基因工程制藥part2

基因工程制藥part2第1頁/共64頁表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計第2頁/共64頁表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計第3頁/共64頁

構(gòu)建表達質(zhì)粒時首先要考慮使目標(biāo)基因的翻譯起始密碼ATG與SD序列之間的距離和堿基組成處于一個適當(dāng)?shù)姆秶?/p>

核糖體結(jié)合位點序列的變化對mRNA的翻譯效率有顯著影響，表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計第4頁/共64頁具體表現(xiàn)為：

SD序列UAAGGAGG的翻譯效率要比AAGGA高3~6倍。翻譯起始密碼ATG與UAAGGAGG的最適距離是6~8個堿基長度，與AAGAA的最適距離是5~7個堿基長度。

ATG與UAAGGAGG至少相隔3~4個堿基，與AAGAA至少相隔5個堿基mRNA的翻譯才能進行。

ATG與SD序列之間的堿基組成為A、T堿基豐富時，mRNA翻譯效率較高。表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計第5頁/共64頁

核糖體結(jié)合位點本身和附近的序列決定了目標(biāo)基因mRNA5’端的二級結(jié)構(gòu)，研究表明mRNA5‘端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)阻礙了mRNA與核糖體30S亞基的結(jié)合，從而抑制了翻譯的起始。盡量提高核糖體結(jié)合位點本身和附近的序列中A/T堿基的含量，降低mRNA5’端形成的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的可能性，也是構(gòu)建表達質(zhì)粒時需要注意的事項。

表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計第6頁/共64頁

在必要的情況下，還可通過頂點突變，PCR等技術(shù)改變個別關(guān)鍵的堿基來破壞mRNA5‘端的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。把目標(biāo)基因設(shè)計成多順反子結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個SD序列和目標(biāo)基因，一起插入表達載體。這一方法通常適用于目標(biāo)基因5’端序列容易形成二級結(jié)構(gòu)，而又不宜改變其序列的情形下。表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計第7頁/共64頁

在構(gòu)建表達質(zhì)粒時，充分利用各個基因的結(jié)構(gòu)特征和特點，注意引入翻譯增強子序列

能提高mRNA翻譯效率的特殊核苷酸序列，稱為翻譯增強子。

表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計第8頁/共64頁共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因表達水平高的基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛性高于表達水平低的基因現(xiàn)已闡明的在大腸桿菌中的稀有密碼子有：編碼Arg的密碼子AGA、AGG、CGA、CGG編碼Pro的密碼子CCC、CCU、CCA編碼Cys的密碼子UGU、UGC編碼Gly的密碼子GGA、GGG編碼Leu的密碼子CUA、CUC編碼IIe的密碼子AUA編碼Ser的密碼子UCA、AUG、UCG、UCC編碼Thr的密碼子ACA第9頁/共64頁

由于同義密碼子的使用頻率與細胞內(nèi)對應(yīng)的tRNA的豐度有正比關(guān)系，稀有密碼子對應(yīng)的tRNA的豐度很低，有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變。解決這一問題的辦法：

通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率的同義密碼子。在表達系統(tǒng)中共表達稀有密碼子tRNA基因，以提高大腸桿菌細胞內(nèi)稀有密碼子tRNA的豐度。共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因第10頁/共64頁

在所有的大腸桿菌稀有密碼子tRNA中，tRNAArg（AGG/AGA）含量最少，而AGG和AGA密碼子在真核基因中經(jīng)常出現(xiàn)。人尿激酶原ProUK，新型組織纖溶酶原激活劑NTA等基因中都含有較多的AGG和AGA密碼子，在大腸桿菌中直接表達的水平很低，但在大腸桿菌中共表達tRNAArg（AGG/AGA）基因argU后，這些基因的表達水平能明顯得到提高。

共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因第11頁/共64頁

現(xiàn)在還沒有一個固定規(guī)則來判定稀有密碼子的存在是否確實會對翻譯過程產(chǎn)生明顯的不利影響。因為稀有密碼子存在的位置、分布的均勻性、mRNA的二級結(jié)構(gòu)的不同決定了它對翻譯是有差別的。所有的結(jié)論要通過實驗才能得出。

