體外評價(jià)體系介紹課件

化妝品檢驗(yàn)中心體外評價(jià)體系簡介體外評價(jià)體外評價(jià)是指在活生物體之外的環(huán)境中利用細(xì)胞、模擬活生物體模型等平臺(tái)進(jìn)行的評價(jià)。在生物評價(jià)領(lǐng)域中，體外評價(jià)具有以下方面的特點(diǎn)1、符合“3Rs”原則（Reduction，Refinement、Replacement）2、檢測結(jié)果的穩(wěn)定性好、再現(xiàn)性高3、可為臨床評價(jià)提供有效的技術(shù)支持體外評價(jià)體系的構(gòu)成評價(jià)項(xiàng)目的確立1評價(jià)內(nèi)容的分析2評價(jià)方案的建立3最佳評價(jià)平臺(tái)及方法的篩選4安全性評價(jià)5功效性評價(jià)6評價(jià)結(jié)果74、光毒性評價(jià)（UV照射）對經(jīng)過被檢物質(zhì)處理過的BALB/c3T3小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行UVA照射后，以細(xì)胞攝取中性紅為指標(biāo)測算出細(xì)胞存活率，確定50%細(xì)胞毒性的被檢物質(zhì)濃度（TC50）。通過UVA（+）、UVA（-）照射時(shí)的TC50應(yīng)用下列公式計(jì)算出PIF值（PhotoIrritantFactor）、MPE值可對被檢物質(zhì)的光毒性潛能進(jìn)行評價(jià)?？梢詫我怀煞趾统善愤M(jìn)行評價(jià)。UVA(-)UVA(+)樣品濃度增加細(xì)胞生存率降低1、抗氧化應(yīng)激作用評價(jià)氧化應(yīng)激（OxidativeStress，OS）是指破壞了強(qiáng)氧化劑和抗氧化劑的平衡導(dǎo)致的潛在傷害，氧化劑、抗氧化劑平衡的破壞是細(xì)胞損傷的主要原因。皮膚作為機(jī)體最外層的保護(hù)層，不可避免的受到紫外線與刺激物的作用，使皮膚細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ReactiveOxygenSpecies,ROS）過多增加，誘發(fā)氧化應(yīng)激作用，成為引起人體細(xì)胞老化的潛在因素。功效性評價(jià)項(xiàng)目人體皮膚細(xì)胞中氧化應(yīng)激作用的形成原因①紫外線照射（UVA、UVB）②過多活性氧的累計(jì)（?

OH、O2-?、H2O2、1O2

）③過氧化脂質(zhì)（氧自由基與多聚不飽和脂肪酸反應(yīng)的產(chǎn)物）抗氧化應(yīng)激作用的評價(jià)評價(jià)方法：對細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激刺激，添加被檢物質(zhì)，通過對細(xì)胞生存率的分析來評估被檢物質(zhì)對氧化應(yīng)激作用的預(yù)防與治療作用。評價(jià)項(xiàng)目：評價(jià)消除由下列因素誘發(fā)的氧化應(yīng)激作用的效果①UVA、UVB照射②抗活性氧（?

OH、O2-?、H2O2、1O2

）③過氧化脂質(zhì)評價(jià)平臺(tái)：正常人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞正常人體皮膚成纖維細(xì)胞被檢物質(zhì)添加時(shí)間點(diǎn)：氧化應(yīng)激刺激前氧化應(yīng)激刺激中氧化應(yīng)激刺激后角質(zhì)形成細(xì)胞成纖維細(xì)胞①促進(jìn)膠原蛋白合成作用評價(jià)表皮基底層真皮皮膚基底層附近膠原蛋白示意圖4型膠原蛋白7型膠原蛋白1型膠原蛋白1型膠原蛋白：存在于真皮的細(xì)胞外基質(zhì)中，形成三股螺旋結(jié)構(gòu)4型膠原蛋白：多數(shù)存在于真皮與表皮之間的基底層中，起到支撐基底層結(jié)構(gòu)的作用7型膠原蛋白：以環(huán)狀結(jié)構(gòu)與基底層相連接，維持真皮基質(zhì)的結(jié)構(gòu)對被檢物質(zhì)是否能提高人體皮膚成纖維細(xì)胞的1型膠原蛋白合成作用進(jìn)行評價(jià)。伴隨年齡的增加及外界環(huán)境的影響，皮膚內(nèi)的1型膠原蛋白含量會(huì)減少，從而形成皺紋和皮膚松弛。本評價(jià)項(xiàng)目，通過向人體皮膚成纖維細(xì)胞添加被檢物質(zhì)后，測定細(xì)胞內(nèi)1型膠原蛋白合成量（ELISA法），根據(jù)結(jié)果評定被檢物質(zhì)是否具有促進(jìn)膠原蛋白合成的作用。②膠原酶活性阻礙作用膠原酶是一種能水解膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)的分解酶。體內(nèi)膠原酶會(huì)隨年齡的增加以及外界環(huán)境的作用下，促進(jìn)其活性的增加，從而加速其對膠原蛋白的分解，破壞皮膚結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)皺紋、皮膚松弛等皮膚衰老跡象。讓膠原酶與添加了被檢物質(zhì)的膠原蛋白反應(yīng)，測定膠原蛋白的分解程度，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析被檢物質(zhì)是否具有阻礙膠原酶活性增加的作用，評估被檢物質(zhì)的衰老作用。③彈性蛋白酶阻礙作用彈性蛋白酶作用是分解維持肌膚張力的彈性蛋白。隨著年齡增加、過多活性氧的堆積促進(jìn)彈性蛋白酶分解彈性蛋白，是形成皮膚衰老的因素之一。因此，阻礙彈性蛋白酶活性，可恢復(fù)肌膚張力，起到抗衰老的作用。讓彈性蛋白酶與添加了被檢物質(zhì)的彈性蛋白反應(yīng)，測定彈性蛋白的分解程度，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析被檢物質(zhì)是否具有阻礙彈性蛋白酶活性增加的作用，評估被檢物質(zhì)的衰老作用。④促進(jìn)玻尿酸合成作用評價(jià)玻尿酸是一種高分子的多醣體，是由葡萄醛酸-N-乙酸氨基葡萄糖為雙糖分子單位組成的直鏈高分子多醣，平均分子量介于10萬到1000萬Dalton之間，存在于人體皮膚組織中，填充在細(xì)胞與膠原纖維的空間中。具有保持皮膚彈性功能，鎖住大量水分子，對組織具有保濕潤滑作用，使肌膚飽滿年輕有彈性。但隨著老化及年齡的增長，玻尿酸流失速度比生長速度快時(shí)，肌膚也逐漸變得缺乏水分，失去光澤彈性，出現(xiàn)皺紋等老化現(xiàn)象。本評價(jià)項(xiàng)目，通過向人體皮膚成纖維細(xì)胞或人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞添加被檢物質(zhì)后，測定細(xì)胞內(nèi)玻尿酸合成量（ELISA法），根據(jù)結(jié)果評定被檢物質(zhì)是否具有促進(jìn)玻尿酸合成的作用。①黑色素生成抑制作用黑色素細(xì)胞受到紫外線照射后，啟動(dòng)人體保護(hù)機(jī)制生成黑色素，黑色素吸收紫外線的作用避免皮膚細(xì)胞受到損傷。但持續(xù)的照射促進(jìn)了黑色素細(xì)胞活性，導(dǎo)致生成了過量的黑色素，從而在皮膚上形成了色素沉淀與色斑。因此，化妝品成分、產(chǎn)品的黑色素生成抑制作用是評價(jià)其美白功效的重要參數(shù)之一。本評價(jià)項(xiàng)目，將被檢驗(yàn)物質(zhì)添加到黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)，測定黑色素瘤細(xì)胞生成的黑色素含量，分析其抑制黑色素生成的能力，評估其美白作用的功效。評價(jià)平臺(tái)：B16BL6小鼠黑色素瘤細(xì)胞樣品處理后黑色素生成效果樣品濃度小大黑色素抑制效果小大②酪氨酸酶活性阻礙作用酪氨酸酶（Tyrosinase）是黑色素合成的關(guān)鍵酶。對酪氨酸酶活性進(jìn)行阻礙可抑制黑色素的生成。本評價(jià)項(xiàng)目將被檢物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行酪氨酸酶活性阻礙效果對比，以及被檢物質(zhì)濃度與阻礙效果關(guān)系的分析。黑色素形成途徑以及酪氨酸酶活性作用③黑色素分解作用維生素C的黑色素分解效果實(shí)驗(yàn)操作示意圖持續(xù)受到刺激的黑色素細(xì)胞會(huì)生成過多的黑色素，形成色斑與色素沉淀。具有黑色素分解作用的美白化妝品可淡化由黑色素引起的色斑，緩解色素的沉淀。本評價(jià)項(xiàng)目，通過酪氨酸酶的酶作用將酪氨酸合成為黑色素，然后添加被檢物質(zhì)測定其黑色素分解效果，根據(jù)結(jié)果對其黑色素分解能力進(jìn)行評估。②COMETAssay（彗星測定）COMETAssay（彗星測定）也稱為單細(xì)胞凝膠電泳測定技術(shù)，它是一種敏感單鏈或雙鏈DNA突變和破損的遺傳測定方法。

DNA發(fā)生解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來，由于這些DNA的分子量很小，所以在電泳過程中會(huì)離開核DNA向陽極移動(dòng)，形成彗星狀的圖像，而未損傷的DNA部分保持球形。DNA受損越嚴(yán)重，產(chǎn)生的斷片越多并且片段越小，電泳時(shí)遷移的DNA量也就越大，遷移距離越長，熒光顯微鏡下可觀察到尾長增加、尾部熒光強(qiáng)度增強(qiáng)?？捎糜贒NA損傷預(yù)防及修復(fù)作用的評價(jià)。UVB照射后樣品COMETAssay結(jié)果三維仿真皮膚組織模型三維仿真皮膚是由正常人體成纖維細(xì)胞與人體角朊