課題申報書-NO釋放型非甾體抗炎藥的開發(fā)研制

H湖北省科技攻關(guān)計劃課題申請書項目名稱：NO釋放型非甾體抗炎藥的開發(fā)研制課題名稱：抗風(fēng)濕病新藥NO釋放型噁丙嗪前藥的開發(fā)研制申請單位：主管部門（單位）：教育部課題負責人：聯(lián)系電話：湖北省科技廳制H

H2001年12月15日H

H計算機信息簡表項目名稱課題名稱NO釋放型非甾體抗炎藥的開發(fā)研制抗風(fēng)濕病新藥NO釋放型噁丙嗪前藥的開發(fā)研制課題領(lǐng)域1、工業(yè)；2、農(nóng)業(yè)；3、社會發(fā)展；4、軟科學(xué)將本課題組自行研制開發(fā)的二類新藥新型非甾體抗炎藥噁丙嗪與硝課題酸酯有機合成，制得NO釋放型噁丙嗪前藥，通過體內(nèi)釋放母藥及內(nèi)容摘要NO發(fā)揮各自的抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛及黏膜保護，細胞因子調(diào)節(jié)以及抑制炎癥細胞的黏附和激活作用,初步完成新藥臨床前藥效學(xué)、藥動學(xué)及毒理學(xué)研究，開發(fā)出兼具抗炎及免疫抑制功效，且不良反應(yīng)輕的，具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的抗風(fēng)濕病一類新藥。（150字以內(nèi)）承擔單位名稱詳細地址行政主管部門武漢市航空路13號郵政編碼法人代表承擔單位法人代碼承擔單位機構(gòu)代碼AA、事業(yè)型研究單位（即沒有改制的研究單位）；AB、大專院校；AC、政府機關(guān)；AD、群眾團體；AE、其它事業(yè)單位；單位BA、科研型企業(yè)（即轉(zhuǎn)制為企業(yè)后的科研院所）；BB、全民所有制企業(yè)（即國有企業(yè)）；BC、集體所有制企業(yè)；BD、個人獨資企業(yè)；BE、合伙制企業(yè)；BF、股份有限公司；BG、有限責任公司；類別GH、股份合作制企業(yè)；GI、中外合資企業(yè)；GJ、中外合作經(jīng)營企業(yè)；GK、外商獨資企業(yè)；GL、港、澳、臺投資企業(yè)；GM、其它企業(yè)H

H單位所在地區(qū)武漢市B01黃石市B02宜昌市B05襄樊市B06荊門市B08孝感市B09十堰市B03鄂州市B07荊州市B10黃岡市B11咸寧市B12隨州市B13恩施州B28仙桃市B94天門市B96神農(nóng)架B97潛江市B95課題聯(lián)系電話聯(lián)系人—1—H

H一.課題的研究意義和必要性風(fēng)濕性疾病(簡稱風(fēng)濕病)是一組涉及肌肉骨骼系統(tǒng)、關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)周圍軟組織，并以疼痛癥狀為主的慢性疾病。其發(fā)病率高，致病機制復(fù)雜，治愈率低，對該病的治療學(xué)研究一直是國內(nèi)外藥物研究領(lǐng)域的熱點?？癸L(fēng)濕藥往往分為改善癥狀的藥物（NSAIDs）和控制關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)受損的藥，即慢作用抗風(fēng)濕藥物（SAARD）或改變病情抗風(fēng)濕藥（DMARD）兩大類。大多數(shù)NSAIDs的共同特點是既抑制炎癥部位的PGs生物合成，也抑制對胃黏膜有保護作用的胃腸道的PGs生成。所以長期大量服用該類藥物可導(dǎo)致胃腸道潰瘍、出血甚至穿孔等嚴重副作用。慢作用抗風(fēng)濕藥物多為免疫制劑或生化制劑，通過抑制滑膜組織中致炎淋巴因子的形成和表達，阻止淋巴細胞的過度增殖浸潤及抗體的產(chǎn)生，同時阻遏膠原酶及基質(zhì)溶解等金屬蛋白酶和過氧化物的生成，促進膠原的合成而發(fā)揮作用。目前一些免疫及生化制劑已應(yīng)用于臨床，但由于病例數(shù)尚少，藥物對風(fēng)濕病的療效及安全性尚待進一步觀察。對風(fēng)濕病的治療，臨床大多首先采用NSAID迅速改善癥狀緩解疼痛，再將兩類藥結(jié)合應(yīng)用，力求逐步根治疾病。兩類藥物使用過程中各有其利弊，傳統(tǒng)治療方法雖在治療上達到一定目的，但給病人在經(jīng)濟上和用藥的依從性上帶來難題，尤其在中國問題更為突出。如何將風(fēng)濕病的對癥與對因治療有機的結(jié)合起來，研制開發(fā)出高效，低毒、用藥方便的一類抗風(fēng)濕新藥，既能解決臨床實際問題，又能適應(yīng)醫(yī)療改革的需要，是我國加入WTO后醫(yī)藥界面臨的巨大挑戰(zhàn)。本課題組在自行研制開發(fā)成功國家二類新藥新型非甾體抗炎藥噁丙嗪的基礎(chǔ)上，又再接再厲，設(shè)計并初步合成和鑒定出NO釋放型噁丙嗪前藥即將噁丙嗪與硝酸酯有機合成，本課題欲進一步通過藥物化學(xué)、體內(nèi)過程及藥效學(xué)研究完成新藥臨H

H床前研制工作，開發(fā)出可在體內(nèi)釋放噁丙嗪及NO發(fā)揮各自的抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛及黏膜保護，細胞因子調(diào)節(jié)以及抑制炎癥細胞的黏附和激活作用,半衰期長，副作用輕的，可從根本上治愈困擾廣大患者的風(fēng)濕性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎、強直性脊椎炎等疼痛性炎癥，具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥。H

