生物技術(shù)細(xì)胞工程

第三章細(xì)胞工程當(dāng)前1頁(yè)，總共155頁(yè)。主要內(nèi)容第一節(jié)概述第二節(jié)植物細(xì)胞工程第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程第四節(jié)微生物細(xì)胞工程(發(fā)酵工程)當(dāng)前2頁(yè)，總共155頁(yè)。第一節(jié)概述細(xì)胞工程概念2.細(xì)胞工程的發(fā)展3.細(xì)胞工程的基礎(chǔ)知識(shí)4.細(xì)胞工程的相關(guān)技術(shù)5.細(xì)胞工程的應(yīng)用當(dāng)前3頁(yè)，總共155頁(yè)。細(xì)胞工程（cellengineering）：在細(xì)胞水平上，采用類似工程設(shè)計(jì)的方法，運(yùn)用精巧的細(xì)胞學(xué)技術(shù)，有計(jì)劃地改造遺傳結(jié)構(gòu)，從而獲得特定的細(xì)胞及產(chǎn)物的有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科。1.

細(xì)胞工程概念當(dāng)前4頁(yè)，總共155頁(yè)。廣義的細(xì)胞工程

包括所有的生物組織、器官及細(xì)胞離體操作和培養(yǎng)技術(shù)狹義的細(xì)胞工程

指細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。1.

細(xì)胞工程概念當(dāng)前5頁(yè)，總共155頁(yè)。根據(jù)不同的研究層次，細(xì)胞工程分為染色體工程、染色體組工程、細(xì)胞質(zhì)工程、和細(xì)胞融合工程1.

細(xì)胞工程概念當(dāng)前6頁(yè)，總共155頁(yè)。染色體工程是按人們需要，添加，削減或替換生物染色體的技術(shù)，根據(jù)操作對(duì)象的不同，分為動(dòng)物染色體工程和植物染色體工程。染色體組工程改變?nèi)旧w組數(shù)的技術(shù)。如單倍體轉(zhuǎn)變?yōu)槎啾扼w，三倍體西瓜當(dāng)前7頁(yè)，總共155頁(yè)。細(xì)胞質(zhì)工程又稱細(xì)胞拆合工程，是通過物理或化學(xué)方法將細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分開，再進(jìn)行不同細(xì)胞間核質(zhì)重新組合，重新建成新細(xì)胞細(xì)胞融合工程是利用自然或人工的方法使兩個(gè)或幾個(gè)不同細(xì)胞融合為一個(gè)細(xì)胞的過程當(dāng)前8頁(yè)，總共155頁(yè)。根據(jù)研究對(duì)象不同，細(xì)胞工程可分為動(dòng)物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程微生物細(xì)胞工程當(dāng)前9頁(yè)，總共155頁(yè)。2、細(xì)胞工程的發(fā)展當(dāng)前10頁(yè)，總共155頁(yè)。細(xì)胞工程的發(fā)展植物細(xì)胞培養(yǎng)起源：20世紀(jì)初20世紀(jì)30年代，植物細(xì)胞培養(yǎng)研究取得突破1955年，激動(dòng)素能促使培養(yǎng)細(xì)胞分裂20世紀(jì)60年代，建立植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合技術(shù)20世紀(jì)70年代，外源基因能夠植入植物細(xì)胞體內(nèi)1983年，第一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物培育成功20世紀(jì)90年代后，轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化當(dāng)前11頁(yè)，總共155頁(yè)。動(dòng)物細(xì)胞工程起源于疫苗的生產(chǎn)，1920-1950年，開發(fā)出病毒或細(xì)菌疫苗1951年開發(fā)能促使動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)50年代以后開始大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)生物制品70年代基因基因重組和雜交瘤技術(shù)的研究1982年重組人胰島素研究成功，標(biāo)志著細(xì)胞工程商業(yè)化的開始當(dāng)前12頁(yè)，總共155頁(yè)。細(xì)胞工程的發(fā)展前景當(dāng)前13頁(yè)，總共155頁(yè)。過程離體的植物器官、組織或細(xì)胞愈傷組織根、芽植物體外植體脫分化植物激素：細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素再分化植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)條件：

含有全部營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、一定的溫度、空氣、無菌環(huán)境、適合的PH、適時(shí)光照等。當(dāng)前14頁(yè)，總共155頁(yè)。當(dāng)前15頁(yè)，總共155頁(yè)。當(dāng)前16頁(yè)，總共155頁(yè)。植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合正在融合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞愈傷組織雜種植株去細(xì)胞壁纖維素酶果膠酶物理方法化學(xué)方法：離心振動(dòng)電刺激聚乙二醇細(xì)胞分裂植物組織培養(yǎng)植物細(xì)胞融合酶解法人工誘導(dǎo)方法過程當(dāng)前17頁(yè)，總共155頁(yè)。白菜甘藍(lán)白菜－甘藍(lán)當(dāng)前18頁(yè)，總共155頁(yè)。細(xì)胞分化和全能性

多細(xì)胞生物體是由各種各樣形態(tài)和功能都不同的細(xì)胞群所組成。高等動(dòng)、植物由受精卵細(xì)胞開始的胚胎發(fā)生過程隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而使得早期胚胎的細(xì)胞數(shù)量也增加許多。其中有些細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上逐漸發(fā)生了差異，這種細(xì)胞之間差異的發(fā)生過程就是細(xì)胞分化。個(gè)體發(fā)育的過程就是細(xì)胞分化的過程，個(gè)體的各種器官和組織都是通過細(xì)胞分化形成的。3.細(xì)胞工程的基礎(chǔ)知識(shí)當(dāng)前19頁(yè)，總共155頁(yè)。爪蟾的細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)，證明細(xì)胞核的全能性當(dāng)前20頁(yè)，總共155頁(yè)。4.

