RNA的生物合成簡明教程

RNA的生物合成簡明教程第1頁/共67頁轉(zhuǎn)錄(transcription)是生物體以DNA為模板合成RNA的過程。轉(zhuǎn)錄RNADNA

第一節(jié)RNA生物合成的概況一、什么是轉(zhuǎn)錄？第2頁/共67頁二、參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)：原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶

(RNApolymerase,RNA-pol)其他蛋白質(zhì)因子第3頁/共67頁5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C編碼鏈模板鏈mRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯（一）轉(zhuǎn)錄模板第4頁/共67頁（一）轉(zhuǎn)錄模板 DNA的兩條鏈中只有一條可轉(zhuǎn)錄，可作為模板按堿基配對規(guī)律指引轉(zhuǎn)錄生成RNA，稱為模板鏈，也稱作有反義鏈或Watson鏈或負鏈。1、模板鏈(templatestrand)第5頁/共67頁2、編碼鏈(codingstrand)與模板鏈相對的另一條互補鏈稱編碼鏈，也稱為有義鏈或Crick鏈或正鏈。

60年代以前的表示方法與此相反)第6頁/共67頁不對稱轉(zhuǎn)錄：DNA分子上一條鏈可轉(zhuǎn)錄，另一條鏈不轉(zhuǎn)錄；模板鏈并非永遠在同一單鏈上。結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)：能轉(zhuǎn)錄出mRNA然后指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的區(qū)段。其余的DNA可能轉(zhuǎn)錄(rRNA,tRNA)，也可能不轉(zhuǎn)錄。3、不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)第7頁/共67頁5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向第8頁/共67頁以大腸桿菌為例全酶：分子量為480kD，由五種亞基組成α2ββ′ωσ，去掉σ亞基稱為核心酶ω

亞基的功能還不清楚。一、原核生物RNA聚合酶第二節(jié)原核生物的轉(zhuǎn)錄（識別、起始、延長和終止）第9頁/共67頁核心酶

(coreenzyme)全酶

(holoenzyme)轉(zhuǎn)錄起始階段轉(zhuǎn)錄延長階段ωω第10頁/共67頁?用于轉(zhuǎn)錄的起始

?依靠空間結(jié)構(gòu)與DNA模板結(jié)合(σ亞基與核心酶結(jié)合后引起的構(gòu)象變化)

?專一性地與DNA序列(啟動子)結(jié)合全酶（HoloEnzyme）第11頁/共67頁?作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過程（終止）?依靠靜電引力與DNA模板結(jié)合（蛋白質(zhì)中堿性基團與DNA的磷酸根之間）?非專一性的結(jié)合（與DNA的序列無關(guān)）核心酶（CoreEnzyme）第12頁/共67頁RNA聚合酶各亞基的功能第13頁/共67頁原核生物RNA聚合酶結(jié)合到DNA的啟動區(qū)開始轉(zhuǎn)錄，靠σ亞基辨認啟動區(qū)，啟動RNA的合成。啟動子（promoter，也稱啟動基因）是指RNA聚合酶能識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動區(qū)具有共有的序列稱為保守序列或一致性序列。二、轉(zhuǎn)錄的起始（一）模板的識別第14頁/共67頁RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合:第15頁/共67頁開始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205335原核生物啟動子保守序列RNA-pol識別位點55RNA聚合酶保護區(qū)結(jié)構(gòu)基因33第16頁/共67頁原核生物中轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的共同序列第17頁/共67頁（1）RNA聚合酶全酶(2)與模板DNA上啟動子的-35區(qū)域結(jié)合，即形成了閉合轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(closedtrancriptioncomplex)；（二）轉(zhuǎn)錄的起始（2）DNA雙鏈局部解開，形成開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(opentranscriptioncomplex)；第18頁/共67頁（二）轉(zhuǎn)錄的起始加入的第一個核苷三磷酸常是GTP或ATP。（3）在RNA聚合酶(β亞基)作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物：

RNApol(2ω)-DNA-pppGpN-OH-3第19頁/共67頁E.coli的轉(zhuǎn)錄起始第20頁/共67頁σ亞基脫落，核心酶構(gòu)象改變，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。RNA的5′端伸展在轉(zhuǎn)錄空泡之外模板為A，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相應(yīng)為U三、轉(zhuǎn)錄的延伸第21頁/共67頁第22頁/共67頁第23頁/共67頁轉(zhuǎn)錄空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）