H5．JohnL.Wallace.Gastroenterology1997;112:1000-10166.StefanoFiorucci,etal.Gastroenterology1999;116:1089-1106二.相關(guān)領(lǐng)域國內(nèi)外技術(shù)現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢長期以來，胃腸道副作用一直是限制傳統(tǒng)NSAIDs在臨床上廣泛應(yīng)用的主要原因。降低消化道毒副作用是近年來開發(fā)新型NSAIDs的基本立足點，目前受關(guān)注的主要有以下幾類藥物和治療方法：（1）還氧酶-2選擇性抑制劑，如美洛昔康，Celecoxib；（2）還氧酶和5-脂氧酶的雙重抑制劑，如處于臨床研究階段的ML-3000，F(xiàn)lobufen等；（3）前體藥物，如Piroxicam的前藥Ampiroxicam;(4)局部抗炎藥，如Tepoxalin的眼用制劑和用于腸道炎癥的Balsalazide等；(5)合并用藥，即將傳統(tǒng)的NSAIDs如萘丁美酮、雙氯酚酸等與米索前列醇或質(zhì)子泵抑制劑、H2-受體阻斷劑聯(lián)用；（6）NO釋放型NSAIDs。NO是一種信使物質(zhì)，參與體內(nèi)種多生理功能的調(diào)節(jié)。在胃腸道系統(tǒng)中，NO發(fā)揮著與PGs相似的調(diào)節(jié)黏膜完整性和黏膜血流量的作用。同時低濃度的NO可抑制調(diào)節(jié)細胞凋亡的Caspases活性,減少促炎細胞因子的分泌和自由基生成發(fā)揮抗炎免疫抑制效應(yīng)。NO釋放型NSAIDs在國外引起了極大的興趣，研究結(jié)果表明藥物可在體內(nèi)迅速釋放出NO和NSAIDH

Hs，一方面保留抗炎解熱鎮(zhèn)痛作用，另一方面明顯減輕胃腸道黏膜損害。藥物雖處于臨床前研究階段，且國內(nèi)尚無開發(fā)研制，但它是NSAIDs研究應(yīng)用的發(fā)展趨勢，因為它除了具有以上特點外還可以加強NSAIDs的抗炎作用，其應(yīng)用可從根本上改變風(fēng)濕病的藥物治療模式。除本課題組研制外，NO釋放型噁丙嗪前藥的合成國內(nèi)外均未見報道。噁丙嗪具有具有較好的藥代動力學(xué)特征，半衰期長(約60小時),胃腸道不良反應(yīng)較輕,患者用藥安全、方便，但其藥理作用相對于消炎痛、布洛芬、匹羅昔康等非甾體抗炎藥較弱，使其應(yīng)用前景受到限制。因此將能釋放NO的結(jié)構(gòu)引入藥物分子中，除了發(fā)揮母藥的作用優(yōu)勢外還可拓寬其作用范圍，加強其功效，應(yīng)用前景將是不言而預(yù)的。參考文獻1.姚和權(quán)，等。藥學(xué)進展2000；24（2）：84-882.李瑞文，等。藥學(xué)進展2000；24（3）：145-1483．StefanoFiorucci,etal.JImmunology2000;165:5245-52544.AzizKarim,etal.JClinPharmacology1997;37:267-278三.市場需求分析1．隨著生命科學(xué)和人民生活水平的提高，人類對藥物的要求從以前的有效性、安全性，向高效、低毒性發(fā)展。根據(jù)WTO對今后十年世界性新藥的研究動態(tài)分析顯示，抗風(fēng)濕藥為名列前茅的10類藥物之一，即為當今重點研究開發(fā)藥物。2．噁丙嗪于1986年由日本研制成功并投放市場。九十年代中葉我院陳幫銀教授研制開發(fā)出二類新藥，投放我國市場。目前，在我國其年銷售額約8000萬元。H

HNSAIDH

Hs是世界范圍內(nèi)處方量最大及銷售量最大的藥品，其中，噁丙嗪名列第八，作為抗風(fēng)濕病的一線用藥。3．NO釋放型噁丙嗪屬一類新藥，其療效強于噁丙嗪，副作用則比噁丙嗪更輕，且用藥方便。目前風(fēng)濕病特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，尚無安全、高效治療藥物。因此藥物若能迅速研制成功，便可獲得知識產(chǎn)權(quán)的保護而進入國內(nèi)外市場，成為抗風(fēng)濕病藥物的主力軍，給廣大患者帶來福音，在不久的將來其市場前景將不可估量。四．課題攻關(guān)預(yù)期目標,具體的考核指標(含主要技術(shù)經(jīng)濟指標)1．藥物化學(xué)：合成NO釋放型噁丙嗪前藥，通過紅外光譜、質(zhì)譜檢測結(jié)構(gòu)的正確性2.藥效學(xué)：（1）通過整體動物疾病模型確證藥物的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用，且強于母藥噁丙嗪；（2）結(jié)合RIA法測定滑膜液PGE2含量,脾細胞Caspases活性及促炎細胞因子TNF-,INF-等檢測,證明該藥融合抗炎及免疫抑制兩方面作用特點。（3）通過胃黏膜病理學(xué)觀察及胃主細胞體外凋亡實驗，證實該藥副作用較噁丙嗪輕.3.藥代動力學(xué)：（1）采用HPLC法,間接測定前藥在體內(nèi)代謝產(chǎn)生游離NO，及藥時曲線.結(jié)合藥效學(xué)進一步證明NO可加強噁丙嗪抗炎作用。（2）GC及HPLC法測定血漿噁丙嗪穩(wěn)態(tài)濃度及藥時曲線,證實前藥的成H