細(xì)胞工程的相關(guān)技術(shù)無菌操作技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞核移植胚胎移植染色體工程克隆當(dāng)前21頁(yè)，總共155頁(yè)。無菌操作技術(shù)細(xì)胞工程的所有試驗(yàn)都要求再無菌條件下進(jìn)行，要求十分嚴(yán)格的無菌操作。1、無菌室；2、超凈工作臺(tái)；3、生物材料的消毒；4、試驗(yàn)器械、器皿和藥品的滅菌。當(dāng)前22頁(yè)，總共155頁(yè)。無菌操作室的滅菌與消毒緩沖間無菌室首次啟用的無菌室一般可采用福爾馬林熏蒸（5～6m2無菌室用KMnO450g，倒入100ml甲醛（用搪瓷盤），冒濃煙，24hr，氨水中和至無甲醛味），經(jīng)常使用的無菌室在每次實(shí)驗(yàn)前必須開啟紫外燈照射0.5至l小時(shí)，然后避光0.5至l小時(shí)后方可進(jìn)入操作

當(dāng)前23頁(yè)，總共155頁(yè)。無菌室上風(fēng)口下風(fēng)口當(dāng)前24頁(yè)，總共155頁(yè)。緩沖間當(dāng)前25頁(yè)，總共155頁(yè)。培養(yǎng)器材的消毒干熱滅菌法：玻璃器皿、金屬器具等的消毒方法，140～150℃，2～3小時(shí)；濕熱滅菌法：橡膠制品、無菌衣、帽和口罩以及除菌過濾器的清毒，高壓蒸汽滅菌115℃20—30分鐘；紫外線照射滅菌：多孔培養(yǎng)板的滅菌－30分鐘。抽濾除菌：培養(yǎng)基等（培養(yǎng)基通過0.22m過濾裝置－除菌）當(dāng)前26頁(yè)，總共155頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)是指動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞在體外無菌條件的保存和生長(zhǎng)。1、取材和除菌；2、配制培養(yǎng)基，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌；3、接種、培養(yǎng)和傳代。當(dāng)前27頁(yè)，總共155頁(yè)。兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程稱為細(xì)胞融合。細(xì)胞融合技術(shù)的主要過程：1、制備原生質(zhì)體；2、誘導(dǎo)細(xì)胞融合；3、篩選雜合細(xì)胞。細(xì)胞融合技術(shù)當(dāng)前28頁(yè)，總共155頁(yè)。細(xì)胞核移植：利用顯微操作技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個(gè)細(xì)胞中，或?qū)蓚€(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核(或細(xì)胞質(zhì))進(jìn)行交換，從而可能創(chuàng)造無性雜交生物新品種的一項(xiàng)技術(shù)。細(xì)胞核移植童魚——世界上第一條沒有父母的魚“鯽金核質(zhì)雜交魚”當(dāng)前29頁(yè)，總共155頁(yè)。也稱受精卵移植，是指把優(yōu)良種畜的早期胚胎從供體母畜體內(nèi)取出來，移到受體母畜的輸卵管或子宮，“借腹懷胎”繁殖后代的技術(shù)。它是首先應(yīng)用于繁殖家畜而發(fā)展起來的一種生物工程。試管嬰兒胚胎移植當(dāng)前30頁(yè)，總共155頁(yè)?？寺∈侵干矬w通過細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖形成基因型完全相同的后代個(gè)體，簡(jiǎn)稱“無性繁殖”。例：多莉、克隆猴治療性克隆

克隆技術(shù)當(dāng)前31頁(yè)，總共155頁(yè)。多利

克隆猴當(dāng)前32頁(yè)，總共155頁(yè)。277次乳腺細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)；獲得29個(gè)發(fā)育為8細(xì)胞的“胚”；13頭代孕母親；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉”。當(dāng)前33頁(yè)，總共155頁(yè)。預(yù)想的克隆人技術(shù)路線當(dāng)前34頁(yè)，總共155頁(yè)。5.

細(xì)胞工程的應(yīng)用通過細(xì)胞培養(yǎng)物獲得藥物和其他有用的物質(zhì)如人參皂甙通過植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)獲得快速繁殖的無性系植物產(chǎn)品，包括良種苗木、名貴花卉、稀有資源等如蘭花細(xì)胞融合產(chǎn)品如單克隆抗體、番茄薯“二層樓”從細(xì)胞培養(yǎng)中篩選合乎希望的突變細(xì)胞株、再生突變植株，可培育新品種生殖工程上的應(yīng)用如借腹懷胎、試管嬰兒

當(dāng)前35頁(yè)，總共155頁(yè)。當(dāng)前36頁(yè)，總共155頁(yè)。美夢(mèng)終究沒有成功!!番茄薯“二層樓”當(dāng)前37頁(yè)，總共155頁(yè)。第二節(jié)植物細(xì)胞工程1.植物組織培養(yǎng)2.