由于大腸桿菌防御體系的自身保護作用，大腸桿菌中的核酸酶和蛋白質(zhì)水解酶能夠降解目標(biāo)基因mRNA

和目標(biāo)基因產(chǎn)物，這種降解作用程度對不同的基因或蛋白質(zhì)而言是不同的，具有一定的專一性和選擇性。共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因第12頁/共64頁蛋白質(zhì)水解酶的特點

細胞質(zhì)是蛋白水解酶含量最多的區(qū)域，目標(biāo)蛋白在細胞質(zhì)中最容易受到蛋白水解酶的作用。通過對已知大腸桿菌細胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)的統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)N末端為Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp殘基的蛋白質(zhì)，含有Pro、Glu、Ser、Thr豐富區(qū)的蛋白質(zhì)降解，穩(wěn)定性較差。在細胞內(nèi)有多肽碎片、突變的異常蛋白和外界物理因素的刺激的條件下，大腸桿菌細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)水解酶活力往往能達到比較高的水平。共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因第13頁/共64頁利用蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)把目標(biāo)蛋白最終積累在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌。對分子量較小的目標(biāo)基因進行融合表達或串聯(lián)聚合表達。共表達能提高特定目標(biāo)穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因。對蛋白質(zhì)序列中的蛋白質(zhì)水解酶敏感區(qū)域和識別位點進行改造。在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性的措施第14頁/共64頁

但必須指出的是，由于目標(biāo)蛋白本身的性質(zhì)和用途的不同，上述幾種方法在使用上是受到一定的限制的。主要表現(xiàn)為：大腸桿菌對分子量較大的目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)運和分泌效率一般比較低，不能滿足大規(guī)模制備的需要。蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛，生長速度慢，使高密度發(fā)酵比較困難。融合表達使目標(biāo)蛋白的構(gòu)象與天然狀態(tài)不一樣，導(dǎo)致生物比活力降低，甚至沒有活性。融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學(xué)切割出單體目標(biāo)蛋白。酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除?；瘜W(xué)法比酶法成本低，但不少裂解試劑有毒性。對蛋白質(zhì)序列進行改造需要有基本的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，而目前這方面的數(shù)據(jù)庫還不完整。第15頁/共64頁

大腸桿菌高密度發(fā)酵時大規(guī)模制備蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個菌體對目標(biāo)基因的表達水平基本不變的前提下，通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實現(xiàn)總表達量的提高。目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種。高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞第16頁/共64頁構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌

高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長速率降低和乙酸的積累，乙酸的存在對目標(biāo)基因的高效表達有明顯的抑制作用。這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問題。雖然在發(fā)酵過程中可采取通氧氣，提高攪拌速度，控制補料速度等措施來控制溶氧飽和度，減少乙酸的產(chǎn)生。但從實際應(yīng)用上看，這些措施都有一定的滯后效應(yīng)，難以做到比較精確的控制。因此構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌，是從根本上解決問題的途徑之一。高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞第17頁/共64頁

利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對氧的利用率的生物學(xué)性質(zhì)，把透明顫菌血紅蛋白基因vgb

導(dǎo)入大腸桿菌細胞內(nèi)以增加其對溶氧的寬容度。從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值。用基因敲出技術(shù)缺失大腸桿菌的磷酸乙酰酶基因pta1和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合途徑被阻斷。改變代謝流的方向，通過共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因pdc1和乙醇脫氫酶基因adh2導(dǎo)入大腸桿菌，使丙酮酸代謝有選擇地向生成3‘-羥基丁酮或乙醇的方向進行。高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞第18頁/共64頁構(gòu)建蛋白質(zhì)水解酶活力低的工程化宿主菌