H合成，以及母藥的完整釋放H

H五．課題主要研究內(nèi)容、工藝路線、關(guān)鍵技術(shù)(一)NO釋放型噁丙嗪前藥的合成(二)NO釋放型噁丙嗪前藥的藥效學(xué)和毒副作用實驗1.藥物治療作用通過小鼠模擬人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型觀察前藥與噁丙嗪對疾病治療的不同之處2.作用特點（1）活體標本顯微鏡法觀察藥物對白細胞血管內(nèi)皮浸潤的影響,證明NO抗炎作用的存在.（2）體內(nèi)NO釋放量與致病小鼠關(guān)節(jié)腫脹度關(guān)系,提供NO加強噁丙嗪抗炎作用的依據(jù)。3．作用機制RIA法檢測關(guān)節(jié)滑膜液PGE2含量；熒光法測定巨噬細胞內(nèi)Caspases(即IL-1β轉(zhuǎn)化酶樣蛋白酶)活性;ELISA法動態(tài)測定脾淋巴細炎癥因子TNF-,INF-,IL-1β分泌量,闡明該前藥的抗炎作用機制.4．胃腸道副作用胃黏膜損傷的病理學(xué)觀察及胃主細胞凋亡的體外檢測(三)NO釋放型噁丙嗪前藥體內(nèi)過程的測定H

H1.采用HPLC法,通過測定血漿硝酸鹽含量，間接測定體內(nèi)NO釋放量以及藥時曲線2．GC和HPLC測定噁丙嗪血漿穩(wěn)態(tài)濃度，藥時曲線及消除半衰期六．課題的主要技術(shù)特點和創(chuàng)新點，可能取得專利（尤其是發(fā)明專利和取得國外專利）及知識產(chǎn)權(quán)分析1．本課題將既具黏膜保護作用又有抗炎免疫抑制作用的細胞信使分子NO與新型非甾體抗炎藥噁丙嗪結(jié)合，兩者優(yōu)勢互補，研制成藥效強，副作用輕的抗風(fēng)濕病一類新藥。2．課題設(shè)計上將抗風(fēng)濕病治療中的兩大類藥物作用融合到一個化合物，研究技術(shù)涉及儀器分析、分子免疫及藥代動力學(xué)的先進手段，充分發(fā)揮了藥學(xué)院及醫(yī)學(xué)院重點實驗室的優(yōu)勢。3．NO釋放型噁丙嗪合成成功及藥效學(xué)實驗初步完成便可申報新化合物專利因在國內(nèi)外各種文獻中均未見報道。新藥臨床前實驗完成后可申請一類新藥證書，最終取得獨立的知識產(chǎn)權(quán)。七．課題實施年限及年度計劃安排1．課題如獲批準將立即組織實施計劃用三年時間完成2.年度計劃安排（1）2002.6--2002.12，合成NO釋放型噁丙嗪前藥H

H（2）2003.1--2003.6，進行新化合物結(jié)構(gòu)鑒定（3）2003.7--2003.12，進行體內(nèi)藥效學(xué)實驗及毒副作用研究。處理實驗數(shù)據(jù),整理實驗材料,申報新化合物專利（4）2004．1—2004.6完成體外及半體外作用機制研究（5）2004.7—2004.12進行藥代動力學(xué)試驗（6）2005.1-2005.6總結(jié)實驗結(jié)果,若獲其他基金資助,完成新藥臨床前實驗研究,并準備新藥申報材料。八．課題總投資預(yù)算、安全措施及來源渠道1.總研究經(jīng)費：其中：自籌經(jīng)費：科技撥款：8.002.006.00萬元萬元萬元分年度撥款概算：2002年2.00萬元2003年2.002.00萬元萬元2004年2.經(jīng)費使用預(yù)算：支出科目金額計算根據(jù)及理由（萬元）合計6.00科研業(yè)務(wù)費0.900方法引進、調(diào)研、學(xué)術(shù)交流及業(yè)務(wù)資H

H料費H

H實驗費4.00生化試劑、實驗動物、原代細胞等儀器設(shè)備費0.50補充玻璃儀器、強力攪拌器、色譜柱等協(xié)作費0.50HPLC、IR、RIA、質(zhì)譜、電鏡等測試費管理費0.100水、電等安全管理九．課題預(yù)期成果的經(jīng)濟、社會、環(huán)境效益分析、與國內(nèi)外同類技術(shù)的競爭力分析，成果應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化前景分析1．非甾體抗炎藥在抗風(fēng)濕病治療中起迅速緩解癥狀作用，應(yīng)用十分廣泛，位于處方量之首，因此陳幫銀教授的二類新藥噁丙嗪研制成功后，立即開發(fā)投放市場，獲得年銷售額8千萬元的驕績。2．NO釋放型噁丙嗪前藥設(shè)計思路新穎，將抗風(fēng)濕病治療的兩種措施有機結(jié)合制備工藝簡單，對環(huán)境污染小，使用方便安全，綜合比較而言，既可為患者消除病痛，滿足其特殊的消費要求可又為企業(yè)帶來巨大效益。3．目前國內(nèi)外均無研制報道，該產(chǎn)品的開發(fā)成功將迅速產(chǎn)業(yè)化，獲的知識產(chǎn)保護，在國內(nèi)外市場具有強有力的競爭性，為中國制藥行業(yè)的持續(xù)發(fā)展及走向世界帶來機遇。十．課題的風(fēng)險分析（含技術(shù)、市場的風(fēng)險分析等）本開發(fā)研究在技術(shù)、工藝等方面不存在問題，研究有一定基礎(chǔ)且研究者已掌握其關(guān)鍵技術(shù)和方法。噁丙嗪為陳幫銀教授開發(fā)研制，原料來源也不成問題。市場調(diào)研前景廣闊。風(fēng)險主要來自兩個國內(nèi)研究的共同方面，一是資金籌措問題，若有足夠的開發(fā)研究經(jīng)費，必將大大加快本項目的開發(fā)研究，盡快獲得專利保護；二是協(xié)調(diào)組織管理和各方面的關(guān)系問題，理順了這些關(guān)系，問題就迎刃而解。H

