生物電子顯微術(shù)第一章課件

生物電子顯微術(shù)3/14/20231生物電子顯微術(shù)1緒論基本概念EM發(fā)展史EM分類(lèi)及特點(diǎn)電鏡技術(shù)的應(yīng)用各種顯微鏡性能與特點(diǎn)的比較2電子顯微鏡的基本知識(shí)TEM的結(jié)構(gòu)和原理SEM的結(jié)構(gòu)和原理3/14/202323超薄切片技術(shù)基本概念普通超薄切片技術(shù)4負(fù)染色技術(shù)5金屬投影和復(fù)型技術(shù)金屬投影技術(shù)復(fù)型技術(shù)6EM冷凍制樣技術(shù)概述冷凍超薄切片技術(shù)冷凍斷裂(蝕刻)及復(fù)型技術(shù)冷凍安全規(guī)則3/14/202339X-ray顯微分析X-ray微區(qū)分析的基本原理X-ray顯微分析儀工作的基本原理X-ray顯微分析的方法及應(yīng)用10其他顯微技術(shù)掃描隧道顯微鏡原子力顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡掃描電-聲顯微鏡3/14/20235生物電子顯微術(shù)課時(shí)安排講授：30學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)：10學(xué)時(shí)主要內(nèi)容：電鏡的原理、結(jié)構(gòu)（TEM，SEM）電鏡的樣品制備技術(shù)1)超薄切片技術(shù)4)金屬投影及復(fù)型技術(shù)2)負(fù)染色技術(shù)5)SEM制樣技術(shù)3)冷凍制樣技術(shù)6)其他制樣技術(shù)應(yīng)用舉例3/14/20236主要參考文獻(xiàn)生物電子顯微術(shù)張景強(qiáng)中山大學(xué)出版實(shí)用生物電子顯微術(shù)林鈞安遼寧科技出版生物電子顯微術(shù)教程陳力北師大出版電子顯微鏡與電子光學(xué)黃蘭友科學(xué)出版生物醫(yī)學(xué)電子顯微技術(shù)程時(shí)北醫(yī)、協(xié)和生物學(xué)工作者實(shí)用生物電子顯微術(shù)[英}

G．Ａ．ＭＥＥＫ1976

參考文獻(xiàn)1，2，3圖書(shū)館均有3/14/202372．電子顯微術(shù)：以電子顯微鏡為工具，對(duì)物質(zhì)（樣品）進(jìn)行物理、化學(xué)、成分、超微結(jié)構(gòu)等方面研究的一種技術(shù)。

電子顯微術(shù)定義:

電子顯微學(xué)是凝聚態(tài)物理、材料科學(xué)、乃至生命科學(xué)的交叉學(xué)科，是物質(zhì)科學(xué)研究的一個(gè)重要組成部分。它是以電子顯微學(xué)等方法,在原子尺度上對(duì)物質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究分析,從而促進(jìn)了新物質(zhì)、新結(jié)構(gòu)、新性能、新現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，極大地推動(dòng)了新材料、新器件的發(fā)展。

3/14/202393．超微結(jié)構(gòu)：指一般光學(xué)顯微鏡不能分辨的細(xì)微形態(tài)結(jié)構(gòu)（亞顯微結(jié)構(gòu)），直至生物大分子結(jié)構(gòu)（蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂類(lèi)）。4．電子顯微方法：ElectronMicroscopy指利用電子與固體樣品作用時(shí)所發(fā)出的信息，對(duì)樣品進(jìn)行微區(qū)觀察和分析的一種方法。1mm=103μm1μm=103nm1nm=10?1?=10-10m3/14/2023101.2電子顯微鏡的發(fā)展概況光學(xué)顯微鏡的發(fā)展(LM:lightmicroscope)光鏡的誕生人眼分辨率：人肉眼能分辨清楚的兩點(diǎn)之間的最短距離．用“”表示．13世紀(jì)玻璃的發(fā)明制造眼鏡、放大鏡16世紀(jì)歐洲放大鏡=0.01M=3~30倍1590年荷蘭眼鏡商Hans之子---Janssen裝配具有劃時(shí)代意義的“顯微鏡”1665年英國(guó)物理學(xué)家RobertHook(虎克)第一臺(tái)光學(xué)顯微鏡1675年荷蘭Leeuwen.Hook(列文.賀克M=270倍,共研制247臺(tái)光鏡高倍率的光鏡18世紀(jì)到19世紀(jì)中葉英、法、意相繼研制消色差顯微鏡M=1500~2000人的視力提高了1000多倍0.2μm3/14/202311表1-1電磁波各光譜區(qū)的一些參數(shù)及相應(yīng)的結(jié)構(gòu)分析方法

3/14/202313可見(jiàn)光波長(zhǎng)4000~8000?

opt=0.4*光紫外線(xiàn)波長(zhǎng)=3900~130?紫外線(xiàn)顯微鏡opt=1000?X-ray=100~0.5?但無(wú)法偏轉(zhuǎn)不能成像目前,光鏡最好分辨率opt=0.16~0.32μm結(jié)論:

利用波長(zhǎng)的更短光線(xiàn)做照明光源,可提高分辨率。（OR：波長(zhǎng)越短，分辨率越高）

電子波波長(zhǎng)很短易于成像，從而導(dǎo)致電鏡的產(chǎn)生和發(fā)展3/14/202314電鏡的發(fā)展國(guó)外情況電鏡產(chǎn)生的三大理論基礎(chǔ)

Thomson（1897）證明電子的存在

L.de.Broglie(德.1923)提出微觀粒子的波粒二相性

H.Busch(德.1926)建立幾何電子光學(xué)理論電子的存在19世紀(jì)50年代德.波恩Geissler

3/14/202315幾何電子光學(xué)理論電子光學(xué)：指研究和利用電子流的偏轉(zhuǎn)、聚焦、成像規(guī)律的一門(mén)學(xué)科。1925年，柏林工學(xué)院M.knoll和A.Matthias嘗試做聚焦的電子束透鏡1926年，H.Busch帶有鐵軛的短磁透鏡聚焦理論D.gabor(M.knoll的學(xué)生）包殼透鏡(1948年提出全息技術(shù)全息技術(shù)之父并獲諾貝爾獎(jiǎng))1928-1929,Ernst.Ruska極靴磁透鏡,現(xiàn)代磁透鏡透射電鏡的誕生1932年，M.Knoll和他的學(xué)生E.Ruska發(fā)明了電鏡,放大倍數(shù)16倍;改進(jìn)后75Kv,1.2萬(wàn)倍1939年,西門(mén)子制造第一臺(tái)商品透射電鏡1940年,Helmut.Ruska,研究噬菌體,建立第一個(gè)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室1986年Ernst.Ruska和Gerd.Binnig、Heinirich.Rothrer獲得諾貝爾物理獎(jiǎng)3/14/202317掃描電鏡的誕生1935年，M.knoll設(shè)計(jì)第一臺(tái)SEM1956年，二次電子探測(cè)器出現(xiàn)1956年，SEM商品化國(guó)內(nèi)情況校外狀況TEM1953年，長(zhǎng)春光機(jī)所第一臺(tái)XD-100型100kvTEM1965年，中科院科儀廠(chǎng)DX-2型TEM100kv5?1970年，上海新躍儀表廠(chǎng)DXB1_12型TEM40萬(wàn)1977年，上海新躍DXB2_12型TEM80萬(wàn)2?SEM1975年，中科院科儀廠(chǎng)第一臺(tái)SEMDX-3100?DX-560?

1980年，中科儀KYKY-1000B1993年，中科儀KYKY-2000KYKY-2800 KYKY-2800BKYKY-38003/14/202318STM(scanningtunnelingmicroscope)1987年，中科儀、中科院化學(xué)所白春禮等研制第一臺(tái)STMSSX-1型國(guó)產(chǎn)電鏡的缺點(diǎn)：

制造工藝粗燥、自動(dòng)化程度低、清潔度差我校情況1980‘sDX-2型TEM1996年，KYKY-2800型數(shù)字式掃描電鏡分辨率6nm，放大倍數(shù)10萬(wàn)3/14/202319樣品制備簡(jiǎn)單，可觀察較大的樣品分辨率高，30~40

?倍率連續(xù)可變，從4倍~~15萬(wàn)倍可配附件，進(jìn)行微區(qū)的定量、定性分析觀察對(duì)象：樣品表面微觀結(jié)構(gòu)掃描透射電鏡（STEM）兼顧SEM/TEM的特點(diǎn)、造價(jià)高、可觀察較厚樣品(0.2~04m)分辨率不如TEM高,高分辨型0.3~0.5nm;附件型1.5~3nm在200KV時(shí)，輻射損傷小、污染小能過(guò)檢測(cè)到掃描透射電子，獲取更多超微結(jié)構(gòu)信息圖像的反差和亮度易調(diào)節(jié)，切片可以不染色顯像方式：熒光屏、顯像管觀察對(duì)象：表面、內(nèi)部3/14/202321超高壓電鏡（UHVEM:ultra-highvoltageelectronmicroscope）HV<500kv為高壓電鏡,一般TEM：120~500KVHV>500kv為超高壓電鏡，Hvmax=3MV

其特點(diǎn)：穿透能力強(qiáng)、可觀察較厚的樣品μm級(jí)分辨率高，2

?（晶格分辨率）單色性好，色差小，成像質(zhì)量好輻射損傷小體積龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價(jià)格昂貴、需專(zhuān)用的防護(hù)裝置觀察對(duì)象：主要非生物材料的晶格結(jié)構(gòu)、觀察細(xì)胞骨架系統(tǒng)（微梁、微絲）3/14/202322分析電鏡（AEM:analysiselectronelectronmicroscope)

連續(xù)X-ray背底扣除能量：Z特征X-ray的能量

特征X-ray

波長(zhǎng)：Z特征X-ray的波長(zhǎng)波譜儀（WDS）Wavelength-dispersespectrometer

微區(qū)定量分析，4Be92U慢20~60分，靈敏度高能譜儀（EDS）Energy-dispersespectrometer

微區(qū)定性分析，11Na92U快2~3分，靈敏度低3/14/202323優(yōu)點(diǎn)：可在真空、大氣、常溫等不同環(huán)境下工作，甚至可將樣品浸在水和其它溶液中，不需要特別的制樣技術(shù)，并且探測(cè)過(guò)程對(duì)樣品無(wú)損傷。這些特點(diǎn)適用于研究生物樣品和在不同試驗(yàn)條件下對(duì)樣品表面的評(píng)價(jià)，例如對(duì)于多相催化機(jī)理、超導(dǎo)機(jī)制、電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中電極表面變化的監(jiān)測(cè)等。STM在生物領(lǐng)域的應(yīng)用：STM在生物和有機(jī)材料一領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。盡管目前還存在著如何解釋生物樣品的STM圖象、如何更好地制備生物樣品以及選擇合適襯底以沉積生物分子等問(wèn)題，但實(shí)際應(yīng)用中已取得了不少好結(jié)果。例如在真空、大氣和溶液條件下的DNA研究，球蛋白、膠原蛋白及紅血球的研究等。STM在納米科技中的應(yīng)用：

STM不僅能夠?qū)悠繁砻孢M(jìn)行成像，而且還能在納米尺度上對(duì)材料表面進(jìn)行刻蝕與修飾。由微觀到宏觀，即直接操縱單個(gè)原子和分子，對(duì)它們進(jìn)行排列組合，以形成新的物質(zhì)，或制造出一定功能的機(jī)器這是實(shí)現(xiàn)納米加工的新思想，STM的出現(xiàn)使這一思想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。自從STM問(wèn)世以來(lái)，STM作為一種納米加工的工具的研究已涉及到表面直接刻寫(xiě)、電子束誘導(dǎo)沉積以及單原子操縱等方面，并取得了一批高水平的研究結(jié)果。3/14/202325硅111面7′7原子重構(gòu)象

硅片是大家熟悉的制作晶體管和大規(guī)模集成電路的半導(dǎo)體材料，為了得到表面清潔的單質(zhì)材料，要對(duì)硅片進(jìn)行高溫加熱和退火處理，在加熱和退火處理的過(guò)程中硅表面的原子進(jìn)行重新組合，結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，這就是所謂的重構(gòu)。

3/14/202326科學(xué)家把碳60分子每十個(gè)一組放在銅的表面組成了世界上最小的算盤(pán)。與普通算盤(pán)不同的是，算珠不是用細(xì)桿穿起來(lái)，而是沿著銅表面的原子臺(tái)階排列的.3/14/202329這是中國(guó)科學(xué)院化學(xué)所的科技人員利用納米加工技術(shù)在石墨表面通過(guò)搬遷碳原子而繪制出的世界上最小的中國(guó)地圖。3/14/202330DNA分子拉成的DNA圖象3/14/202331原子力顯微鏡（AFM：atomicforcemicroscope)導(dǎo)電樣品、非導(dǎo)電樣品均可觀察分辨率達(dá)到原子水平可以在真空、超高真空、電化學(xué)環(huán)境、常溫低溫條件下工作應(yīng)用于表面科學(xué)、生命科學(xué)、材料科學(xué)

注：以STM、AFM為基礎(chǔ)，衍生出掃描探針顯微鏡（SPM：Scanningprobemicroscope）：如激光力顯微鏡（LFM）、掃描電化學(xué)顯微鏡（SECM）3/14/202332環(huán)境掃描電鏡（ESEM）特點(diǎn)：多種真空狀態(tài)：高、低、超低真空

1Torr=1mmHg柱壓力=1/760大氣壓=133.3Pa

粗真空：760~10乇低真空：10~10-3乇 高真空：10-3~10-8乇超高真空：10-8乇以下多種真空條件下可得SE像、BE像，且

=4nm樣品室可充氣體:水氣、氮?dú)鈩?dòng)態(tài)分析：樣品溫度從-185℃~1000℃制樣簡(jiǎn)單：樣品無(wú)須鍍膜、脫水干燥真正的“環(huán)境”條件，可直接觀察含水、含油樣品缺點(diǎn)：造價(jià)太高$30萬(wàn)Philips低氣壓空間3/14/2023331.4電鏡技術(shù)的應(yīng)用生物科學(xué)方面：細(xì)胞生物學(xué)分子生物學(xué)動(dòng)物學(xué)和植物學(xué)微生物學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)臨床醫(yī)學(xué)農(nóng)林畜牧科學(xué)植物保護(hù)良種繁育（遺傳育種）土壤改良與成分分析動(dòng)植物疾病的快速診斷與防治3/14/202334Ⅳ材料科學(xué)機(jī)械部件的疲勞、失效分析金屬金相學(xué)建筑材料分析Ⅴ其他方面：礦產(chǎn)、地質(zhì)與考古、海關(guān)、造紙、電池生產(chǎn)、物理學(xué)與化學(xué)、環(huán)境保護(hù)

3/14/2023351.5各種顯微鏡性能與特點(diǎn)的比較種類(lèi)LMTEMSEM照明源可見(jiàn)光電子束電子束透鏡玻璃透鏡電子透鏡電子透鏡最高分辨率0.1~0.2μm（紫外顯微鏡）1~2?（晶格）3?（點(diǎn)）4~30~100?

放大倍率1×～2000×100×~80萬(wàn)7×~20萬(wàn)焦點(diǎn)深度淺(500倍時(shí)2μm)中(500倍時(shí)500μm)深(500倍時(shí)1000μm)特征表一3/14/202336種類(lèi)LMTEMSEM視場(chǎng)100mm(1×)2mm(100×)10mm(10×)圖象色彩有無(wú)無(wú)顯相方式直接觀察熒光屏顯象管樣品種類(lèi)切片、涂片切片、復(fù)型膜,涂片各種實(shí)體樣品厚度厚（數(shù)微米）極薄<1000?不限樣品環(huán)境空氣真空真空續(xù)表一特征3/14/202337樹(shù)立正確的人類(lèi)認(rèn)識(shí)觀DM機(jī)體器官解剖水平（宏觀）LM細(xì)胞細(xì)胞水平（微觀）EM亞