對于以可溶性或分泌形式表達的目標(biāo)蛋白而言，隨后發(fā)酵后期各種蛋白酶的累積，目標(biāo)蛋白會遭到蛋白水解酶的作用而被降解。為了使對蛋白酶比較敏感的目標(biāo)蛋白也能獲得較高水平的表達，需要構(gòu)建蛋白水解酶活性低的工程化宿主菌。

rpoH基因編碼大腸桿菌RNA聚合酶的r32亞基，r32亞基對大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用。rpoH基因缺陷的突變株已經(jīng)被構(gòu)建，研究結(jié)果表明它能明顯提高目標(biāo)基因的表達水平。到目前為止，已知的大腸桿菌蛋白水解酶基因缺陷的突變株都已被獲得，其中一部分具有實際應(yīng)用的潛力。高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞第19頁/共64頁大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢構(gòu)建各種表達載體建立新的表達系統(tǒng)目前研究的重點完善現(xiàn)有的表達系統(tǒng)，解決表達系統(tǒng)中還存在的缺陷等方面。這些研究工作主要包括：

重組蛋白質(zhì)的正確折疊、構(gòu)象形成和分泌

菌體表面表達技術(shù)及其應(yīng)用

重組蛋白質(zhì)修飾加工研究第20頁/共64頁大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢共表達與蛋白質(zhì)折疊過程密切相關(guān)的分子伴侶包涵體是由于在新合成的大量目標(biāo)蛋白質(zhì)的折疊過程中，大腸桿菌細胞內(nèi)參與折疊的蛋白質(zhì)因子的量不能滿足需要，無法形成正確的構(gòu)象而產(chǎn)生的，因此在大腸桿菌內(nèi)共表達與蛋白質(zhì)折疊過程密切相關(guān)的分子伴侶，折疊酶或硫氧化蛋白基因可以使目標(biāo)基因可溶性表達的比例明顯上升。研究表明這種作用是具有專一性的，不同的目標(biāo)蛋白需要不同類型的蛋白因子共表達。在有些情況下需要多個蛋白因子共表達才能達到預(yù)期的目標(biāo)。第21頁/共64頁大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢共表達人或小鼠的二硫鍵異構(gòu)酶、促進二硫鍵形成和正確折疊大腸桿菌周質(zhì)空間通過二硫鍵形成酶DsbA和DsbB二個蛋白維持適當(dāng)?shù)难趸€原態(tài)勢使蛋白質(zhì)的二硫鍵形成。共表達人或小鼠的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）PDI能互補dsbA缺陷株，但在dsbB缺陷株中PDI失去原有的功能

PDI對目標(biāo)蛋白的二硫鍵形成和正確折疊的促進作用可以受到谷胱甘肽的調(diào)節(jié)。

PDI具有的二硫鍵異構(gòu)，交換功能有效地彌補了DsbA

和DsbB功能上的不足，從而提高了目標(biāo)蛋白正確折疊的比例。第22頁/共64頁大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢降低蛋白質(zhì)合成的速率，從而增加正確折疊重組蛋白質(zhì)

從phoA基因合成速度低的突變株中發(fā)現(xiàn)其分泌在周質(zhì)空間的phoA的產(chǎn)物-----堿性磷酸酯酶比野生型菌株有顯著增加，由于只有構(gòu)象正確的酶原才能被大腸桿菌蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)識別和分泌，這一結(jié)果表明了目標(biāo)蛋白合成的速率能對其構(gòu)象形成正確與否產(chǎn)生影響。采用較弱的啟動子或部分誘導(dǎo)強啟動子的方法可降低蛋白質(zhì)合成的速率，從而達到增加正確折疊重組蛋白質(zhì)的目的。第23頁/共64頁大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢改造信號肽的序列和結(jié)構(gòu)，提高分泌效率