植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)3.單細(xì)胞分離技術(shù)4.植物體細(xì)胞雜交5.植物細(xì)胞原生質(zhì)體制備與融合6.單倍體植物的誘發(fā)與利用7.人工種子當(dāng)前38頁(yè)，總共155頁(yè)。1.

植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)（概念）是在無菌和人為控制外因（營(yíng)養(yǎng)成分、光、溫度、濕度）條件下，研究、培養(yǎng)植物組織器官，甚至進(jìn)而從中分化、發(fā)育出整體植株的技術(shù)。植物細(xì)胞的全能性（理論基礎(chǔ)）

指具有完整細(xì)胞核的植物細(xì)胞，在一定條件下能不斷分裂和繁殖、發(fā)育成完整植株的潛在能力。當(dāng)前39頁(yè)，總共155頁(yè)。1.

植物組織培養(yǎng)的相關(guān)概念脫分化

植物分化細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，形成愈傷組織。再分化

脫分化的組織或細(xì)胞在一定的條件下可分化為各種不同組織的細(xì)胞類型。愈傷組織植物組織表面形成的一團(tuán)無序生長(zhǎng)的薄壁細(xì)胞團(tuán)。外植體

能被誘發(fā)產(chǎn)生無性增殖系的器官或組織切段。當(dāng)前40頁(yè)，總共155頁(yè)。初代培養(yǎng)最初建立的外植體的無菌培養(yǎng)階段繼代培養(yǎng)將已形成愈傷組織或已分化出根、莖、葉、花等的培養(yǎng)物重新切割，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上以進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)試管苗通過組織培養(yǎng)所獲得的再生植株當(dāng)前41頁(yè)，總共155頁(yè)。植物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)技術(shù)無菌操作技術(shù)組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)花藥及花粉培養(yǎng)離體胚培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)當(dāng)前42頁(yè)，總共155頁(yè)。植物組織培養(yǎng)應(yīng)用試管苗的快速繁殖無病毒植物的培育提取次生代謝產(chǎn)物人工種子的培育轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)當(dāng)前43頁(yè)，總共155頁(yè)。植物組織培養(yǎng)的研究意義運(yùn)用組織培養(yǎng)方法可以在人為的條件下研究細(xì)胞、組織或器官的繁殖、生長(zhǎng)和分化，研究環(huán)境條件對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響。在工廠化育苗技術(shù)上，組織培養(yǎng)是工廠化育苗的生產(chǎn)配方研究和無病毒種苗擴(kuò)繁必須經(jīng)歷的階段；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在中草藥方面的研究不僅可以探索藥用植物生理遺傳和成分生物合成等一系列理論問題，而且還可以為大規(guī)模細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)藥物提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)；在轉(zhuǎn)基因植物種苗的研究與開發(fā)中，組織培養(yǎng)技術(shù)即是基本的研究手段，又是規(guī)模開發(fā)的基本生產(chǎn)形式。當(dāng)前44頁(yè)，總共155頁(yè)。外植體愈傷組織新植株當(dāng)前45頁(yè)，總共155頁(yè)。1.

植物組織培養(yǎng)進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，一般要經(jīng)歷以下五個(gè)階段：1.預(yù)備階段；2.誘導(dǎo)去分化階段；3.繼代增殖階段；4.生根成芽階段；5.移栽成活階段。當(dāng)前46頁(yè)，總共155頁(yè)。預(yù)備階段(1)選擇合適的外植體；外植體的部位、年齡及大小。(2)除去病原菌及雜菌；對(duì)外植體除菌的一般程序如下：外植體自來水多次漂洗消毒劑處理無菌水反復(fù)沖洗無菌濾紙吸干(3)配制適宜的培養(yǎng)基。當(dāng)前47頁(yè)，總共155頁(yè)。培養(yǎng)基培養(yǎng)基的成分無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物，包括氮、磷、鉀、鈣、硫和鎂等大量元素以及一些微量元素如錳、鋅、銅、鐵、硼碳源，如糖類，2％~4%的蔗糖或葡萄糖是適宜的碳源。維生素，維生素B1(硫胺素)是必需的。當(dāng)前48頁(yè)，總共155頁(yè)。培養(yǎng)基培養(yǎng)基的成分生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(植物激素)植物生長(zhǎng)素，如IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚-3-丁酸)、NAA(萘乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)、2,4,5-T(三氯苯氧乙酸)。細(xì)胞分裂素，如BAP(芐氨基嘌呤)、6-BA(芐基腺嘌呤)、2-ip(異戊烯氨基嘌呤)、激動(dòng)素(呋喃氨基嘌呤)。有機(jī)附加物，一般是蛋白質(zhì)水解物、酵母提取物、麥芽提取物和椰汁。當(dāng)前49頁(yè)，總共155頁(yè)。培養(yǎng)環(huán)境條件光照強(qiáng)度、光質(zhì)、光周期溫度24-28度；最佳24-26度相對(duì)濕度容器相對(duì)濕度高達(dá)96%-100%；培養(yǎng)室70%-80%當(dāng)前50頁(yè)，總共155頁(yè)。誘導(dǎo)去分化階段使各種細(xì)胞重新處于旺盛有絲分裂的分生狀態(tài)，培養(yǎng)基中應(yīng)添加較高濃度的生長(zhǎng)素，其結(jié)果形成愈傷組織。當(dāng)前51頁(yè)，總共155頁(yè)。繼代增殖階段繼代培養(yǎng)及時(shí)分離愈傷組織成適當(dāng)大小轉(zhuǎn)移到新配制的培養(yǎng)基上，促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)增殖。當(dāng)前52頁(yè)，總共155頁(yè)。生根成芽階段誘導(dǎo)胚狀體的形成。胚狀體：在組織培養(yǎng)中分化產(chǎn)生的具有芽端和根端類似合子胚的構(gòu)造。該階段需細(xì)胞分裂素和光照。當(dāng)前53頁(yè)，總共155頁(yè)?？Х鹊挠鷤M織咖啡的胚狀體當(dāng)前54頁(yè)，總共155頁(yè)。移栽成活階段適度的光、溫、濕條件?？稍谌斯夂蚴抑绣憻捯欢螘r(shí)間。當(dāng)前55頁(yè)，總共155頁(yè)。煉苗的原因試管苗由于是在無菌、有營(yíng)養(yǎng)供給、適宜光照和溫度，近100%的相對(duì)濕度環(huán)境條件下生長(zhǎng)從葉片上看，試管苗的角質(zhì)層不發(fā)達(dá)，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)了大量的水孔，而且，氣孔的數(shù)量、大小也往往超過普通苗