····DNA

····RNA

形成的三元復(fù)合物第24頁/共67頁轉(zhuǎn)錄延長：第25頁/共67頁53DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶在同一DNA模板上，有多個轉(zhuǎn)錄同時在進行；轉(zhuǎn)錄尚未完成，翻譯已在進行。這種形狀說明：第26頁/共67頁四、轉(zhuǎn)錄終止（termination）終止子：指能提供轉(zhuǎn)錄停止信號的DNA序列轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上不再前進，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來。終止過程：酶停止添加底物→→釋放

RNA鏈→→酶解離終止反應(yīng)：…雜合雙鏈的氫鍵斷裂，

…重新形成雙螺旋，酶的解離。第27頁/共67頁終止因子：指協(xié)助RNA聚合酶識別終止子的輔助因子（蛋白質(zhì)），如ρ因子原核生物的終止子分為兩類不依賴ρ因子的終止子：強終止子依賴ρ因子的終止子：弱終止子☆終止子（terminator）：在轉(zhuǎn)錄的過程中，提供轉(zhuǎn)錄終止信號的核酸序列。第28頁/共67頁1、不依賴ρ因子的終止子結(jié)構(gòu)特征:?在終止點之前具有富含G-C的回文區(qū)域，形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)?富含G-C的區(qū)域之后是一連串的dA堿基序列，它們轉(zhuǎn)錄的RNA鏈的末端為一連串U（連續(xù)

6~8個）。具有內(nèi)在終止子第29頁/共67頁IRIR莖部富含GC不依賴ρ因子的終止子結(jié)構(gòu)第30頁/共67頁ρ因子是由相同亞基組成的六聚體蛋白質(zhì)，亞基分子量46kD。ρ因子能結(jié)合RNA，對polyC的結(jié)合力最強。ρ因子還有NTP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。2、依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止ρ因子：第31頁/共67頁a、ρ因子與RNA結(jié)合（終止子上游的某一處）b、ρ因子沿RNA從5’→3’移動（NTP水解供能）c、ρ因子與RNApol相互作用而造成轉(zhuǎn)錄的終止

ρ因子對終止子的作用第32頁/共67頁無連續(xù)U串G/C含量較少第33頁/共67頁因子：水解各種核苷三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。第34頁/共67頁ρ結(jié)合上來追趕RNApolρ追趕上來（暫停）ρ與RNApol相互作用使雜交鏈解鏈終止子第35頁/共67頁第三節(jié)、真核生物的轉(zhuǎn)錄過程真核生物的轉(zhuǎn)錄過程比原核復(fù)雜。二者的轉(zhuǎn)錄起始過程有較大區(qū)別，轉(zhuǎn)錄終止也不相同。第36頁/共67頁真核生物具有3種不同的RNA聚合酶:RNA聚合酶Ⅰ（RNAPolⅠ）RNA聚合酶Ⅱ（RNAPolⅡ）RNA聚合酶Ⅲ（RNAPolⅢ）三種RNA聚合酶專一地轉(zhuǎn)錄不同的基因，其轉(zhuǎn)錄過程和產(chǎn)物各不相同。三種RNA聚合酶對鵝膏蕈堿的敏感性反應(yīng)不同。一、真核生物的RNA聚合酶第37頁/共67頁真核生物的RNA聚合酶種類RNApolIRNApolIIRNApolIII所合成的RNA前體rRNA（5.8S,18S,28S）mRNA(hnRNA)及一些特殊的RNAtRNA和5SrRNA在細胞內(nèi)的分布核仁核質(zhì)核質(zhì)對鵝膏蕈堿耐受極敏感中度敏感第38頁/共67頁

真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化。轉(zhuǎn)錄起始時，RNA-pol不直接結(jié)合模板，其起始過程比原核生物復(fù)雜。二、轉(zhuǎn)錄起始

轉(zhuǎn)錄起始需要啟動子、RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的參與，不同RNA聚合酶有其特異的啟動子及特定的轉(zhuǎn)錄因子。第39頁/共67頁真核生物啟動子的結(jié)構(gòu)核心啟動子（corepromoter）上游啟動子元件（upstreampromoterelement，UPE）第40頁/共67頁核心啟動子:指保證RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點及轉(zhuǎn)錄起始位點上游TATA區(qū)作用：選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點，保證精確起始TATA常在-25bp左右，相當于原核的-10序列第41頁/共67頁一個典型的真核生物基因上游序列:5’3’調(diào)控序列TATA盒InrYYANYYTA-30+1TATAAA第42頁/共67頁轉(zhuǎn)錄起始點TATA盒CAAT盒GC盒