H十一.課題的基礎(chǔ)條件（與課題相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)、設(shè)備基礎(chǔ)和工作基礎(chǔ)）1．藥物合成方面：在對噁丙嗪多年研制開發(fā)基礎(chǔ)上積累了豐富的經(jīng)驗，完善了藥物合成的技術(shù)條件。課題組已用半年時間合成了目的化合物，并通過IR、MS檢測證明結(jié)構(gòu)無誤。2．已將實驗室進行了大規(guī)模改造，投資引進了與實驗檢測相關(guān)的大型儀器設(shè)備，現(xiàn)已有IR、HPLC、MS等，可保證研發(fā)的順利進行。3．藥效學(xué)實驗已通過動物模型初步確定其抗炎作用，本課題組具備整體動物實驗，體外細胞培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫檢測、熒光分光光度測定等與實驗相關(guān)技術(shù)和設(shè)備。十二.課題的關(guān)聯(lián)行動，相關(guān)的基本建設(shè)、技術(shù)改造技術(shù)引進、國際合作等落實情況，與其他相關(guān)湖北省科技計劃（工作）、項目的銜接和分工課題部分工作在藥學(xué)院中藥藥理實驗室完成，該實驗室已引資200萬元組建分子靶點體外篩選工作平臺。本課題組曾獲省自然基金資助，其中的細胞因子檢測和免疫組化方面與本課題有相關(guān)性，可穿插在該項目研究中。十三.課題的組織管理及相關(guān)保障措施課題第一階段由以陳幫銀教授帶頭的研究小組進行，負責人協(xié)調(diào)合成與結(jié)構(gòu)檢測工作，第二階段由課題負責人組織藥效學(xué)研究，并協(xié)調(diào)H

H**教研室的指標測定，第三階段仍由課題負責人組織體內(nèi)過程研究，協(xié)調(diào)完成。各教研室合作工作可得到科研管理部門協(xié)助落實。H

H十四.課題負責人背景資料課題主要參加人員姓名性別年齡專業(yè)特長職稱、學(xué)歷工作單位簽名H

H十五、承擔單位意見課題負責人為本單位科研及教學(xué)骨干，從碩士畢業(yè)起，承擔多項省級課題研究，課題完成情況較好，與他人協(xié)作獲得化合物專利一項，完成較高水平論文數(shù)篇。該項課題是在長時間工作積累基礎(chǔ)上，進一步深入研究開發(fā)，希望在藥學(xué)院研制出第一個一類新藥。該課題設(shè)計新穎，方法可行，集中與藥學(xué)相關(guān)的多種學(xué)科，人員業(yè)務(wù)素質(zhì)高，事業(yè)心強，有良好的科研協(xié)作精神。若課題獲得資助，我單位會盡力組織協(xié)調(diào)各方人員，充分保障研究設(shè)備條件，使課題順利完成。***2001．12．15十六、主管部門審查意見十七、省直有關(guān)部門或市州科技局意見H

H登記序號：項目編號：中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研項目課題設(shè)計書H

H課題名稱：痛痹顆粒對骨關(guān)節(jié)炎細胞凋亡和增殖的機理研究申報單位：課題負責人：計劃年限：江蘇省中醫(yī)院朱萱萱郵政編碼：210029聯(lián)系電話：86617141—30306申報日期：江蘇省中醫(yī)藥局制填寫提綱一、立項依據(jù)：與選題直接相關(guān)的國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢；選題的理論和實踐依據(jù)；研究目的、意義；本研究達到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會經(jīng)濟效益和應(yīng)用推廣前景。二、科研假說或技術(shù)構(gòu)思，主要研究內(nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標（達到的主要技術(shù)指標或技術(shù)經(jīng)濟指標），技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。三、研究試驗方法及技術(shù)路線（工藝路線）。四、現(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：開展本項研究的技術(shù)優(yōu)勢，現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備及應(yīng)用合格實驗動物的基本條件等；已有工作基礎(chǔ)，預(yù)試驗情況。H

H五、計劃進度：根據(jù)總的研究期限、年度計劃進度，分別列出具體的目標和進度的考核指標。六、參加（協(xié)作）單位意見及具體分工（附協(xié)議書）。七、經(jīng)費概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據(jù)，以及分年度使用計劃。填寫說明一、內(nèi)容填寫自備附頁，用紙大小和封頁一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報要求上報。二、填寫提綱所列內(nèi)容，要全面詳細、如實填寫。三、封面上“登記序號”“項目編號”請勿填寫。1、立項依據(jù)1.1研究目的、意義骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）又稱退行性關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年以后的慢性進行性關(guān)節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長而升高，據(jù)調(diào)查，在美H

H國目前H

H2億多人口中，就有骨關(guān)節(jié)炎4500萬，發(fā)病率占總?cè)丝诘?0%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，OA的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，55—64歲的人群中發(fā)病率達40%，而65歲以上人群的患病率達60%~90%。隨著計劃生育政策的長久實施及經(jīng)濟發(fā)展，我國已進入老齡化社會，OA的發(fā)病率還將越來越高，這不僅嚴重危害人民的生活、健康，對社會也將造成很大負擔。同時世界其他國家也面臨著同樣的問題，因而OA引起了國際、國內(nèi)醫(yī)學(xué)界的相當重視。近年來對OA的研究頗多，在發(fā)病機制、檢測手段以及治療方法上均取得較大進步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進展。西藥治療OA的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點。雖然中藥治療OA也取得了一些經(jīng)驗，但對其具體的作用機制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對療效確切的中藥復(fù)方進行深入的機理研究，使中藥治療OA的療效在國際先進行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2國內(nèi)外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢近十年來，國內(nèi)外對OA進行了較深入地研，究大致歸納如下：1.2.1流行病學(xué)研究已廣泛開展在近100種不同類型的關(guān)節(jié)疾病中，OA是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一，沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長，患病率也有增高的趨勢。Felson等報道70歲以下人群膝OA患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學(xué)膝OA70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為H

H43.7%。Butter等報道，44歲以下、45—59歲、60歲以上人群中，放射血OA患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國內(nèi)陳順樂等隊13541名鋼鐵工人的調(diào)查結(jié)果顯示，癥狀性O(shè)A患病率2.2%；無癥狀性O(shè)A患病率53%，其中30—39、40—49、50—59歲患病率各為11%、27%和62%。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計551例，結(jié)果40歲以下、40—49、50—59和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關(guān)節(jié)OA易感性不同。美國在衛(wèi)生統(tǒng)計中心調(diào)查結(jié)果，OA患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國內(nèi)陳順樂等調(diào)查結(jié)果OA是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖OA均以女性較多，且女性骨關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在Framingham的研究中，F(xiàn)elaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關(guān)節(jié)炎形成的風(fēng)險相應(yīng)減少50%。Saase等調(diào)查結(jié)果，膝OA患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據(jù)1994年統(tǒng)計，在美國，骨關(guān)節(jié)炎的消耗為155億美元，約為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國雖未作全國大范圍的普查，但隨著老齡化社會進程的不斷加快，OA的發(fā)病率會越來越高，這必將給家庭、社會帶來沉重負擔。1.2.2病因、發(fā)病機制有了巨大突破目前基礎(chǔ)研究認為軟骨的損傷與退變是OA的根本，隨著分子生物學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，近年來眾多學(xué)者對OA關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進行了大量研究，其發(fā)病機制仍未完全明了，又提出了許多學(xué)說，如軟骨下骨內(nèi)高壓學(xué)說：由于骨血液動力學(xué)的改變，在骨髓腔容積不變的前提下增加內(nèi)容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。骨內(nèi)高壓持續(xù)增高存在下關(guān)節(jié)滑液pH值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細胞的正常代謝導(dǎo)致細胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖H

H分解，軟骨下骨破壞、修復(fù)，最終產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎。自由基學(xué)說：認為自由基對軟骨細胞H

HDNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細胞后，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，使脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛增多，丙二醛可與DNA發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細胞DNA即合成DNA所需的酶，使DNA鏈斷裂、堿基損傷從而影響了DNA的合成，也造成前列腺（PG）合成障礙。骨關(guān)節(jié)炎時，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細胞、巨嗜細胞浸潤，其表面受免疫復(fù)合物、補體等作用能釋放大量O2-和H2O2；細胞因子學(xué)說：細胞因子對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子（TNF）等在OA中水平明顯增高。IL-1具有刺激軟骨細胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時IL-1也是軟骨基質(zhì)降解的主要驅(qū)動因子；軟骨酶降解學(xué)說：OA軟骨細胞的基質(zhì)降解酶類的合成與分泌率加，并與關(guān)節(jié)炎的嚴重程度密切相關(guān)。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類可以增加達到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白?；|(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細胞外基質(zhì)的所有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細胞和軟骨細胞產(chǎn)生的IL-1和TNF的作用下，軟骨細胞以酶原的形式分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，而對金屬蛋白酶組織抑制劑無影響，使二者失衡從而增加對軟骨主要成分Ⅱ型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進行性破壞；一氧化氮學(xué)說：NO是一種細胞間信使分子，可介導(dǎo)許多生物學(xué)現(xiàn)象。NOS可催化重要炎性介質(zhì)NO的產(chǎn)生，OA患者血清、滑液中NO含量明顯高于正常。NO可通過抑制軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時使軟骨細胞分泌透明質(zhì)酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細胞合成軟骨基質(zhì)，促進軟骨細胞糖酵解，使軟骨破壞。細胞凋亡學(xué)說：細胞凋亡是H

H細胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進與不足則會引起相關(guān)疾病，在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中軟骨細胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細胞數(shù)目與骨關(guān)節(jié)炎嚴重程度明顯相關(guān)。凋亡小體存在于軟骨細胞小孔或間隙內(nèi)，其產(chǎn)生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有H

HNTPPH（nucleosidtriphosphatepyrophosphohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細胞修復(fù)過程失敗，而逐漸發(fā)展成關(guān)節(jié)軟骨的完全丟失。OA軟骨細胞凋亡主要通過兩種相互獨立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關(guān)的途徑,由NO介導(dǎo);另一種是同滑膜炎癥相關(guān)的途徑,由Fas介導(dǎo)。典型的OA不存在明顯的炎癥反應(yīng),此時軟骨細胞凋亡以NO途徑為主;當產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時,則通過Ｆas途徑加劇軟骨細胞凋亡和關(guān)節(jié)破壞。NO通過兩種方式造成組織及細胞損傷。一是高濃度的NO能抑制多種與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是NO與超氧化陰離子Ｏ2-反應(yīng),生成氧化亞硝基陰離子ONOO-,在酸性條件下(如病理條件)迅速分解為OH-和NO2自由基,這兩種自由基具有很強的細胞毒性,可造成組織細胞損傷。在OA患者中,受損區(qū)軟骨細胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。Fas表達的結(jié)果與其相符,OA受損區(qū)的Fas表達遠高于未受損區(qū),提示Fas表達可誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡。除NO途徑和Fas途徑外,還有一些因素可導(dǎo)致軟骨細胞凋亡、關(guān)節(jié)破壞,如IL-1、IL-8、TNF-α、PGE2、AggrecanG1區(qū)等。1.2.3治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療OA的藥物較多，西藥治療OA主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，H

