定量聚合酶鏈反應(yīng)QPCR測定技術(shù)

PCR?

PCR只是一個(gè)簡單的不起眼玩藝

——?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)

PCR只是一個(gè)概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，變成了一項(xiàng)成熟的技術(shù)，后者又上升成為新的概念。…

它最大的特點(diǎn)就是能不斷推出新形式。

——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]當(dāng)前1頁，總共49頁。當(dāng)前2頁，總共49頁。什么是PCR?

我不認(rèn)為PCR能夠用兩種“革命”(政治革命和科學(xué)革命)加以說明?！陌l(fā)明并沒有改變基因操作的本質(zhì)。有了PCR，我們能在更廣的范圍內(nèi)更快、更容易地進(jìn)行基因操作，學(xué)術(shù)界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不過是一種新工具?！?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)當(dāng)前3頁，總共49頁。當(dāng)前4頁，總共49頁。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在這年底（12月16日第一次成功實(shí)驗(yàn)）發(fā)明了PCR。當(dāng)前5頁，總共49頁。PCR發(fā)明過程的簡單回顧當(dāng)前6頁，總共49頁。當(dāng)前7頁，總共49頁。當(dāng)前8頁，總共49頁。當(dāng)前9頁，總共49頁。當(dāng)前10頁，總共49頁。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（2）1985關(guān)于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)當(dāng)前11頁，總共49頁。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（3）1987當(dāng)年7月Cetus公司在美國獲得PCR基本技術(shù)專利批準(zhǔn)。成立于1985年底的Perkin-ElmerCetus儀器公司（PECI）于這一年的11月推出了第一個(gè)PCR試劑產(chǎn)品及第一臺(tái)熱循環(huán)儀。1989Science報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時(shí)代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個(gè)“年度分子”。Hoffmann-LaRoche公司和Cetus開始合作將PCR應(yīng)用于臨床診斷。當(dāng)前12頁，總共49頁。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（4）1990Cetus科學(xué)家D.Gelfand和S.Stoffel發(fā)明了純化TaqDNA多聚酶的方法。第一個(gè)PCR試劑盒用于HLA定量檢測分析。Cetus科學(xué)家H.Erlich和K.Mullis在德國臨床化學(xué)領(lǐng)域獲得生化分析獎(jiǎng)。1991TaqMan技術(shù)發(fā)表。當(dāng)年11月Hoffmann-LaRoche公司從Cetus獲得全球的PCR專利權(quán)。RocheMolecularSystems創(chuàng)建了單一耐熱多聚酶rTth進(jìn)行RT-PCR技術(shù)，并用于臨床RNA病毒檢測。耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶首次由Cetus科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。

當(dāng)前13頁，總共49頁。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（5）1992當(dāng)年3月Cetus公司獲得Taq酶、熱循環(huán)擴(kuò)增儀等專利；1993AMPLICORHCV*首次用于臨床RNAPCR標(biāo)準(zhǔn)試劑盒。

KaryMullis

因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。當(dāng)前14頁，總共49頁。PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（6）

九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開1998年實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開始在中國較廣泛的應(yīng)用于臨床檢測1999年西方發(fā)達(dá)國家嘗試將PCR應(yīng)用于血液篩查當(dāng)前15頁，總共49頁。PCR循環(huán)–第一步–加熱變性靶序列靶序列當(dāng)前16頁，總共49頁。PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’當(dāng)前17頁，總共49頁。PCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase當(dāng)前18頁，總共49頁。第1個(gè)PCR循環(huán)完成后–

得到兩個(gè)拷貝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin當(dāng)前19頁，總共49頁。30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon當(dāng)前20頁，總共49頁。當(dāng)前21頁，總共49頁。PCR擴(kuò)增過程圖示當(dāng)前22頁，總共49頁。PCR擴(kuò)增的理論模式

PCR擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增，每一擴(kuò)增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達(dá)：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示擴(kuò)增效率，Yn表示在n個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，Yn-1為n-1個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。等式僅在限定的擴(kuò)增周期數(shù)（通常為20或30）內(nèi)成立。超過此周期數(shù)，擴(kuò)增過程即由指數(shù)擴(kuò)增降低至穩(wěn)定的擴(kuò)增速率，最終達(dá)到平臺(tái)，不再擴(kuò)增.當(dāng)前23頁，總共49頁。影響PCR擴(kuò)增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交反應(yīng)試劑的相對量樣本在擴(kuò)增儀中的位置的不同臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR擴(kuò)增模板的量靶核酸鏈的再退火及酶過量可致E降低當(dāng)前24頁，總共49頁。PCR和定量問題

高濃度/高效率

高濃度/低效率

低濃度/高效率

N : 擴(kuò)增分子的數(shù)目n : 擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)log-phaseanalysisNnend-pointanalysis當(dāng)前25頁，總共49頁。定量PCR與定性PCR測定的最根本的區(qū)別

定量PCR測定的測定點(diǎn)為PCR擴(kuò)增的指數(shù)擴(kuò)增期;而定性PCR測定的測定點(diǎn)則多為PCR擴(kuò)增的平臺(tái)期。當(dāng)前26頁，總共49頁。定量PCR的方法定量PCR方法可歸為三大類，即外標(biāo)方法、動(dòng)力學(xué)方法和內(nèi)標(biāo)共擴(kuò)增方法定量還可分為絕對定量（即測定X的分子數(shù)量）和相對定量（即測定不同樣本中X的比率）

當(dāng)前27頁，總共49頁。用外標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法當(dāng)前28頁，總共49頁。使用外標(biāo)的定量PCR方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）方法簡便，容易建立；（2）使用雙孔重復(fù)測定，這種方法可得到非常準(zhǔn)確的結(jié)果，甚至可排除管間的差異，但不能排除樣本間的差異；缺點(diǎn)：（1）PCR反應(yīng)體系中小的區(qū)別也會(huì)對測定造成較大的影響。由于最后在擴(kuò)增效率上的差異，從而使得定量測定精密度和重復(fù)性不佳。因此，如果建立一個(gè)使用外標(biāo)準(zhǔn)的PCR定量方法，則必須進(jìn)行方法的精密度（批內(nèi)變異）和重復(fù)性（批間變異）分析，以確定其應(yīng)用的局限性。當(dāng)前29頁，總共49頁。TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR當(dāng)前30頁，總共49頁。當(dāng)前31頁，總共49頁。分子信標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量PCR當(dāng)前32頁，總共49頁。動(dòng)力學(xué)定量PCR方法

第一步：確定PCR擴(kuò)增的效率；第二步：根據(jù)相應(yīng)的公式計(jì)算原始模板數(shù)。當(dāng)前33頁，總共49頁。擴(kuò)增效率的計(jì)算(1)如果在PCR每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中擴(kuò)增效率為常數(shù)，則可通過在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期的數(shù)個(gè)連續(xù)的或非連續(xù)的周期中取擴(kuò)增樣本，然后測定每份樣本中的產(chǎn)物Yn的量來測定E值。有必要收集2份以上的樣本，最好是盡可能多的樣本以確證擴(kuò)增效率保持恒定；換句話說，也就是PCR尚未達(dá)到擴(kuò)增效率開始降低時(shí)的階段。如果取的是連續(xù)的樣本，則可從公式（1）測得E值；當(dāng)前34頁，總共49頁。擴(kuò)增效率的計(jì)算當(dāng)前35頁，總共49頁。擴(kuò)增效率的計(jì)算(2)如果取的樣本不連續(xù)，則可使用下述將公式（2）重排后得到的更為通用的公式，用參數(shù)j（取樣中間隔的周期數(shù)）替代n，Yj（在較高循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量）替代Yn，Yi-j（在較低循環(huán)周期數(shù)取樣的產(chǎn)物量）替代X：E＝－1＋（Yi/Yi-j）1/j

(3)當(dāng)前36頁，總共49頁。X(原始模板數(shù))的計(jì)算

一旦效率確定后，根據(jù)公式（4）可從測定的產(chǎn)物量和循環(huán)周期數(shù)計(jì)算得到X。公式（4）來源于公式（2）的重新排列：X＝Y(jié)n/(1＋E)n（4）當(dāng)前37頁，總共49頁。X的另一種計(jì)算方式(1)

另一種方式是，根據(jù)公式（2）的對數(shù)形式，以所測定的Yn值的對數(shù)對函數(shù)n繪圖得到X值：logYn=logX

+n×log(1+E)(5)當(dāng)n＝0時(shí)，可在圖上讀出X值，或通過對公式（5）的線性回歸計(jì)算X值（圖2）。當(dāng)前38頁，總共49頁。當(dāng)前39頁，總共49頁。動(dòng)力學(xué)方法的特點(diǎn)

這種方法的優(yōu)點(diǎn):(1)不需要外標(biāo)準(zhǔn)；（2）如果能測定PCR產(chǎn)物分子的絕對數(shù)量，則可得到待測樣本的不同的擴(kuò)增效率（Ee)。當(dāng)前40頁，總共49頁。使用非競爭性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法

非競爭性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)：（1）一般為與靶核酸無關(guān)的基因組；（2）既可是內(nèi)源的也可是外源的；（3）與靶核酸無相同的引物結(jié)合位點(diǎn)和擴(kuò)增序列。對于DNA的擴(kuò)增，非競爭性內(nèi)標(biāo)幾乎所有的基因都可應(yīng)用，最常用的有丙酮酸脫氫酶、前腦啡肽或β肌動(dòng)蛋白的基因。而對RNA的擴(kuò)增，則非競爭性內(nèi)標(biāo)較難尋找。理想的mRNA內(nèi)標(biāo)應(yīng)該在整個(gè)細(xì)胞周期中表達(dá)的水平變化不大，此外，其表達(dá)水平應(yīng)接近于靶RNA，而且它們的擴(kuò)增效率應(yīng)相等，因此兩者擴(kuò)增線性區(qū)域是重合的。已有許多的mRNA被嘗試用來作為此種內(nèi)標(biāo)，如HLA、β肌動(dòng)蛋白、GPDH和組蛋白H3.3的mRNA或14SrRNA等。當(dāng)前41頁，總共49頁。以非競爭性內(nèi)標(biāo)定量的主要優(yōu)點(diǎn)內(nèi)標(biāo)的制備簡單復(fù)管測定可排除管間差異，并且在一定程度上，可排除樣本間的差異。當(dāng)前42頁，總共49頁。以非競爭性內(nèi)標(biāo)定量的缺點(diǎn)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)和靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄的效率有可能不同，并且有可能既使針對的是相同的靶核酸逆轉(zhuǎn)錄效率也會(huì)有很大差異。因此，使用這種方法進(jìn)行RNA的定量PCR測定極為困難。在擴(kuò)增過程中的指數(shù)期測定可對原始模板相對定量，但如果沒有驗(yàn)證在一定的擴(kuò)增周期內(nèi)靶核酸和內(nèi)標(biāo)有相同的擴(kuò)增效率，則不能進(jìn)行絕對定量。當(dāng)前43頁，總共49頁。使用競爭性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法

“競爭性”內(nèi)標(biāo)：人為構(gòu)建的可與原始靶核酸競爭酶、核苷酸和引物分子的核酸標(biāo)準(zhǔn)，其特點(diǎn)是，與靶核酸具有相同的引物結(jié)合位點(diǎn)、但引物之間的順序需加以修飾，使得擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測時(shí)能夠很容易地通過諸如凝膠電泳、探針雜交或高效液相層析等方法區(qū)分。對內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的修飾方法包括對野生型基因組的點(diǎn)突變、部份缺失或插入外來順序等，目前尚無通用的規(guī)則或程序來構(gòu)建這種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前44頁，總共49頁。使用競爭性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法使用競爭性內(nèi)標(biāo)既可進(jìn)行相對定量也可進(jìn)行絕對定量。相對定量具有很好的精密度和重復(fù)性。而絕對定量，關(guān)鍵是要證明競爭性內(nèi)標(biāo)和野生型靶核酸的擴(kuò)增效率相同。亦可將競爭性內(nèi)標(biāo)置于含已知量的野生型靶核酸的樣本中同時(shí)擴(kuò)增來評價(jià)。當(dāng)前45頁，總共49頁。使用競爭性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法要定量單份的臨床樣本，必須進(jìn)行數(shù)管競爭性PCR測定，每管中靶核酸的量不變，但改變競爭性內(nèi)標(biāo)的量，因?yàn)橹挥挟?dāng)待測靶核酸與競爭性內(nèi)標(biāo)等摩爾量時(shí)才能有可靠的定量。由于競爭性PCR可排除管間和樣本間的差異，因此，其可作為準(zhǔn)確的PCR定量方法，適用于絕對定量及含低拷貝數(shù)樣本的定量。

當(dāng)前46頁，總共49頁。定量PCR測定的臨床應(yīng)用及

應(yīng)注意的問題為什么要做定量測定？定性和定量測定結(jié)果報(bào)告上的混淆