比較成功的例子是發(fā)現(xiàn)了把堿性磷酸酯酶基因phoA信號肽的疏水區(qū)置換為多聚Leu殘基能明顯提高分泌效率。表明信號肽核心部位疏水性的增強有利于它與細胞膜的相互作用。這一結(jié)果為天然信號肽優(yōu)化改造的設(shè)計提供了很好參考依據(jù)。第24頁/共64頁大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢大腸桿菌表面表達技術(shù)的建立膜蛋白基因在大腸桿菌中表達的技術(shù)逐漸成為研究的熱點領(lǐng)域，膜蛋白表達技術(shù)的發(fā)展促進了大腸桿菌表面技術(shù)的建立。外源蛋白質(zhì)在菌體表面表達的優(yōu)點是大腸桿菌可直接用于制備疫苗，進行生物催化和作為探針篩選藥物。在一定程度上能與噬菌體展示系統(tǒng)相媲美。第25頁/共64頁大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢大腸桿菌表面表達技術(shù)的建立主要通過三條途徑是目標(biāo)蛋白呈現(xiàn)在菌體表面：

把外源序列插入LamB、OmpA、PhoE等外膜蛋白的膜外區(qū)把外源蛋白導(dǎo)入大腸桿菌鞭毛或傘毛的結(jié)構(gòu)這二種方法適合表達一段長度小于100個氨基酸殘基的外源序列，因為較大的外源序列的插入往往會使外膜蛋白不能形成原來的三維結(jié)構(gòu)，影響它轉(zhuǎn)運過程和在膜上的定位。

在脂蛋白、lgA蛋白酶、ompA基因的N端或C端融合外源基因這種融合表達的方法對外源基因的限制條件就比較小，其序列可在50到500氨基酸殘基長度范圍內(nèi)。第26頁/共64頁大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢重組蛋白質(zhì)修飾加工研究

蛋白質(zhì)C末端酰胺化和側(cè)鏈糖基化是常見的翻譯后修飾加工類型，目前C末端酰胺化一般都是在體外通過肽酰甘氨酸酰胺酶把C末端甘氨酸轉(zhuǎn)換為氨基把其他微生物的肽酰甘氨酸酰胺酶，真核生物糖基化過程所涉及的酶系導(dǎo)入大腸桿菌的設(shè)想很早就被提出，但這些工作都還在探索之中。其中需要研究的主要問題有：

如何使肽酰甘氨酸酰氨酶在大腸桿菌內(nèi)有較高的活力和專一性；如何通過基因工程技術(shù)改造真核生物的糖基化體系使其能整合到大腸桿菌的染色體中和對糖基化位置、糖基種類和長度進行控制。

第27頁/共64頁重組工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略四、基因工程菌的穩(wěn)定性第28頁/共64頁重組工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失。

分裂不穩(wěn)定性整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）四、基因工程菌的穩(wěn)定性第29頁/共64頁

受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝

能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動降解程序四、基因工程菌的穩(wěn)定性重組工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機制第30頁/共64頁重組工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機制重組質(zhì)粒在受體細胞質(zhì)粒分裂時的不均勻分配

這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因受體細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排四、基因工程菌的穩(wěn)定性第31頁/共64頁重組質(zhì)粒的逃逸率

當(dāng)含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長時，培養(yǎng)系統(tǒng)中一部分細胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細胞數(shù)與總細胞數(shù)之比稱為重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率。四、基因工程菌的穩(wěn)定性第32頁/共64頁重組質(zhì)粒的逃逸率重組質(zhì)粒逃逸的原因有：高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料促進重組質(zhì)粒滲透受體細胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時不均勻分配，細胞所含重組質(zhì)?？截悢?shù)的差異隨著細胞分裂次數(shù)增多而加劇四、基因工程菌的穩(wěn)定性第33頁/共64頁質(zhì)粒穩(wěn)定性分析方法：將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻涂布于不含抗性標(biāo)記抗生素的平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)10~12h，然后隨機挑選100個菌落接種到含抗性標(biāo)記抗生素的平板培養(yǎng)基上，統(tǒng)計長出的菌落數(shù)。每一個樣品應(yīng)取3次重復(fù)的結(jié)果，計算出比值，該比值反映了質(zhì)粒的穩(wěn)定性。四、基因工程菌的穩(wěn)定性第34頁/共64頁影響基因工程穩(wěn)定性的因素遺傳特性載體的性質(zhì)宿主的選擇外源基因整合到宿主染色體發(fā)酵工藝培養(yǎng)基生長速率限制性基質(zhì)溫度pH和溶氧外源基因表達四、基因工程菌的穩(wěn)定性第35頁/共64頁培養(yǎng)基一些基因重組菌在復(fù)合培養(yǎng)基中顯示較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性

