基因工程操作

基因工程操作第1頁(yè)/共44頁(yè)基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程實(shí)質(zhì)結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因重組基因工程的概念第2頁(yè)/共44頁(yè)DNA重組技術(shù)的基本工具“分子手術(shù)刀”──“分子縫合針”──“分子運(yùn)輸車”──限制（性核酸內(nèi)切）酶DNA連接酶基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體第3頁(yè)/共44頁(yè)限制性核酸內(nèi)切酶主要是從的一種酶。識(shí)別雙鏈DNA分子的某種，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的斷開。形成兩種末端原核生物中分離純化出來特定的核苷酸序列磷酸二酯鍵粘性末端平末端第4頁(yè)/共44頁(yè)二、“分子縫合針”——DNA連接酶1、種類：2、作用部位：兩類連接黏性末端E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶磷酸二酯鍵連接黏性末端和平末端第5頁(yè)/共44頁(yè)基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體通常有三種:作為載體的條件：在進(jìn)行基因工程操作中,真正被用作載體的質(zhì)粒都是在

質(zhì)粒λ噬菌體衍生物動(dòng)植物病毒天然質(zhì)粒人工改造的能自我復(fù)制；有切割位點(diǎn)；有遺傳標(biāo)記基因；對(duì)受體細(xì)胞無害、易分離基礎(chǔ)上進(jìn)行過第6頁(yè)/共44頁(yè)基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與表達(dá)（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）（目的基因的檢測(cè)與鑒定）第7頁(yè)/共44頁(yè)一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子2、獲取目的基因的常用方法有哪些?（1）從基因文庫(kù)中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成請(qǐng)閱讀P9-11頁(yè)第8頁(yè)/共44頁(yè)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子終止子基因的結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子原核真核能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子

不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子內(nèi)含子：外顯子：第9頁(yè)/共44頁(yè)結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNA第10頁(yè)/共44頁(yè)原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較

由于原核生物沒有內(nèi)含子(沒有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)),動(dòng)物和植物內(nèi)含子的剪接系統(tǒng)不同,所以不能相互剪接內(nèi)含子,所以只能用沒有內(nèi)含子的cDNA。連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第11頁(yè)/共44頁(yè)(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第12頁(yè)/共44頁(yè)前提:已知目的基因的脫氧核苷酸序列方法：1.DNA受熱（90-95OC）變性解旋為單鏈2.冷卻后（55-60OC）DNA引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合、3.在適宜的溫度下（70-75OC）熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq

酶）作用下延伸合成互補(bǔ)鏈。指數(shù)增長(zhǎng)歸納第13頁(yè)/共44頁(yè)72℃94℃55℃PCR循環(huán)第14頁(yè)/共44頁(yè)模板DNA95℃第15頁(yè)/共44頁(yè)P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物第16頁(yè)/共44頁(yè)P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第17頁(yè)/共44頁(yè)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第18頁(yè)/共44頁(yè)P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束第2輪開始第19頁(yè)/共44頁(yè)P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第20頁(yè)/共44頁(yè)P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束第21頁(yè)/共44頁(yè)P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

第22頁(yè)/共44頁(yè)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因原理：在體外進(jìn)行DNA復(fù)制體內(nèi)DNA復(fù)制基本條件參與組分在DNA復(fù)制中的作用高溫打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制模板4種脫氧核苷酸合成子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶正常工作第23頁(yè)/共44頁(yè)①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：選修1P60聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第24頁(yè)/共44頁(yè)⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第25頁(yè)/共44頁(yè)三、人工合成

如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過DNA合成儀用化學(xué)方法之間合成！第26頁(yè)/共44頁(yè)5.基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因第27頁(yè)/共44頁(yè)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。它們各自的作用是什么?目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因目的基因的表達(dá)所需物質(zhì)：第28頁(yè)/共44頁(yè)1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建——

核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同第29頁(yè)/共44頁(yè)質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）——

核心同一種(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.過程:第30頁(yè)/共44頁(yè)(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化——方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第31頁(yè)/共44頁(yè)1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）農(nóng)桿菌介紹：（2）原理及適用范圍(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第32頁(yè)/共44頁(yè)2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（2）程序：(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少（2）方法：

目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動(dòng)物用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子第33頁(yè)/共44頁(yè)(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功檢測(cè)—鑒定——①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交第34頁(yè)/共44頁(yè)鞏固練習(xí)：1、有關(guān)基因工程敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用

B、重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的

C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料2、下列關(guān)于酶的說法不正確的是（）A、限制酶廣泛存在于各種生物中，微生物中很少分布B、一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列C、不同的限制酶切割DNA的切點(diǎn)不同D、限制酶的作用主要是用來提取目的基因3、下列哪項(xiàng)不是基因工程中經(jīng)常使用的用來運(yùn)載目的基因的載體（）

A、細(xì)菌質(zhì)粒B、噬菌體

C、動(dòng)植物病毒D、細(xì)菌核區(qū)的DNADDAD第35頁(yè)/共44頁(yè)4、下列說法正確的是（）

A、DNA連接酶最初是從人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的

B、限制酶的切口一定是GAATTC堿基序列

C、質(zhì)粒是基因工程中唯一用作運(yùn)載目的基因的運(yùn)載體

D、利用運(yùn)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制的過程可稱為“克隆”5、20世紀(jì)70年代，創(chuàng)立了一種新興的生物技術(shù)——基因工程，實(shí)施該工程的最終目的是（）

A、定向提取生物體的DNA分子B、定向地對(duì)DNA分子進(jìn)行人工剪切

C、在生物體外對(duì)DNA分子進(jìn)行改造D、定向地改造生物的遺傳性狀DD第36頁(yè)/共44頁(yè)6、下列關(guān)于基因工程的敘述中錯(cuò)誤的是（）

A、基因工程的出現(xiàn)使人類有可能按照自己的意愿定向改造生物，培育新品種

B、基因工程技術(shù)是唯一能沖破遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙，培育生物新類型的方法

C、基因工程的基本工具是：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和基因的運(yùn)載體

D、基因工程的研究成果，目前大多需要通過發(fā)酵工程和酶工程來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化7、在基因工程中，作為基因運(yùn)輸工具的運(yùn)載體，下列特征除哪項(xiàng)外，都是運(yùn)載體必須具備的條件（）

A、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制，并穩(wěn)定地保存

B、具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)

C、必須是細(xì)菌的質(zhì)粒或噬菌體D、具有某些標(biāo)記基因BC第37頁(yè)/共44頁(yè)1）以下說法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體

C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接

D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C練習(xí)第38頁(yè)/共44頁(yè)2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是

A、能復(fù)制