HOA多為老年人，長期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價格不菲，而且由于過分的鎮(zhèn)痛，導(dǎo)致病人失去警惕過分運動，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長期療效來看反而不佳，最新觀點認為乙酰氨基酚應(yīng)作為治療OA的首選藥，但尚有一定爭議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價格昂貴，臨床上尚未廣泛運用；第三類為軟骨保護劑，尚未問世。關(guān)節(jié)清理術(shù)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，適應(yīng)癥較少，費用高，創(chuàng)傷大，病人以難接受。中哦藥治療OA的研究取得了可喜的進步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：①多屬臨床經(jīng)驗，無對照組，特別是西藥對照組觀察，處方不固定。②缺乏用客觀的最新的國際公認的、量化的臨床觀察指標及療效判斷標準為手段來尋找治療OA的中藥。③未針對OA發(fā)病機制進行臨床及動物試驗從生化、免疫、病理、細胞分子水平來探討中藥的藥物作用機理。④缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認為OA屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認為其病因與年老體衰、長期勞損、外感風(fēng)寒濕邪有關(guān)，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為OA的發(fā)病基礎(chǔ)，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎(chǔ)上，闡述了膝OA—骨內(nèi)高壓—血瘀證—氧自由基之間的密切關(guān)系；謝林等論述了膝OA與血瘀證之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在為運用活血化淤藥治療OA提供理論依據(jù)。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對其病因病機采用益肝腎、強筋骨、補氣血治其本；散寒通絡(luò)、化痰勝濕治其標。獨活寄生湯是用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補肝腎、活血通絡(luò)之功，臨床常見本方加減治療OA，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關(guān)節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報道用本方加減治療104例，總有效率91.3%。H

H1.2.4實驗研究方面有了較大的進展隨著對OA發(fā)病機理的不斷深入認識，對OA的實驗研究方面也開始了向多層次多角度的方向發(fā)展。動物實驗不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗，現(xiàn)已使用針對OA的動物實驗，并采用相關(guān)的指標進行檢測。目前實驗研究內(nèi)容主要有以下幾個方面，研究最多的是OA的血液流變學(xué)、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗一般均可通過建立骨關(guān)節(jié)炎的模型來完成，也可通過使用其它相似的模型檢測相關(guān)指標來進行，如可建立急性血淤模型來檢查血液流變學(xué)指標，使用老齡動物通過檢測體內(nèi)SOD及MDA含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在NO對OA影響的實驗中，一般采用硝酸還原酶法來測定NO含量，運用PT-PCR技術(shù)測定NOS基因表達。IL-1、IL-6、TNF等細胞因子、軟骨降解酶尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥的物質(zhì)如纖溶酶原/纖溶酶原激活物和前列腺素PGE2、軟骨細胞的細胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來越多地被作為檢測指標使用到實驗研究中來。1.3選題的理論和實踐依據(jù)祖國醫(yī)學(xué)并無骨關(guān)節(jié)炎的病名，從歷代文獻來看本病應(yīng)歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。我們認為OA病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般OA病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關(guān)節(jié)腫脹畸形、活動受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質(zhì)之于痰淤?；诂F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對OA發(fā)病機理的深入研究，我們在補益肝腎、活血通絡(luò)基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥對緩解軟骨降解，增加軟骨細胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于1995年即對《備急千金要方》中的獨活寄生湯進行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結(jié)制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于H

H1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝OA，方中以獨活為君藥，以祛下焦與筋骨間風(fēng)寒濕邪；威靈仙舒筋通絡(luò)止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補肝腎，強筋骨，通經(jīng)絡(luò)，其中懷牛膝為引經(jīng)藥；當歸養(yǎng)血柔肝、舒筋活血；川芎則通達四肢關(guān)節(jié)，為血中氣藥；虎杖活血清熱解毒，同時防諸藥辛燥太過。諸藥合用共起補肝腎、祛風(fēng)濕、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保護軟骨。通過36例的臨床研究、觀察，結(jié)果表明本方療效顯著且副作用小。因此有必要對痛痹顆粒治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制尤其是該方對軟骨細胞的細胞凋亡與增殖機理做進一步的研究，冀能證實痛痹顆粒的臨床療效，明確其作用機制，并初步探討本病發(fā)病的可能機理，為新藥問世提供客觀的依據(jù)，所以進行設(shè)計并立題。1.4本研究達到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會效益和應(yīng)用推廣前景1.4.1繼承和發(fā)揚祖國醫(yī)學(xué)，保持中醫(yī)特色，以臨床療效為前提，以實驗研究為基礎(chǔ)，制造規(guī)范化大鼠的膝OA模型，從發(fā)病機理探討本藥的作用機制。本實驗采用可靠地國際公認的方法復(fù)制動物模型，并采用最新的檢測指標IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，總之本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對OA發(fā)病機制的最新研究成果，從生化、免疫等多個角度多個層次，系統(tǒng)觀察并進行歸納總結(jié)，確保本課題不但可行而且先進，冀能填補省內(nèi)外運用中藥治療OA的空白，并希望以此為基礎(chǔ)，進一步從細胞水平（包括本藥對軟骨細胞及細胞凋亡與增殖的影響）研究中藥對OA的長久作用及影響，從而達到擠身國際先進水平的目的，讓中藥真正走向世界。1.4.2目前，中藥治療OA的方法頗多，但大多以臨床療效研究為主，大樣本、規(guī)范化的研究很少，中醫(yī)中藥治療機理的研究，雖有涉及，但大多分散且存在一定的重復(fù)性，理想的治療藥物尚未問世，具有公認療效的小兒遷延性腹瀉臨床治療方案尚未確立，其療效評價體系尚需研究確定，尤其是缺少中醫(yī)藥治療學(xué)整體H

