基因工程與體外表達(dá)課件

第八章基因工程與體外表達(dá)

GeneEngineeringandGeneExpression

分子生物學(xué)研究中心

1目的要求掌握：限制性核酸內(nèi)切酶的概念與特點(diǎn)；質(zhì)粒載體的特點(diǎn)；基因克隆的基本過(guò)程。了解：其他常用工具酶的特點(diǎn)?！局攸c(diǎn)】基因克隆的基本過(guò)程。2

基因工程是指在體外對(duì)DNA分子按照既定的目的和方案，對(duì)DNA進(jìn)行剪切和重新連接，然后把它導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而能夠擴(kuò)增有關(guān)DNA片段，表達(dá)有關(guān)基因產(chǎn)物，進(jìn)行DNA序列分析，基因治療，研究基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等），以及研究基因的功能等。3限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)類型限制性修飾作用識(shí)別位點(diǎn)切割位點(diǎn)Ⅰ型有有特異識(shí)別位點(diǎn)下游100到1000bpⅡ型有無(wú)特異可知、固定Ⅲ型有有特異識(shí)別位點(diǎn)附近切割DNA，切割位點(diǎn)很難預(yù)測(cè)。52．限制性內(nèi)切酶的命名

EcoRⅠE代表Escherichia屬

co代表coli種

R代表RY13株65’GAATTC3’3’CTTAAG5’

5’

G3’CTTAAAATTC3’G5’5’5’3．限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)

通常是4～6個(gè)堿基對(duì)、具有回文序列（palindrome）的DNA片段，大多數(shù)酶是錯(cuò)位切割雙鏈DNA，產(chǎn)生5ˊ或3ˊ黏性末端（stickyend）。如EcoRⅠ切割后產(chǎn)生5ˊ黏性末端：7二、T4DNA連接酶（T4DNAligase）

催化雙鏈DNA一端3ˊ-OH與另一雙鏈DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯鍵，使具有相同黏性末端或平端的DNA兩端連接起來(lái)。

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第二節(jié)基因克隆的載體

載體是攜帶目的基因，使其在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或表達(dá)的DNA分子。10一、常用的克隆載體

(一)質(zhì)粒（plasmid）是存在于多數(shù)細(xì)菌和某些真核生物染色體外的雙鏈環(huán)狀的DNA分子。1113(二)λ噬菌體

野生型λ噬菌體經(jīng)過(guò)改造，已衍生出100多種克隆載體。λ噬菌體載體分為插入型和替換型(置換型)兩類。目前應(yīng)用較廣的是EMBL系列、λgt系列和Charon系列等。

14λgt10和λgt11載體適用于建立cDNA文庫(kù)。這兩個(gè)載體都屬插入型載體，能克隆7kb以下的外源DNA。λ

gt11為表達(dá)型載體。1517(四)黏性質(zhì)粒（cosmid）

是由λ噬菌體的黏性末端（cos區(qū)）與質(zhì)粒重新構(gòu)建的載體，為雙鏈、環(huán)狀DNA。其克隆容量可達(dá)40～50kb。18(五)病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、EB病毒等作為基因轉(zhuǎn)移的載體。多數(shù)病毒載體均已質(zhì)粒化，病毒載體質(zhì)粒主要由病毒啟動(dòng)子、包裝元件、選擇性遺傳標(biāo)記，以及pBR322的復(fù)制子組成。19

multiplecloningsite21(二)真核表達(dá)載體

含有原核復(fù)制起始位點(diǎn)、抗生素抗性基因.還含有真核表達(dá)元件,包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和poly(A)加尾信號(hào).22

第三節(jié)基因克隆的基本過(guò)程

基因克隆主要步驟：①制備目的基因和選擇相關(guān)載體②目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接③重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞④DNA重組體的篩選和鑒定⑤DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究23幾種常用克隆載體的比較注：+表示可用；-表示不可用比較內(nèi)容質(zhì)粒λ噬菌體黏性質(zhì)粒M13噬菌體克隆容量<10kb<22kb40～50kb<1kb基因組DNA文庫(kù)-++-cDNA文庫(kù)++--亞克隆+--+序列分析++-+E.coli表達(dá)++--二、載體的選擇與準(zhǔn)備25三、DNA分子的體外連接（一）黏性末端（二）人工接頭的使用（三）加入同聚體尾（四）平端連接26（三）加入同聚體尾待克隆DNA片段重組質(zhì)?；旌?、退火空白質(zhì)粒29（四）平端連接30四、外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞

（一）轉(zhuǎn)化（transformation）（二）感染（infection）（三）轉(zhuǎn)染（transfection）

31五、目的基因的篩選和鑒定

外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后，篩選含有目的基因的陽(yáng)性克隆并加以擴(kuò)增。所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR等。32（一）

遺傳學(xué)方法

插入滅活法1.332.藍(lán)-白篩選（α互補(bǔ)）

許多載體（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和氨基端145個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)。這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。宿主和載體編碼的片段各自均無(wú)酶活性，但它們可以互補(bǔ)形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源DNA片段，將使lacZ基因滅活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，結(jié)果菌落呈現(xiàn)白色。343536（二）免疫學(xué)方法

如果克隆基因的產(chǎn)物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表達(dá)，因而可用相應(yīng)的抗血清或單克隆抗體，通過(guò)放射免疫、化學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)進(jìn)行篩選。

37（三）核酸雜交法

對(duì)菌斑或菌落進(jìn)行原位分子雜交是從基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)或重組質(zhì)粒中篩選目的基因的最有效的方法之一，而且這種篩選不取決于目的基因是否表達(dá)。38菌落原位雜交的原理

轉(zhuǎn)化E.coli并鋪于瓊脂平板上將膜放置平板表面