增強子順式作用元件(cis-actingelement)轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段AATAAA切離加尾轉(zhuǎn)錄終止點修飾點外顯子翻譯起始點內(nèi)含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚體第43頁/共67頁轉(zhuǎn)錄因子能直接、間接辨認和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionalfactors,TF)。第44頁/共67頁參與RNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄的TFⅡ第45頁/共67頁轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子，形成轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物(pre-initiationcomplex,PIC)

。第46頁/共67頁POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡB由RNA-PolⅡ催化轉(zhuǎn)錄的PICPOL-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復(fù)合物TATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-PPIC組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化第47頁/共67頁三、延伸真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。RNA-pol前移處處都遇上核小體。轉(zhuǎn)錄延長過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。第48頁/共67頁RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小體轉(zhuǎn)錄延長中的核小體移位轉(zhuǎn)錄方向第49頁/共67頁真核生物的轉(zhuǎn)錄終止，和轉(zhuǎn)錄后修飾同時進行。真核生物mRNA有聚腺苷酸(polyA)尾巴結(jié)構(gòu)，是轉(zhuǎn)錄后才加進去的。轉(zhuǎn)錄不是在polyA的位置上終止，而是超出數(shù)百個乃至上千個核苷酸后才停頓。已發(fā)現(xiàn)，在讀碼框架的下游，常有一組共同序列AATAAA，再下游還有相當多的GT序列。這些序列稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點。四、終止第50頁/共67頁復(fù)制轉(zhuǎn)錄相同點1、都以DNA為模板

2、原料為核苷酸3、合成方向均為5′→3′方向4、都需要依賴DNA的聚合酶5、遵守堿基互補配對規(guī)律

6、產(chǎn)物為多聚核苷酸鏈不同點模板兩條鏈作為模板模板鏈作為模板原料dNTPNTP聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物子代DNA鏈mRNA,rRNA,tRNA堿基配對A-T,C-GA-U,C-G引物需要RNA引物不需要引物合成方式半保留、半不連續(xù)復(fù)制不對稱轉(zhuǎn)錄復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的異同點總結(jié)第51頁/共67頁第三節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工（修飾）由轉(zhuǎn)錄生成的RNA分子是初級RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(primaryRNAtranscript)，幾乎所有的初級RNA轉(zhuǎn)錄物都要經(jīng)過加工，才能成為具有功能的成熟的RNA。加工主要在細胞核中進行。第52頁/共67頁幾種主要的修飾方式：1.剪接(splicing)2.剪切(cleavage)3.

修飾(modification)4.

添加(addition)第53頁/共67頁一、mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工

原核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后大多不需要加工，一經(jīng)轉(zhuǎn)錄即可進行直接翻譯。

只有少數(shù)多順反子RNA需經(jīng)過核酸內(nèi)切酶切成較小的單位，再進行翻譯。真核生物mRNA前體：hnRNA第54頁/共67頁（一）真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后加工大多數(shù)真核mRNA的5’-末端有7-甲基鳥嘌呤的帽結(jié)構(gòu)(m7GpppG)，由三磷酸酶、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶（加帽酶）和甲基轉(zhuǎn)移酶催化生成。意義：可以保護mRNA免遭核酸酶的水解；也能與蛋白質(zhì)結(jié)合，促進mRNA與核糖體的結(jié)合，啟動蛋白質(zhì)的生物合成。1、

5’-帽子結(jié)構(gòu)的生成第55頁/共67頁5pppGp…5GpppGp…pppG

ppi鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶5

m7GpppGp…甲基轉(zhuǎn)移酶SAM帽子結(jié)構(gòu)的生成5ppGp…磷酸酶Pi第56頁/共67頁2、3’多聚腺苷酸(polyA)尾核內(nèi)的初級mRNA稱為核內(nèi)雜化RNA或核內(nèi)不均一RNA(hetero-nuclearRNA,hnRNA)polyA的附加是在多聚A聚合酶即RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶催化下在核內(nèi)完成的。polyA尾巴同樣可以和特定蛋白質(zhì)結(jié)合，具有保護mRNA不被核酸酶水解的作用。第57頁/共67頁真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。（1）斷裂基因(splitegene)CABD編碼區(qū)A、B、C、D非編碼區(qū)3、真核生物mRNA前體的剪接第58頁/共67頁（2）外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)外顯子：在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達為成熟RNA的核酸序列。內(nèi)含子：隔斷基因的線性表達而在剪接過程中被除去的核酸序列。第59頁/共67頁二、tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工tRNA前體RNApolIIITGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNA第