朊病毒及其檢測(cè)

朊病毒及其檢測(cè)當(dāng)前1頁(yè)，總共41頁(yè)。CONTENTS一、前言二、PrPC與PrPSC三、PrPC的功能四、朊病毒的致病機(jī)理五、朊病毒的檢測(cè)六、問題與展望當(dāng)前2頁(yè)，總共41頁(yè)。一、前言當(dāng)前3頁(yè)，總共41頁(yè)。1引言

傳染性海綿狀腦病(transmissiblespongi-formencephalopathy,TSE)是一類致死性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。在哺乳動(dòng)物中常見瘋牛病、羊瘙癢癥、貓海綿狀腦病以及傳染性水貂腦軟化病等；在人身上則發(fā)現(xiàn)了庫(kù)魯病、致死性家族失眠癥、克-雅氏病以及格斯特曼綜合癥等?；疾〉娜撕蛣?dòng)物，大腦皮層的神經(jīng)元細(xì)胞會(huì)發(fā)生進(jìn)行性空泡化,星形膠質(zhì)細(xì)胞不斷增生,造成灰質(zhì)變薄而白質(zhì)相對(duì)明顯,最后變成海綿狀態(tài)。當(dāng)前4頁(yè)，總共41頁(yè)。（左）病羊神經(jīng)組織的海綿狀損傷。（右）病人大腦組織切片，海綿狀病變及周圍的沉淀斑當(dāng)前5頁(yè)，總共41頁(yè)。2朊病毒的發(fā)現(xiàn)200多年前英國(guó)的牧人就注意到羊的一種致死性疾病。

20世紀(jì)初M.fadyian提出該病是由寄生蟲引起的。1936年Cuille等發(fā)現(xiàn)瘙癢因子有傳染性，用濾膜過濾后仍具有傳染性，而提出該因子是一種病毒。1966年Gajdusek證實(shí)了CJD的傳染性，并根Scrapie、Kuru、CJD3種疾病的共同特征提出了傳染性海綿狀腦病(TSE)這一概念。1882美國(guó)生物化學(xué)家Prusiner證明并提出羊瘙癢病的病原體是一種不含核酸和脂類的疏水性糖蛋白，稱為蛋白質(zhì)侵染因子(proteinaceousinfectiousparticle，簡(jiǎn)稱prion)。當(dāng)前6頁(yè)，總共41頁(yè)。3朊病毒引起的人類疾病當(dāng)前7頁(yè)，總共41頁(yè)。4朊病毒引起的人類疾病

當(dāng)前8頁(yè)，總共41頁(yè)。5疾病來(lái)源人類prion病約有15%的患者具有遺傳性，即為家族性疾病，為常染色體顯性遺傳，因編碼PrP的基因突變所致。遺傳性由食用瘋牛病病牛及其他染病動(dòng)物所致。食源性傳播目前已報(bào)道全世界因醫(yī)源性傳染而引起的prion病已達(dá)160多例，而且，輸血及血制品是否也能傳播此病，已引起人們的關(guān)注。醫(yī)源性感染當(dāng)前9頁(yè)，總共41頁(yè)。6致病特點(diǎn)2一旦發(fā)病，呈慢性、進(jìn)行性發(fā)展，以死亡告終；5患者以癡呆、共濟(jì)失調(diào)、震顫等為主要臨床表現(xiàn)。4無(wú)抗原性，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答；1潛伏期長(zhǎng)，可達(dá)數(shù)月至數(shù)年甚至數(shù)十年；3病理學(xué)特征是大腦皮質(zhì)神經(jīng)元空泡變性、死亡、缺失，而星形膠質(zhì)細(xì)胞高度增生，故大腦皮質(zhì)疏松呈海綿狀：有淀粉樣斑塊形成，HE染色淡紅腦組織中無(wú)炎癥反應(yīng)：無(wú)淋巴細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；當(dāng)前10頁(yè)，總共41頁(yè)。二、PrPC與PrPSC當(dāng)前11頁(yè)，總共41頁(yè)。結(jié)構(gòu)

轉(zhuǎn)化理化性質(zhì)PrPC與PrPSC當(dāng)前12頁(yè)，總共41頁(yè)。朊病毒蛋白(PrionProtein)，簡(jiǎn)稱為PrP。PrPC是指一般情況下，正常宿主細(xì)胞基因編碼產(chǎn)生的朊蛋白，無(wú)致病性，是一種糖基磷脂酞肌醇(CPI)修飾膜在糖蛋自。廣泛表達(dá)于脊椎動(dòng)物，它與神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持、淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核酸代謝等有關(guān)。PrPC當(dāng)其發(fā)生構(gòu)象改變后可變成致病性朊病毒(PrPsc)，PrPsc可引起包括瘋牛病在內(nèi)的一系列致死性神經(jīng)性疾病。相對(duì)分子質(zhì)量為27～30KD，故又稱作PrP27～30。PrPSC1PrPC與PrPSC當(dāng)前13頁(yè)，總共41頁(yè)。PrPc

PrPScα螺旋β折疊

二者是異構(gòu)體,由同一染色體基因PRNP編碼，其氨基酸序列完全一致,根本差別在于它們構(gòu)象上的差異，PrPC分子中含42%的α螺旋，β折疊僅為3%，而PrPSC的β折疊高達(dá)43%，α螺旋為30%。故一般認(rèn)為，PrPSC是由于PrPC發(fā)生蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，一些α螺旋變構(gòu)為β折疊，三維構(gòu)象發(fā)生變化而產(chǎn)生的，同時(shí)帶來(lái)一系列理化性質(zhì)的變化。2PrPC與PrPSC的結(jié)構(gòu)當(dāng)前14頁(yè)，總共41頁(yè)。3PrPC與PrPSC的理化性質(zhì)當(dāng)前15頁(yè)，總共41頁(yè)。4PrPC向PrPSC的轉(zhuǎn)化當(dāng)前16頁(yè)，總共41頁(yè)。（PrPSc的累積）（PrP轉(zhuǎn)化為PrPSc)(PrP與PrPSc之間反應(yīng))（PrPc內(nèi)生）模型一：該模型是假定一個(gè)單一的PrPSC分子與一個(gè)單一的PrPC分子結(jié)合并催化其轉(zhuǎn)化成PrPSC。這兩個(gè)PrPSC分子,可以繼續(xù)轉(zhuǎn)換成PrPC。當(dāng)前17頁(yè)，總共41頁(yè)。(伸長(zhǎng))（構(gòu)象變化)(破碎成多個(gè)部分)（感染）模型二：假設(shè)PrPSC只是纖維，捆綁PrPCfibril，然后將其轉(zhuǎn)化成PrPSC，形成更長(zhǎng)的纖維，這一現(xiàn)象可在染病毒致病中觀察到。當(dāng)前18頁(yè)，總共41頁(yè)。三、PrPC的功能當(dāng)前19頁(yè)，總共41頁(yè)。核酸代謝抗氧化參與神經(jīng)系統(tǒng)Cu2+代謝維持神經(jīng)系統(tǒng)功能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡PrPC的功能當(dāng)前20頁(yè)，總共41頁(yè)。1維持神經(jīng)系統(tǒng)功能

在所有細(xì)胞類型中,以神經(jīng)元表達(dá)PrPC水平最高，且PrPC高度富集于突觸處(終板處也有富集)，這提示PrPC對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有特殊的重要性。PrPC除實(shí)驗(yàn)表明，PrPC缺失雖不引起肉眼可見的行為和發(fā)育障礙，但在整體動(dòng)物水平來(lái)看可導(dǎo)致與晝夜節(jié)律有關(guān)的行為異常。在神經(jīng)系統(tǒng)水平，PrPC缺失可導(dǎo)致電生理參數(shù)方面的改變。當(dāng)前21頁(yè)，總共41頁(yè)。有證據(jù)表明，在出現(xiàn)進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)失調(diào)癥狀PrPC缺失小鼠中，發(fā)現(xiàn)腦部嚴(yán)重萎縮，蒲肯野細(xì)胞異常，因PrPC缺失可能引起蒲肯野細(xì)胞過度興奮而導(dǎo)致小鼠死亡。PrPC缺陷鼠還表現(xiàn)出對(duì)外源性銅和過氧化氫等應(yīng)激誘導(dǎo)劑應(yīng)答方面的改變。在細(xì)胞水平，PrPC缺陷鼠的神經(jīng)元在培養(yǎng)時(shí)存活能力下降，且對(duì)銅和阿拉伯糖胞苷(AraC)等所導(dǎo)致的氧化損傷和毒性的敏感性增加；星形膠質(zhì)細(xì)胞在攝取谷氨酸方面有異常；小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)興奮物質(zhì)的反應(yīng)性下降；在突觸形成中有結(jié)構(gòu)改變。由此可見，PrPC可能在一定程度上參與神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持。當(dāng)前22頁(yè)，總共41頁(yè)。2參與神經(jīng)組織的Cu2+代謝

PrPC作為腦組織中膜在銅結(jié)合蛋自參與神經(jīng)組織中Cu2+的穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)節(jié)，當(dāng)轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSC就失去結(jié)合Cu2+的能力，造成神經(jīng)組織中Cu2+含量異常，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。

Cu2+對(duì)不同神經(jīng)細(xì)胞PrPC的影響也不相同。當(dāng)前23頁(yè)，總共41頁(yè)。3抗氧化

PrPC通過與銅原子形成復(fù)合物而發(fā)揮抗氧化活性。PrPC借其八肽重復(fù)區(qū)最多可結(jié)合4個(gè)銅原子。結(jié)合后形成的復(fù)合物具有抗氧化活性，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。當(dāng)前24頁(yè)，總共41頁(yè)。4參與淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

PrPC可高水平地在人T、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞中表達(dá)，不同細(xì)胞中表達(dá)PrPC的糖基組成、糖鏈形狀及蛋自酶解的敏感性都有差異。

T細(xì)胞的活化伴隨著其表而PrPC的表達(dá)上調(diào)，且PrPC在記憶T細(xì)胞比初始T細(xì)胞的表達(dá)水平高。當(dāng)前25頁(yè)，總共41頁(yè)。5細(xì)胞凋亡

在PrP敲除小鼠神經(jīng)元中，多種凋亡相關(guān)蛋自顯著增加，線粒體Ca2+含量改變、細(xì)胞色素c釋放，都表明PrP參與細(xì)胞凋亡調(diào)控過程。

體外試驗(yàn)也顯示PrPC能夠保護(hù)人的神經(jīng)元免受Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而缺失八肽序列或C端帶有突變的PrP均不具有該活性。當(dāng)前26頁(yè)，總共41頁(yè)。6核酸代謝

Gabus等根據(jù)小鼠中瘟癢病的感染過程會(huì)因鼠自血病病毒（MuLV）的復(fù)制而加速，以及人類PrP功能上類似于NCp7，可輔助反轉(zhuǎn)錄酶合成前病毒DNA等現(xiàn)象，提出PrP可能參與了體內(nèi)核酸代謝過程。當(dāng)前27頁(yè)，總共41頁(yè)。四、朊病毒的致病機(jī)理當(dāng)前28頁(yè)，總共41頁(yè)。致病機(jī)理電泳活性染色法阮病毒學(xué)說