H研究思路與方法，使中藥復(fù)方治療H

HOA的療效機理尚未能全面揭示，影響了該領(lǐng)域研究的深入。而痛痹顆粒是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下選用《千金要方》中獨活寄生湯進行加減所得，并采用可靠的實驗?zāi)Ｐ图白钚碌膰H公認的相關(guān)指標進行實驗研究，觀察其對OA的確切療效及作用機理，這必將對OA的中醫(yī)理論產(chǎn)生較大影響，同時對臨床治療也起到更好的指導(dǎo)作用，從而產(chǎn)生較好的社會經(jīng)濟效益。隨著改革開放的形勢發(fā)展，以及中國加入WTO與國際接軌的進程的不斷完善，祖國醫(yī)學(xué)國際地位不斷的提高，我們將從祖國醫(yī)學(xué)寶庫中發(fā)掘出的治療OA的高效藥物與現(xiàn)代新技術(shù)、新方法進行研究總結(jié)，從而為人類造福，為振興中醫(yī)事業(yè)做出應(yīng)有的貢獻。2.科研假說或技術(shù)構(gòu)想：主要內(nèi)容、技術(shù)關(guān)鍵目的，技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。2.1主要內(nèi)容2.1.1探討OA的病因病機，提出新見解，發(fā)展中醫(yī)理論。2.1.2運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，開展實驗研究，從分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生理生化學(xué)等多方面來探討“痛痹顆?！敝委熛A的療效機制及藥理毒理作用。2.2主要技術(shù)關(guān)鍵2.2.1膝OA模型的復(fù)制目前所使用的OA動物模型一般可分為兩大類，其一是誘發(fā)模型，即通過各種操作方法如制動、手術(shù)、關(guān)節(jié)內(nèi)注藥、關(guān)節(jié)內(nèi)植入軟骨碎片或微粒等誘導(dǎo)OA產(chǎn)生；另一類為自發(fā)模型，即不用任何外界干預(yù)，動物自發(fā)OA，如C57黑鼠等。在選擇動物模型時一般應(yīng)考慮動物的種屬（包括其生活習(xí)性、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)、組織學(xué)及病理學(xué)特征）、不同方法的造模機制和H

HOA模型的特點，并應(yīng)參照研究目的加以選擇。在誘發(fā)模型中，常用的方法是手術(shù)造成關(guān)節(jié)的應(yīng)力改變及關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入木瓜蛋白酶，這兩種方法都能復(fù)制出較成功較高的OA模型，且操作較為簡單。具體的造模機制在于低應(yīng)力可以造成軟骨厚度減少，SO染色變淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度損傷等變化，木瓜蛋白酶作為一種蛋白水解酶會引起關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變。在具體的造模過程中我們選用以上兩種方法來分別復(fù)制動物模型。用于動物模型的動物一般有狗、兔、鼠等，我們選用大鼠做OA模型，因為該模型關(guān)節(jié)軟骨退變的組織學(xué)特征與人類相似，且動物來源較廣泛，且經(jīng)。濟2.2.2關(guān)節(jié)軟骨細胞的獲取和培養(yǎng)基于來源廣泛，操作可行的原則，目前用于體外培養(yǎng)的軟骨細胞一般均為兔關(guān)節(jié)軟骨細胞原代培養(yǎng)所得。軟骨需在嚴格無菌的條件下分離，經(jīng)過一系列的漂洗、消化等工作后獲取軟骨細胞。目前還沒有專門用于軟骨細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液，國外采用的培養(yǎng)液種類繁多，有199、1640、F12、改良Eagle等，國內(nèi)的有199、1640、DMEM（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用DMEM培養(yǎng)液居多。在培養(yǎng)液中還含有一些輔助添加劑，包括25mmol/LHepes、1mmol/L丙酮酸鈉、2mmol/L谷氨酰胺、50umol/L二硫基乙醇以及10萬單位/L的青霉素和10萬單位/L的鏈霉素，PH7.4。培養(yǎng)過程中一般使用5%CO237℃的恒溫培養(yǎng)箱。2.2.3采用的檢測手段及指標在病理組織形態(tài)學(xué)的檢查中，一般采用以下幾個觀察指標：①大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況；②HE染色觀察有關(guān)的形態(tài)變化；③Masson三色染色觀察膠原的變化；④Sanfranin-O即沙紅O染色用于組織學(xué)評分，評分方法按H

HMankin法；⑤電鏡下觀察軟骨細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。在細胞培養(yǎng)的相關(guān)檢測中，我們采用MTT法檢測軟骨細胞的增殖能力，用全自動生化分析儀對檢測總蛋白含量，使用細胞流式儀進行細胞凋亡的測定，對iNOS、NO含量的測定則使用分型NOS試劑盒和NO試劑盒。2.3目標（達到的主要技術(shù)指標或技術(shù)經(jīng)濟指標）、技術(shù)特征及創(chuàng)新之處?，F(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與中醫(yī)藥理論相結(jié)合，深入研究中醫(yī)藥治療OA的作用機制，為臨床應(yīng)用提供更加科學(xué)有利的客觀依據(jù)，發(fā)揮中醫(yī)藥治療OA的特色和優(yōu)勢，為臨床常見、嚴重影響人類健康的OA研究出有效、安全、便于推廣應(yīng)用的中醫(yī)藥治療方法，使能迅速緩解癥狀，大大減輕病人痛苦，降低膝骨關(guān)節(jié)炎的致殘率和復(fù)發(fā)率，且副作用小的簡、便、廉、驗的中藥制劑問世。治療膝OA的新藥生產(chǎn)及對其在治療中所起作用機制的深入探討，既符合國情又能夠走向世界，產(chǎn)生較大的社會和經(jīng)濟效益，這必然形成高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)進入高新領(lǐng)域，對促進科技進步，發(fā)展中醫(yī)藥，有著積極的作用，同時這也是中藥現(xiàn)代化研究的發(fā)展方向和新的探索。3.實驗研究方法及技術(shù)路線。3.1對實驗性大鼠骨性關(guān)節(jié)炎的防治作用OA模型的制備：（1）取SD雄性大鼠50只，體重200～220g，固定，常規(guī)備皮消毒，沿髕韌帶內(nèi)側(cè)緣切口，切斷雙后肢內(nèi)側(cè)副韌帶及膝前內(nèi)側(cè)筋膜擴張部，并在斷端處修剪去除約2mm，造成雙后肢膝外翻畸形。術(shù)后第二天放造模大鼠于拖箱內(nèi)每天趕其行走30m。（2）取SD雄性大鼠50只，體重200～220g，4%木瓜蛋白酶溶液與0.03mol/L半胱氨酸溶液1：1混置0.5小時后，分別在第1、3、5、7天于實驗大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入混合液20ul。H

H方法：將造模后的大鼠隨機分為模型組、陽性對照組（維骨力組）、治療組，另設(shè)正常對照組，分別灌胃給藥或蒸餾水，連續(xù)7周。七周后將動物麻醉后，立即將大鼠以仰臥位固定，頸總?cè)⊙尤朐嚬苤校?000rmp15min離心獲取含藥血清；切開關(guān)節(jié)囊，進行大體觀察后，然后以銳利刀片切取膝關(guān)節(jié)前正中部分的滑膜組織，作HE染色，電鏡下觀察。再用銳利刀片切取股骨內(nèi)倮軟骨使其呈2mm×1mm全層軟骨標本，2.5%戊二醛溶液固定，電鏡下觀察。所余之股骨內(nèi)倮連同軟骨下骨一并切下，10%馬林溶液固定24小時以上，分別作HE、沙紅-O及Masson三色染色后光鏡檢查，取樣后即可將動物處死。觀察指標：①大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況；②HE染色觀察有關(guān)的形態(tài)變化；③Masson三色染色觀察膠原的變化；④Sanfranin-O即沙紅O染色用于組織學(xué)評分，評分方法按Mankin法（附評分等級表如下）；⑤電鏡下觀察軟骨細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。評分等級Ⅰ.結(jié)構(gòu)正常012345678910表面結(jié)構(gòu)微小不規(guī)則表面結(jié)構(gòu)中等不規(guī)則表面結(jié)構(gòu)嚴重不規(guī)則過渡層出現(xiàn)裂隙輻射層出現(xiàn)裂隙鈣化層出現(xiàn)裂隙過渡層消失輻射層消失鈣化層消失結(jié)構(gòu)完全破壞Ⅱ.細胞1.切線的區(qū)域H

H正常012細胞腫脹細胞消失2.過渡和輻射的區(qū)域正常012345678910少量的細胞增多中等量的細胞增多大量的細胞增多少量的克隆中等量的克隆大量的克隆少量的細胞減少中等量的細胞減少大量的細胞減少細胞消失Ⅲ.變異標記完整0123多層模糊血管的交叉Ⅳ.血管翳形成沒有0123少量中等量大量3.2對體外培養(yǎng)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞的影響3.2.1兔膝軟骨細胞的原代培養(yǎng)無菌條件下取兩周齡新西蘭白兔后肢關(guān)節(jié)，用刀片取關(guān)節(jié)表面軟骨，收集在含磷酸緩沖液（PBS）的無菌小培養(yǎng)皿內(nèi)，反復(fù)清洗除去軟骨片表面的血液，以及可能勿帶之滑膜組織。漂洗完畢后，用無菌的眼科小剪刀在培養(yǎng)皿中將其細切至不大于1mm3。切碎后將其裝入10u試管內(nèi)，按1：10量加入消化酶類進行化學(xué)解離。先用0.25%胰酶消化30min，然后去除H

H胰酶，加入0.2%膠原酶Ⅱ消化7~8小時后，1500rpm10min離心，棄上清，加入PBS，搖勻在同上離心棄上清，在加PBS反復(fù)三次，最后一次加含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻，200目篩網(wǎng)過濾，放入培養(yǎng)瓶中，5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期換液，并觀察照相，長滿后用0.25%胰酶消化傳代。H

H3.2.2對軟骨細胞增殖反應(yīng)的作用將在培養(yǎng)瓶中長滿的細胞消化，接入96孔培養(yǎng)板中，100ul/孔，待細胞長成單層后，將舊液棄去，用PBS輕輕蕩洗一遍，然后加入含藥血清，100ul/孔，每組4個復(fù)孔。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱孵育72h后，取上清液。每孔加入MTT試劑20ul（5g/L）既無血清培養(yǎng)液100ul，再孵育4h。取上清，每孔加入200ul溶甲瓚液，以主波長570nm，參比波長690nm于酶標儀上比色，讀取吸光度（A）值。3.2.3對軟骨細胞的細胞凋亡的影響單層細胞培養(yǎng)板制作同上，加入含藥血清，每組4個復(fù)孔，于5%CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，棄去舊液，用0.25%胰酶消化待細胞有變圓趨勢即取出消化液，加入PBS，用吸管輕輕吹打，使成單個細胞懸液，移入離心管離心，1000rpm，5min，去掉上清液，約留0.5ml細胞懸液，用振蕩器使細胞分散，用細滴管或注射器將細胞迅速注入4℃冷乙醇中（乙醇終濃度為70%），用細胞流式儀檢測凋亡細胞數(shù)目，計算凋亡百分率。3.2.4對軟骨細胞蛋白合成和NO含量的影響同樣將各組含藥血清加入已長成單層細胞的培養(yǎng)板內(nèi)，CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，收集上清液，用全自動生化分析儀檢測總蛋白含量，用分型NOS試劑盒和NO試劑盒檢測各組iNOS、NO含量。H

3.2.5拆方后對軟骨細胞的影響進行拆方實驗，篩選出補肝腎組方、祛風(fēng)濕組方和化瘀痰組方三組，對這三組及復(fù)方分別進行體外的軟骨細胞實驗，設(shè)立陽性對照組（維骨力組）：細胞毒性實驗將