微生物在含有有機氮源如酵母抽提物、蛋白胨等營養(yǎng)豐富的復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，由于培養(yǎng)基提供了生長必須的氨基酸和其他物質(zhì)，微生物的生長較在基本培養(yǎng)基中快。四、基因工程菌的穩(wěn)定性第36頁/共64頁比生長速率

基因重組細菌的比生長速率對質(zhì)粒穩(wěn)定性有很大的影響。提高比生長速率有助于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性?；蛑亟M細菌的比生長速率與培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，如溫度、pH，溶氧，限制性營養(yǎng)物質(zhì)濃度，有害代謝產(chǎn)物濃度等。在一定的溫度和pH下，限制性基質(zhì)濃度往往是決定比生長速率的主要因素。四、基因工程菌的穩(wěn)定性第37頁/共64頁限制性基質(zhì)

一般培養(yǎng)基中各成分并不是完全平衡的，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，微生物的生長通常會受到一種或是幾種物質(zhì)的限制。限制性基質(zhì)的種類對重組菌有不同的影響。

四、基因工程菌的穩(wěn)定性第38頁/共64頁pH和溶解氧pH和溶氧是影響微生物生長的重要參數(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)基因重組菌時，通常都需要維持一定的pH和溶氧水平。在基因重組菌的高密度培養(yǎng)時，為了維持所需的溶氧水平，除了提高攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，往往還要在通入的空氣中補充氧氣，以提高發(fā)酵罐的供氧能力。

pH和溶氧影響重組酵母菌的穩(wěn)定性。四、基因工程菌的穩(wěn)定性第39頁/共64頁外源基因的表達

外源基因的表達會引起重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性外源基因高效表達時，有可能因競爭利用物質(zhì)、能量、核糖體等干擾宿主細胞的正常代謝活動，并造成質(zhì)粒不穩(wěn)定。

四、基因工程菌的穩(wěn)定性第40頁/共64頁施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素

藥物和食品生產(chǎn)時禁止使用抗生素加入大量的抗生素會使生產(chǎn)成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時間添加抗生素選擇壓力對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無能為力載體上的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組分培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高四、基因工程菌的穩(wěn)定性改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略第41頁/共64頁改進載體受體系統(tǒng)以增加質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括：

將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達型載體中其表達產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細胞

正確設(shè)置載體上的多克隆位點禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)

將受體細胞的致死性基因安裝在載體上同時構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的ssb

基因（DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）四、基因工程菌的穩(wěn)定性改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略第42頁/共64頁分階段控制培養(yǎng)因外源基因表達造成質(zhì)粒不穩(wěn)定性時，可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制

在生長階段使外源基因處于阻遏狀態(tài)，避免因表達造成不穩(wěn)定性問題的發(fā)生；在獲得需要的菌體密度后，再去阻遏或誘導(dǎo)外源基因表達。連續(xù)培養(yǎng)時可以考慮采用多級培養(yǎng)，如在第一級進行生長，維持菌體的穩(wěn)定性，在第二級進行表述。四、基因工程菌的穩(wěn)定性改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略第43頁/共64頁控制目的基因的過量表達

使用可控型啟動子控制目的基因的定時表達及表達程度使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝

培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定四、基因工程菌的穩(wěn)定性改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略第44頁/共64頁工程菌的培養(yǎng)條件對其質(zhì)粒的穩(wěn)定性和表達效率影響很大可調(diào)控的環(huán)境參數(shù)為：培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)溫度、pH和溶解氧濃度。有些含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而采用間歇隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率，從而改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。四、基因工程菌的穩(wěn)定性改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略第45頁/共64頁控制培養(yǎng)條件有些含有質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率，從而改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過間隙供氧的方法和通過改變改變稀釋的方法都可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。例如研究表達干擾素α的大腸桿菌W3110(pEC901)在不同比生長速率下的質(zhì)粒穩(wěn)定性，隨著稀釋率的增加，質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加，干擾素的比效價也明顯增大。四、基因工程菌的穩(wěn)定性改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略第46頁/共64頁固定化