“yeastprions”學(xué)說

當(dāng)前29頁(yè)，總共41頁(yè)。1阮病毒學(xué)說

PrPC是一種膜蛋白，其C端含有23個(gè)氨基酸組糖基磷酸肌醇(GPI)錨受體結(jié)合位點(diǎn)，因此可通過糖基肌醇磷酸脂(glycoirmitolphosphohptds)聯(lián)在膜上，定位于細(xì)胞膜的穴樣內(nèi)陷類結(jié)構(gòu)域（CLDs），在神經(jīng)元，當(dāng)膜漿膜上的PrPC變成為PrPSC后，PrPSC脫落并聚集在神經(jīng)元的溶酶體。當(dāng)達(dá)到數(shù)量，就可使神經(jīng)元細(xì)胞破裂，形成神經(jīng)組織的空泡化，并使星型膠質(zhì)細(xì)胞增生，當(dāng)前30頁(yè)，總共41頁(yè)。當(dāng)前31頁(yè)，總共41頁(yè)。2“yeastprions”學(xué)說

當(dāng)前32頁(yè)，總共41頁(yè)。3蛋白的氧化反應(yīng)學(xué)說楊池明提出了瘋牛病蛋白長(zhǎng)壽命自由基即為瘋牛病中的亞病毒的理論設(shè)想，他認(rèn)為真正的瘋牛病蛋白亞病毒可能是由蛋白的氧化反應(yīng)所形成的瘋牛病蛋白自由基。

應(yīng)用此理論能夠解釋瘋牛病的一些病理現(xiàn)象。當(dāng)前33頁(yè)，總共41頁(yè)。五、朊病毒的檢測(cè)當(dāng)前34頁(yè)，總共41頁(yè)。接種傳遞組織印記法酶聯(lián)免疫吸附法毛細(xì)管凝膠電泳朊病毒的檢測(cè)當(dāng)前35頁(yè)，總共41頁(yè)。取組織標(biāo)本

10倍連續(xù)稀釋研磨10個(gè)稀釋濃度分別接種小鼠直到死亡或盲傳幾代

出現(xiàn)癥狀殺死，取腦組織檢查

死亡不出現(xiàn)癥狀

觀察飼養(yǎng)24h未死亡正常飼養(yǎng)

補(bǔ)接1動(dòng)物的接種傳遞實(shí)驗(yàn)當(dāng)前36頁(yè)，總共41頁(yè)。取標(biāo)本甲酚脫毒甲醛固定石蠟包埋

55℃干燥二甲苯脫蠟

異丙醇水化

空氣干燥蛋白酶K消化

鹽酸胍處理

1.前處理2.檢測(cè)NC：硝酸纖維素膜

前處理品免疫學(xué)檢測(cè)取出NC膜5-7μm薄片收集在NC上2mm厚切片切片55℃水浴2組織印記法當(dāng)前37頁(yè)，總共41頁(yè)。勻漿離心處理顯色最后酶標(biāo)儀讀板將腦組織置于8%的Zwittergent3-12和0.5%十二烷基肌氨酸鈉中

加入特異性一抗加入酶標(biāo)二抗最后加入底物用膠原酶、DNaseI（脫氧核糖核酸酶I），蛋白酶K處理

收集富含PrPsc沉淀，將所得沉淀溶于3-4mol/L硫氰酸胍，包被酶標(biāo)版

3酶聯(lián)免疫吸附法當(dāng)前38頁(yè)，總共41頁(yè)。人工合成的PrPsc特異性肽鏈標(biāo)記熒光

一定量的特異性抗體、羊腦提取物

標(biāo)記的肽鏈與抗體結(jié)合后，遷移率發(fā)生改變

未與抗體結(jié)合的肽鏈，遷移率不變當(dāng)腦提取物中存在微量的PrPsc時(shí)

當(dāng)腦提取物中不存在微量的PrPsc時(shí)

電泳PrPsc與標(biāo)記肽鏈競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體

無(wú)競(jìng)爭(zhēng)存在

結(jié)合型肽鏈與游離型肽鏈的比例發(fā)生變化

比例固定不變游離的與結(jié)合的肽鏈分離（比例固定）4毛細(xì)管凝膠電泳免疫測(cè)定法當(dāng)前39頁(yè)，總共41頁(yè)。六、展望當(dāng)前40頁(yè)，總共41頁(yè)。高級(jí)結(jié)構(gòu)致病原因感染性

如何對(duì)非結(jié)晶型的朊病毒蛋白進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確