當(dāng)前56頁(yè)，總共155頁(yè)。石斛組培苗煉苗當(dāng)前57頁(yè)，總共155頁(yè)。組織培養(yǎng)的應(yīng)用脫毒快速繁殖

快速繁衍珍稀瀕危植物、名優(yōu)特新品種和脫毒苗。植物種質(zhì)資源的保存、挽救瀕于滅絕的植物通過花藥和花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株、縮短育種年限當(dāng)前58頁(yè)，總共155頁(yè)。脫毒原因：大多數(shù)農(nóng)作物，特別是通過無性繁殖的植物，受到一種或多種病毒的侵染，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。外植體：莖尖或頂端分生組織有時(shí)莖尖培養(yǎng)需要與熱處理或化學(xué)處理方法結(jié)合，才能起到有效的脫毒結(jié)果。脫毒苗：利用組織培養(yǎng)獲得的無病毒植株。當(dāng)前59頁(yè)，總共155頁(yè)。草莓當(dāng)前60頁(yè)，總共155頁(yè)。快速繁殖植物組培苗快速繁殖的四個(gè)階段無菌苗的建立組培苗的增殖生根移栽當(dāng)前61頁(yè)，總共155頁(yè)。百合當(dāng)前62頁(yè)，總共155頁(yè)。組培室當(dāng)前63頁(yè)，總共155頁(yè)。大花蕙蘭當(dāng)前64頁(yè)，總共155頁(yè)。種質(zhì)資源的保存保存一個(gè)細(xì)胞就相當(dāng)與保存一粒種子，但所占的空間僅為原來的幾萬(wàn)分之一，而且在-193度的液氮中可以長(zhǎng)時(shí)間保存，不像種子那樣需要年年更新或經(jīng)常更新。

當(dāng)前65頁(yè)，總共155頁(yè)。獲得單倍體植株、縮短育種年限通過花藥和花粉組織培養(yǎng)可以獲得單倍體植物，大大縮短了育種時(shí)間。使新品種的培育過程大大簡(jiǎn)化當(dāng)前66頁(yè)，總共155頁(yè)。2.

植物細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)植物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用當(dāng)前67頁(yè)，總共155頁(yè)。植物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展1956年，Routier和Nickell提出工業(yè)化培養(yǎng)植物細(xì)胞以提取其天然產(chǎn)物。之后，用此方法生產(chǎn)了哈爾堿、人參皂角苷、維斯納精、紫杉醇等。目前，最大批量工業(yè)化培養(yǎng)細(xì)胞(煙草細(xì)胞)已達(dá)20噸。我國(guó)，培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇(抗腫瘤)當(dāng)前68頁(yè)，總共155頁(yè)。植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)適于大量快速地增殖細(xì)胞，但不利于次生物質(zhì)的積累。固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢而次生物質(zhì)含量高。當(dāng)前69頁(yè)，總共155頁(yè)。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)懸浮細(xì)胞的來源：愈傷組織需分散細(xì)胞，其方法：用果膠酶打破細(xì)胞間的連接增加生長(zhǎng)激素的濃度，加快細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)速度起始培養(yǎng)把已建立的愈傷組織轉(zhuǎn)移到適當(dāng)容器里的液體培養(yǎng)基中，然后置于搖床上不斷振蕩。當(dāng)前70頁(yè)，總共155頁(yè)。進(jìn)液管排液管進(jìn)氣管出氣管封閉式植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于操作缺點(diǎn)：次生代謝物積累較少當(dāng)前71頁(yè)，總共155頁(yè)。固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)固定化細(xì)胞方法：包埋、吸附載體：海藻酸鈣、K-角叉菜膠、瓊脂及瓊脂糖、聚丙烯酸凝膠、纖維膜、硅藻土、中空纖維、陶瓷等固定化細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)系統(tǒng)：平床培養(yǎng)系統(tǒng)、立柱培養(yǎng)系統(tǒng)當(dāng)前72頁(yè)，總共155頁(yè)。平床培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，能更有效的合成次生代謝產(chǎn)物缺點(diǎn)：占地面積大，次生代謝產(chǎn)物累計(jì)不均勻，氧氣供應(yīng)有限當(dāng)前73頁(yè)，總共155頁(yè)。立柱培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：次生代謝產(chǎn)物的合成度增強(qiáng)，占地面積小當(dāng)前74頁(yè)，總共155頁(yè)。固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定反應(yīng)槽內(nèi)的細(xì)胞量，使反應(yīng)活性穩(wěn)定，能長(zhǎng)期連續(xù)運(yùn)行；能提高反應(yīng)效率在生物反應(yīng)器中固定化細(xì)胞的密度比懸浮培養(yǎng)密度增加2~4倍包埋細(xì)胞抵抗剪切的能力增強(qiáng)，可使用簡(jiǎn)單的生物反應(yīng)器當(dāng)前75頁(yè)，總共155頁(yè)。固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)固定化細(xì)胞培養(yǎng)使細(xì)胞與培養(yǎng)基隔離，下游加工胞內(nèi)產(chǎn)物得到簡(jiǎn)化，產(chǎn)物易于細(xì)胞分離。細(xì)胞生長(zhǎng)和有效產(chǎn)物形成不偶聯(lián)，優(yōu)化產(chǎn)物形成而不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。使培養(yǎng)液的粘度極大降低，避免了懸浮培養(yǎng)中出現(xiàn)的細(xì)胞結(jié)團(tuán)和透氣差的問題。當(dāng)前76頁(yè)，總共155頁(yè)。3.單細(xì)胞分離技術(shù)

機(jī)械法酶解法當(dāng)前77頁(yè)，總共155頁(yè)。機(jī)械法葉片消毒－撕取也表皮暴露葉肉細(xì)胞－刮取細(xì)胞－培養(yǎng)葉片消毒－過濾、離心凈化細(xì)胞－培養(yǎng)當(dāng)前78頁(yè)，總共155頁(yè)。酶解法果膠酶處理細(xì)胞，使細(xì)胞游離出來酶解液的滲透壓偏低，會(huì)造成原生質(zhì)體在細(xì)胞內(nèi)崩解當(dāng)前79頁(yè)，總共155頁(yè)。當(dāng)前80頁(yè)，總共155頁(yè)。4.植物體細(xì)胞雜交

用兩個(gè)來自不同植物的體細(xì)胞融合成一個(gè)雜種細(xì)胞，且把雜種細(xì)胞培育成新的植物體的方法稱為植物體細(xì)胞雜交當(dāng)前81頁(yè)，總共155頁(yè)。植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合正在融合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞愈傷組織雜種植株去細(xì)胞壁纖維素酶果膠酶物理方法化學(xué)方法：離心振動(dòng)電刺激聚乙二醇細(xì)胞分裂植物組織培養(yǎng)植物細(xì)胞融合酶解法人工誘導(dǎo)方法過程當(dāng)前82頁(yè)，總共155頁(yè)。5.植物細(xì)胞原生質(zhì)體制備與融合原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的融合雜合體的鑒別與篩選當(dāng)前83頁(yè)，總共155頁(yè)。原生質(zhì)體的制備取材與除菌材料來源植物的各組織和器官主要來源：葉片、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、莖尖、根尖、子葉、胚性組織細(xì)胞(花粉)除菌肥皂水－清水（3）－酒精（70％）－次氯酸鈉（3％）當(dāng)前84頁(yè)，總共155頁(yè)。原生質(zhì)體的制備酶解常用的酶：纖維素酶、果膠酶、崩潰酶、半纖維素酶、蝸牛酶需要在酶液中加入適量的滲透穩(wěn)定劑，常用的滲透穩(wěn)定劑是甘露醇和山梨醇等糖醇。

分離過濾、低速離心、比重漂浮當(dāng)前85頁(yè)，總共155頁(yè)。原生質(zhì)體的制備洗滌鑒定形態(tài)觀察臺(tái)盼藍(lán)、熒光素雙醋酸酯當(dāng)前86頁(yè)，總共155頁(yè)。分離原生質(zhì)體步驟當(dāng)前87頁(yè)，總共155頁(yè)。當(dāng)前88頁(yè)，總共155頁(yè)。熒光顯微鏡下的原生質(zhì)體煙草當(dāng)前89頁(yè)，總共155頁(yè)。原生質(zhì)體的融合原生質(zhì)體融合也稱體細(xì)胞雜交，就是使分離下來的不同親本的原生質(zhì)體之間在人工控制的條件下，像性細(xì)胞受精作用那樣互相融合成一體。

常用的融合方法化學(xué)法誘導(dǎo)融合物理誘導(dǎo)融合當(dāng)前90頁(yè)，總共155頁(yè)?；瘜W(xué)法誘導(dǎo)融合聚乙二醇(PEG)結(jié)合高鈣高pH誘導(dǎo)融合法雙親原生質(zhì)體滴加PEG滴加高鈣高pH溶液洗滌離心篩選，再生當(dāng)前91頁(yè)，總共155頁(yè)。PEG介導(dǎo)當(dāng)前92頁(yè)，總共155頁(yè)。物理誘導(dǎo)融合電融合電融合處理一般可分兩步進(jìn)行，先給兩極交變電流，產(chǎn)生電泳效應(yīng)，使原生質(zhì)體沿著電場(chǎng)的方向排列成串珠狀，這時(shí)再給予瞬間的高強(qiáng)度電脈沖，使原生質(zhì)體膜局部破損而導(dǎo)致融合。

當(dāng)前93頁(yè)，總共155頁(yè)。電融合當(dāng)前94頁(yè)，總共155頁(yè)。上圖：電流作用下原生質(zhì)體排成列右上：兩個(gè)原生質(zhì)體融合右下：三個(gè)原生質(zhì)體融合當(dāng)前95頁(yè)，總共155頁(yè)。雜合體的鑒別與篩選雜合細(xì)胞的顯微鑒別利用親本原生質(zhì)體大小、顏色的差異互補(bǔ)篩選雜合細(xì)胞遺傳互補(bǔ)法：利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，使雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常功能如白化互補(bǔ)(aaBB×AAbb)當(dāng)前96頁(yè)，總共155頁(yè)。雜合體的鑒別與篩選互補(bǔ)篩選雜合細(xì)胞生長(zhǎng)互補(bǔ)法：利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異性來選擇雜種細(xì)胞的方法抗性互補(bǔ)篩選法：利用親本原生質(zhì)體對(duì)抗生素、除草劑及其他有毒物質(zhì)的抗性差異來選擇雜種細(xì)胞代謝互補(bǔ)法當(dāng)前97頁(yè)，總共155頁(yè)。親本細(xì)胞1親本細(xì)胞2同型融合細(xì)胞異核融合細(xì)胞未融合細(xì)胞含藥物A和B的培養(yǎng)基存活死亡死亡對(duì)藥物B敏感對(duì)藥物A敏感當(dāng)前98頁(yè)，總共155頁(yè)。雜合體的鑒別與篩選利用細(xì)胞與分子生物學(xué)的方法鑒別雜合體根據(jù)融合處理后再生長(zhǎng)出的植株的形態(tài)特征進(jìn)行鑒別當(dāng)前99頁(yè)，總共155頁(yè)。6.

單倍體植物的誘發(fā)與利用單倍體生物是指細(xì)胞中僅含一組染色體的個(gè)體。單倍體植物種質(zhì)純，不受顯性等位基因的掩蓋與遮蔽效應(yīng)影響，人們易于從中挑選出具有可用性狀的隱性突變體，其經(jīng)濟(jì)意義十分顯著。自然發(fā)生途徑？當(dāng)前100頁(yè)，總共155頁(yè)。6.

單倍體植物的誘發(fā)與利用實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)單倍體植株的途徑花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)未授粉子房或胚珠的培養(yǎng)雜交法獲單倍體植株當(dāng)前101頁(yè)，總共155頁(yè)?；ㄋ幣囵B(yǎng)

選取成熟度適中的花蕾或幼穗?；ㄋ庮A(yù)處理：高滲，高溫或低溫。選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件。當(dāng)前102頁(yè)，總共155頁(yè)?；ǚ叟囵B(yǎng)由于花藥培養(yǎng)時(shí)一些二倍體的花藥壁細(xì)胞也形成愈傷組織，從而增加了培育單倍體植株的難度。1974年Nitsch等首創(chuàng)用擠壓法分離花粉進(jìn)行培養(yǎng)的方法，只得到約5%的花粉植株。1977年，Sunderland等提出了自然散開法收集花粉的方法，使花粉成株率有所提高，但與花藥培養(yǎng)相比仍低得多。當(dāng)前103頁(yè)，總共155頁(yè)。未授粉子房或胚珠的培養(yǎng)

子房、胚珠中的成熟胚囊由6個(gè)單倍體細(xì)胞（包括一個(gè)卵細(xì)胞）和一個(gè)具兩個(gè)極核的中央細(xì)胞構(gòu)成。1976年，SanNoeum首先從大麥未授粉子房培養(yǎng)獲單倍體植株。由于誘導(dǎo)出的植株大多是單倍體綠苗，因此這可能是一個(gè)發(fā)展方向。當(dāng)前104頁(yè)，總共155頁(yè)。雜交法獲單倍體植株

雜交，特別是遠(yuǎn)源雜交，雜種胚在胚胎發(fā)育過程中往往會(huì)將一方親本的染色體逐步排出，最終將得到僅含一方染色體的單倍體植物。1970年Kasha利用該原理將球莖大麥與普通大麥雜交，培育出了普通大麥的單倍體胚和植株。由本方法得出的單倍體胚長(zhǎng)成的植株都是綠苗，這是本法的突出優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前105頁(yè)，總共155頁(yè)。單倍體培養(yǎng)物的加倍在誘發(fā)單倍體植株的各階段（愈傷組織、幼胚及小苗），都可用0.2%—0.4%秋水仙素處理24-48小時(shí)，然后按常規(guī)途徑培養(yǎng)，即可獲得染色體加倍的能正常開花、結(jié)果的二倍體植株。當(dāng)前106頁(yè)，總共155頁(yè)。7.

人工種子的研制人工種子即人為制造的種子，它是一種含有植物胚狀體或芽、營(yíng)養(yǎng)成分、激素以及其他成分的人工膠囊。當(dāng)前107頁(yè)，總共155頁(yè)。人工種子的構(gòu)成及特點(diǎn)人工胚乳胚狀體人工種皮當(dāng)前108頁(yè)，總共155頁(yè)。人工種子的構(gòu)成及特點(diǎn)人工種子具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：不受環(huán)境因素制約，可以進(jìn)行工廠化生產(chǎn)；經(jīng)無性繁育產(chǎn)生，有利于保存優(yōu)良性狀；與試管苗相比，成本更低，適合機(jī)械化耕種；可根據(jù)需要在人工胚乳中添加營(yíng)養(yǎng)物、農(nóng)藥等。當(dāng)前109頁(yè)，總共155頁(yè)。人工種子的制備胚狀體的制備及其同步生長(zhǎng)人工胚乳的制備配制包埋劑及包埋當(dāng)前110頁(yè)，總共155頁(yè)。胚狀體的制備及其同步生長(zhǎng)誘導(dǎo)胚狀體同步化生長(zhǎng)的措施：低溫法抑制劑法：DNA合成抑制劑分離法通氣法：氮?dú)?、乙烯滲透壓法自然干燥4-7天當(dāng)前111頁(yè)，總共155頁(yè)。人工胚乳的制備常用的人工胚乳：MS(SH、White)培養(yǎng)基+馬鈴薯淀粉水解物0.5×SH培養(yǎng)基+麥芽糖當(dāng)前112頁(yè)，總共155頁(yè)。配制包埋劑及包埋海藻酸鈉中添加營(yíng)養(yǎng)成分CaCl2溶液中形成人工種皮約10分鐘，使之固化無菌水沖洗后即可播種當(dāng)前113頁(yè)，總共155頁(yè)。人工種子的貯存與萌發(fā)人工種子的貯存與萌發(fā)使迄今尚未攻克的難關(guān)。一般要將人工種子保存在低溫（4-7℃）、干燥（<67%相對(duì)濕度）條件下。費(fèi)用昂貴。當(dāng)前114頁(yè)，總共155頁(yè)。挪威云杉的人工種子當(dāng)前115頁(yè)，總共155頁(yè)。桉樹的人工種子（發(fā)芽中）當(dāng)前116頁(yè)，總共155頁(yè)。第三節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程1.

細(xì)胞組織培養(yǎng)2.

動(dòng)物細(xì)胞融合3.

單克隆抗體技術(shù)4.

細(xì)胞拆合5.干細(xì)胞工程當(dāng)前117頁(yè)，總共155頁(yè)。動(dòng)物細(xì)胞工程理論基礎(chǔ)胚胎干細(xì)胞與全息胚學(xué)說-細(xì)胞全能性動(dòng)物細(xì)胞工程與植物細(xì)胞工程的比較目的，技術(shù)手段，理論基礎(chǔ)，誘導(dǎo)手段等當(dāng)前118頁(yè)，總共155頁(yè)。當(dāng)前119頁(yè)，總共155頁(yè)。動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)手段一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)1、培養(yǎng)條件：35-37度2、培養(yǎng)方式：貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)3、抗凋亡技術(shù)當(dāng)前120頁(yè)，總共155頁(yè)。細(xì)胞培養(yǎng)法組織培養(yǎng)法培養(yǎng)物的傳代培養(yǎng)物的長(zhǎng)期保存1.細(xì)胞組織培養(yǎng)當(dāng)前121頁(yè)，總共155頁(yè)。大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞具有貼壁生長(zhǎng)的特性，其大規(guī)模培養(yǎng)方法有：微導(dǎo)管培養(yǎng)法微載體培養(yǎng)法葡聚糖聚合物微膠囊培養(yǎng)法褐藻酸鈉細(xì)胞培養(yǎng)法當(dāng)前122頁(yè)，總共155頁(yè)。組織培養(yǎng)法將小白鼠斷頸處死，然后用75%酒精或1‰新潔爾滅浸泡消毒，迅速進(jìn)入無菌室。

當(dāng)前123頁(yè)，總共155頁(yè)。將小白鼠置超凈工作臺(tái)上，打開腹腔

當(dāng)前124頁(yè)，總共155頁(yè)。用眼科剪和鑷，將腎外膜剪破，并將其剝向腎門，去腎外膜及脂肪，當(dāng)前125頁(yè)，總共155頁(yè)。剪碎組織當(dāng)前126頁(yè)，總共155頁(yè)。接種組織塊當(dāng)前127頁(yè)，總共155頁(yè)。移入培養(yǎng)箱中（注意貼有組織塊的一面朝上），靜止2～3小時(shí)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。當(dāng)前128頁(yè)，總共155頁(yè)。24～48小時(shí)后若培養(yǎng)液變成黃色且混濁，表示已被污染；若培養(yǎng)液變成紫色，一般細(xì)胞生長(zhǎng)不好，則培養(yǎng)液pH過高；若培養(yǎng)液顯為橙黃、橘紅且清澈，一般顯示細(xì)胞生長(zhǎng)良好。在相差顯微鏡下觀察，若此時(shí)見細(xì)胞自組織邊緣長(zhǎng)出。繼續(xù)培養(yǎng)3～5日，再換部分或全部培養(yǎng)液，待多數(shù)組織塊的生長(zhǎng)暈相接，小心挑掉組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)3～4天，細(xì)胞貼滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁時(shí)便可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。觀察當(dāng)前129頁(yè)，總共155頁(yè)。培養(yǎng)物的傳代懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞：定期將其轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中組織培養(yǎng)物：需剝離組織當(dāng)前130頁(yè)，總共155頁(yè)。經(jīng)典傳代法冷凍保存(液氮)5%-10%的二甲亞砜(DMSO)10%玻璃化保護(hù)劑(PVS2)培養(yǎng)物的長(zhǎng)期保存當(dāng)前131頁(yè)，總共155頁(yè)。2、動(dòng)物細(xì)胞融合用自然或人工的方法使兩個(gè)或幾個(gè)不同細(xì)胞融合為一個(gè)細(xì)胞（含有原來2個(gè)細(xì)胞的染色體）的過程。親緣較遠(yuǎn)的生物體之間是無法正常雜交的，但他們之間的體細(xì)胞卻往往能彼此融合，產(chǎn)生出雜種細(xì)胞當(dāng)前132頁(yè)，總共155頁(yè)。細(xì)胞融合的意義1、克服植物遠(yuǎn)緣雜交不親和性、2、擴(kuò)大遺傳重組范圍、增加變異、創(chuàng)造新品種3、單克隆抗體的生產(chǎn)當(dāng)前133頁(yè)，總共155頁(yè)。動(dòng)物細(xì)胞融合有以下三條途徑：

病毒誘導(dǎo)融合化學(xué)誘導(dǎo)融合電激誘導(dǎo)融合當(dāng)前134頁(yè)，總共155頁(yè)。常用的病毒：

副粘液病毒(副流感病毒如仙苔病毒)、天花病毒、皰疹病毒等促融機(jī)制：靠病毒表面含有神經(jīng)氨酸酶一些突起的作用病毒誘導(dǎo)融合當(dāng)前135頁(yè)，總共155頁(yè)。化學(xué)誘導(dǎo)融合常用的促融劑：

聚乙二醇(PEG)促融機(jī)制：PEG降低細(xì)胞表面的極性，導(dǎo)致脂雙層不穩(wěn)定，引起細(xì)胞融合當(dāng)前136頁(yè)，總共155頁(yè)。3.單克隆抗體技術(shù)基本原理單抗制備流程當(dāng)前137頁(yè)，總共155頁(yè)。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)：是將可以分泌單一抗體的淋巴細(xì)胞與可以無限增殖的骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得兼具兩種細(xì)胞特性的雜交細(xì)胞。這種細(xì)胞可以大量增殖并產(chǎn)生純一的抗體，即單克隆抗體。這一技術(shù)被譽(yù)為免疫學(xué)上的一次重大革命。單克隆抗體：由單一克隆的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗單一抗原的高度特異性抗體，具有專一性強(qiáng)、質(zhì)地均一、反應(yīng)靈敏、可大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)基本原理當(dāng)前138頁(yè)，總共155頁(yè)?；驹硗ㄟ^融合兩種細(xì)胞而同時(shí)保持兩者的主要特征。兩種細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞特征：再培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖；次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺失脾淋巴細(xì)胞(經(jīng)抗原免疫)特征：分泌抗體功能和能夠在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)融合后，形成同時(shí)具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞克隆當(dāng)前139頁(yè)，總共155頁(yè)。單抗制備流程當(dāng)前140頁(yè)，總共155頁(yè)。當(dāng)前141頁(yè)，總共155頁(yè)。4.細(xì)胞拆合從不同的細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其成分，在體外將它們重新組裝成具有生物活性的細(xì)胞或細(xì)胞其的過程稱為細(xì)胞拆合。包括核移植和染色體轉(zhuǎn)移等。當(dāng)前142頁(yè)，總共155頁(yè)。

核移植進(jìn)行核移植研究的目的：異種核質(zhì)關(guān)系研究；中間性狀魚細(xì)胞核遺傳全能性的研究。胚胎早期細(xì)胞、體細(xì)胞當(dāng)前143頁(yè)，總共155頁(yè)。爪蟾的細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)，證明細(xì)胞核的全能性當(dāng)前144頁(yè)，總共155頁(yè)。動(dòng)物克隆可以分為三個(gè)階段：同種胚胎細(xì)胞克隆動(dòng)物同種體細(xì)胞克隆動(dòng)物異種體細(xì)胞克隆動(dòng)物當(dāng)前145頁(yè)，總共155頁(yè)。同種胚胎細(xì)胞克隆動(dòng)物1981年Illmenses率先報(bào)告用小鼠幼胚細(xì)胞核克隆出正常小鼠。隨后，1984年Willadsen用未成熟羊胚細(xì)胞核克隆出一頭羊。當(dāng)前146頁(yè)，總共155頁(yè)。同種體細(xì)胞克隆動(dòng)物

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