固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性

基因重組大腸桿菌進行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目標(biāo)產(chǎn)物的表達率都有了很大的提高。在游離重組菌系統(tǒng)中常用抗生素，氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質(zhì)粒的手段，往往在大規(guī)模生產(chǎn)中難以應(yīng)用。而采用固定化方法后，這種選擇壓力則可被省去。不同的宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。四、基因工程菌的穩(wěn)定性改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略第47頁/共64頁

基因工程菌的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)設(shè)備基因工程菌的分離純化工藝五、基因工程菌的培養(yǎng)和分離純化技術(shù)第48頁/共64頁基因工程菌培養(yǎng)方式基因工程菌發(fā)酵的基本操作方式有：分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)操作簡單，但因不能控制生長，獲得的菌體密度也有限半連續(xù)培養(yǎng)（補料分批）

在一次投料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，流加一定量的營養(yǎng)，使細胞進一步的生長，或得到更多的代謝產(chǎn)物連續(xù)培養(yǎng)不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。連續(xù)培養(yǎng)則多用于動力學(xué)特征和穩(wěn)定性等研究。透析培養(yǎng)固定化培養(yǎng)第49頁/共64頁基因工程菌培養(yǎng)方式補料分批培養(yǎng)補料分批培養(yǎng)是將種子液接入發(fā)酵液反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法。在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長所需的良好微環(huán)境，延長其生長對數(shù)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補料措施結(jié)合起來，根據(jù)基因工程菌的生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補料的流加速率。第50頁/共64頁基因工程菌培養(yǎng)方式連續(xù)培養(yǎng)

連續(xù)培養(yǎng)是將種子液接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達到一定程度后，開動進料和出料蠕動泵，以一定稀釋率進行不間斷培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)可以為微生物提供恒定的生活環(huán)境，控制其比生長速率，為研究基因工程菌的發(fā)酵動力學(xué)、生理生化特性、環(huán)境因素對基因表達的影響等創(chuàng)造了良好的條件。

第51頁/共64頁基因工程菌培養(yǎng)方式連續(xù)培養(yǎng)但是由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。為了解決這一問題，人們將工程菌的生長階段和基因表達階段分開，進行兩階段連續(xù)培養(yǎng)。在這樣的系統(tǒng)中關(guān)鍵的控制參數(shù)是誘導(dǎo)水平、稀釋率和細胞比生長速率。優(yōu)化這三個參數(shù)以保證在第一階段培養(yǎng)時質(zhì)粒穩(wěn)定，菌體進入第二階段后可獲得最高表達水平或最大產(chǎn)率。第52頁/共64頁基因工程菌培養(yǎng)方式透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)技術(shù)是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。采用膜透析裝置是在發(fā)酵過程中用蠕動泵將發(fā)酵液抽出打入罐外的膜透析器的一側(cè)循環(huán)，其另一側(cè)通入透析液循環(huán)，在補料分批培養(yǎng)中，大量乙酸在透析器中透過半透膜，降低培養(yǎng)基中的乙酸濃度，并可通過在透析液中補充養(yǎng)分而維持較合適的基質(zhì)濃度，從而獲得高密度菌體。

第53頁/共64頁基因工程菌培養(yǎng)方式透析培養(yǎng)膜的種類、孔徑、面積，發(fā)酵液和透析液的比例，透析液的組成，循環(huán)流速，開始透析的時間和透析培養(yǎng)的持續(xù)時間段都對產(chǎn)物的產(chǎn)率有影響。第54頁/共64頁基因工程菌培養(yǎng)方式固定化培養(yǎng)

基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維