集在胞漿內(nèi)Brefeldin-A(BFA)（eBioscience00-4506）DMSO5mg/mL分裝(20L)，-20℃儲存。勿反復凍融。每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS1：10稀釋儲存液4－5小時BFA10g/mL注意：BFA過度孵育會導致細胞活力下降②Monensin（eBioscience6、不含谷氨酰胺的RPMI-16407、固定劑：細胞在體外刺激后需要對細胞進行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細胞因子固定在細胞內(nèi)，另一方面避免細胞表面抗原丟失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目錄號00-8222）8、10.0％疊氮化鈉的HanksHBB（eBioscienc將細胞膜穿孔，已利于熒光標記的細胞因子抗體進入細胞內(nèi)，于相應的細胞因子結合9、其它試劑：無菌無疊氮鈉PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲存。五、細胞培養(yǎng)和刺激的基本方法劑和刺激時間，以獲得最佳的實驗結果。下表提供了檢測一些常用細胞因子的推薦的活化方法。表1、細胞內(nèi)細胞因子流式檢測推薦的陽性對照活化方法檢測細胞因子檢測細胞因子陽性對照刺激方法IFN-g2(4-24TIMP-15TNF-?7(6小時)IL-1a3(6小時)人IL-2IL-4人IL-5人IL-6人IL-8/CXCL8人MCP-1/CCL2MIP-1a/CCL3MIP-1b/CCL4RANTES/CCL5IL-2IL-4IL-5IL-6IFN?

方法3(24小時)方法2(4-24小時)41單核細胞：方法3(6-12小時)T細胞：方法618313(243(243(243(2419101011方法9or方法12方法94-6(monensin，10mg/ml的BFA)方法1:?只使用轉染細胞檢測2:人的PBMCs使用PMA(10ng/ml)Ionomycin(1uM)4-24小時.3:人的PBMC使用LPS(0.5-1ug/ml)24小時.方法4:人的PBMCs或者純化的CD細胞在包被人CD3IL-2（10202-IL-010）和IL-4（10204-IL-005）胞洗滌后在含有重組人IL-2IL-42PMA(10ng/ml)Ionomycin(16小時5:CD4T細胞使用PHA(10ng/ml)4days6:T細胞使用抗CD3的單抗、抗CD28的單抗和重組人的IL-1b(Lorre,et1994,ClinImmunoImmunopath70:1)7:使用PMA(50ng/ml)Ionomycin(500刺激8:PBMCs細胞使用重組人IFN(10285-IF-100)2IFN(10ng/ml)+LPS(1ug/ml)22小時或者使用相同的方法刺激THP-1.9:EL4在包被抗小鼠CD3(25ug/ml)的培養(yǎng)板中，使用抗CD28抗體(2ug/ml)PMA(5ng/ml)+Ionomycin(500ng/ml)6小時方法10:CDT細胞在包被小鼠CD3(25ug/mlCD28(2ug/ml)404-ML-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；然后在含有重組小鼠IL-2IL-43天；最后收獲細胞，使用PMA(5ng/ml)、Ionomycin(500和monensin6小時。11:ip巨噬細胞使用Mouseip1ug/mlLPS24小時方法12:小鼠脾細胞使用PMA(5ng/ml)和Ionomycin(500ng/ml)刺激6小時六、流式檢測細胞染色基本過程（以全血為例）1、收獲細胞：肝素鈉抗凝的靜脈血，按1：1與培養(yǎng)基混勻，加刺激劑，同時加蛋白轉運抑制劑（參照說明書），4-62、阻斷Fc受體：用于消除非特異性的結合染色①?在小鼠，可使用純化的FcII/III受體的抗體（CD16/32），按照1ug/106細胞的用量，在染色緩沖液中4℃孵育15分鐘，PBS清洗后，直接進行下一步染色。②對于人和大鼠，可直接使用過量的與熒光抗體相同來源和亞型不相關的純化Ig斷3、細胞表面染色①?20L于Falcon100L(15分鐘；②?加入溶血素，室溫暗處孵育10分鐘。（注意：PMA激活的全血可能會溶血不完全。）③離心500g5分鐘，棄上清4、固定和破膜①?加固定劑，室溫暗處孵育15分鐘，離心500g5分鐘，棄上清；②?加破膜劑溫暗處孵育10分鐘。（劑量參照說明書）③?23mLPBS500g55、細胞內(nèi)染色①?加入熒光標記的細胞因子抗體，混勻，室溫暗處孵育30分鐘。②?23mL500g5分鐘，棄上清，加入500LPBS500L1%PFA固定后再上機七、注意事項?標本處理：避免使用絡合鈣的抗凝劑，如ACDEDTA，因為它們會限制鈣依賴性激活過程，推薦用肝素鈉。此外LPS8小時內(nèi)分析，超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少。如不能8小時之內(nèi)檢測，應將真空采血管水平室溫放置。效果。比如，要檢測PMAIonomycin同時刺激；如果用CD4做表面標記，由于多數(shù)病人的CD4抗原會因PMA小時為宜，否則CD4下調(diào)影響分析選擇合適的對照：為保證結合的真是和可靠性，至少熒光設置以下對照：①未刺激對照：激活時由于BFA的存在抑制了胞內(nèi)蛋白的轉運，因此在激活過程中產(chǎn)生?的抗原與細胞因子會滯留胞內(nèi)，未刺激對照也應包含BFA。②?CD69CD69期望的水平，驗。由于抗體非特異性結合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色。?Fc受體阻斷：使用試劑阻斷Fc受體可以有效減少非特異熒光染色，在小鼠可以用純化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience,14-0161-81），在大鼠可以用純化的抗大鼠的CD32可以用過量的同種無關純化Ig或血清。??熒光素的選擇：檢測相對低表達細胞因子如IL-4時，應選用PE或APC胞因子時最好也選用PEAPC標記；同時檢測多種細胞因子時，弱表達的應選用PEAPC，F(xiàn)ITC標記最好用于高表達細胞因子如IFN-γ八、問題與解答問題 原因 解決細胞未激活制備儲存一節(jié)。

注釋PMA+Ionomycin4CD3+TCD69應>90%Ca無CD69胞內(nèi)染色

使用了錯誤的抗凝劑 素鋰避免使用ACD與等絡合鈣的抗凝劑。在使用通透液前先使用溶細胞未通透血素BFABFA-20℃

抗凝劑會影響激活。溶血素輔助細胞通透BFA失活或制備不當 詳見BFA制備儲存胞內(nèi)染色陽性但很弱

抗細胞因子抗體濃度不對 按R&D推薦量使用熒光抗按操作程序通透后洗細胞通透后細胞在胞內(nèi)染色前未洗再胞內(nèi)染色

正常的激活T淋巴細胞IL-4表達通常<2%，應使用PE或APC標記背景染色熒光單抗不純或熒光與抗體太高 合不牢導致解析出的熒光染

R&D

使用試劑阻斷Fc受體可以有效減少非特異熒光染色，詳見Fc段受非特異結合非特異結合體阻斷節(jié)抗體與固定后的胞內(nèi)抗原親和使用R&D力低，需提高抗體濃度。IgR&DR&D過高的同型對照試劑胞損失洗滌離心步驟丟失細胞固定后細胞密度低于活細胞，需固定通透的細胞離心500g用高轉速離心。加樣步驟丟失細胞 棄上清帶走細胞 小心吸樣按操作步驟用FL3PMAPMA+I溶血不完全PMA+Ionomycin除碎片和未溶細胞全血較難溶溶血未在室溫進行 在室溫進行溶血Th1/Th2細胞研究方法Th1/Th2Th1和Th2細胞仍然是目前最有效的手段，特別是細胞內(nèi)因子標記的流式細胞技術。近來由于細胞因子ELISA試劑盒的不斷涌現(xiàn)，為研究Th1/Th2細胞因子譜的變化提供了準確、可靠、快速的測定方法。但研究CD4+淋巴細胞細胞因子譜變化時需要將T除CD4細胞也存在Th1和Th2樣細胞因子譜的變化，甚至酸性粒細胞也具有產(chǎn)生多種細胞因子的能力，如酸性粒細胞可分泌IL-4IL-5IL-1αIL-6IL-8TNFαTGF等。因此單純通過細胞因子譜的變化難以有效識別Th1Th2細胞。根據(jù)T(CD4)(cytokineprofiles),將CD4細胞分為Th1和Th2Th1細胞主要分泌(IFN-γ)-2(IL-2)-β(TNF-β),介導細胞免疫應答；而Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10IL-13等因子，促進抗體的產(chǎn)生，介導體液輔助淋巴細胞并不產(chǎn)生典型的Th1或Th2細胞和相應的細胞因子，而主要是由Th0細胞受特異抗原的刺激時，一方面向Th1方向發(fā)展，另一方面可能向Th2方向發(fā)展。如在結核感染轉狀態(tài)下可產(chǎn)生Th1和Th2雙向免疫反應，在I型超敏反應疾病時主要產(chǎn)生以Th2為主的免疫反應。近幾年來研胞儀進行Th1/Th2的檢測克服了傳統(tǒng)方