臨床常見標本細菌學檢驗

臨床常見標本細菌學檢驗第1頁/共84頁第2頁/共84頁第十九章

臨床常見標本的細菌學檢驗

返回總目錄第3頁/共84頁本章內容第一節(jié)概述1第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗2第4頁/共84頁學習目標：掌握臨床常見標本的采集、送檢和處理的原則臨床常見標本細菌學檢驗程序、檢驗方法及結果報告熟悉TAT、危急值在臨床實際工作中的應用臨床標本常見病原菌的檢驗方法及鑒定要點了解臨床標本細菌學檢驗的臨床意義臨床標本中正常菌群的分布及常見致病菌本章重點：★病毒標本采集和運送原則★病毒學診斷及鑒定常用方法★病毒培養(yǎng)的基本操作學習目標及重點

第5頁/共84頁第一節(jié)概述一、臨床標本的采集、送檢與處理原則（一）臨床標本的采集1.核對檢驗單信息

?信息完整、無誤2.選擇適當?shù)娜萜鞯?頁/共84頁3.早期采集

?使用抗菌藥物前

4.無菌采集

?嚴格無菌操作技術第一節(jié)概述第7頁/共84頁

5.選擇采集部位和方法第一節(jié)概述第8頁/共84頁

6.充足的標本量

?足量、適量

7.標記標本

8.歸放標本

?符合生物安全防護要求第一節(jié)概述第9頁/共84頁（二）臨床標本的保存和送檢

?立即送檢，否則應放入運送培養(yǎng)基或保存液中運送

1.普通細菌培養(yǎng)標本

?室溫：1小時，4℃：24小時，運送培養(yǎng)基：48小時

2.苛養(yǎng)菌培養(yǎng)標本

?保溫、保濕送檢，“床頭接種”第一節(jié)概述第10頁/共84頁3.厭氧菌培養(yǎng)標本?防干燥，避免接觸空氣。4.安全運送?注意安全防護

?高致病性傳染病標本，按生物安全有關規(guī)定包裝，由專人運送第一節(jié)概述第11頁/共84頁（三）臨床標本的處理

?核對標本與申請單信息常見標本處理方式

組織：無菌粉碎研磨后，加生理鹽水制成懸液，接種體液：3000r/mim離心10分鐘后，接種。棉拭子：置運送培養(yǎng)基送檢，避免污染。糞便：挑取帶膿、血及黏液部分接種。痰液：檢查標本是否有血液、膿液、顆粒、干酪樣物等血液：采集后立即增菌培養(yǎng)厭氧菌培養(yǎng)：檢查標本、運送方式是否適合厭氧培養(yǎng)，立即接種第一節(jié)概述第12頁/共84頁二、培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法的選擇

1.培養(yǎng)基選擇恰當?shù)呐囵B(yǎng)基或組合第一節(jié)概述第13頁/共84頁電熱恒溫培養(yǎng)箱二氧化碳培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)箱2.常用培養(yǎng)方法

?需氧培養(yǎng)、二氧化碳培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)第一節(jié)概述第14頁/共84頁三、細菌學檢驗的基本流程（一）細菌學檢驗的基本程序

第一節(jié)概述第15頁/共84頁（二）細菌學檢驗鑒定步驟1.標本性狀觀察

?顏色、是否粘稠、是否渾濁、是否膿性、是否帶血等性狀第一節(jié)概述第16頁/共84頁革蘭染色抗酸染色墨汁染色2.涂片檢查

?不染色標本檢查：檢查細菌的動力

?染色標本檢查第一節(jié)概述第17頁/共84頁

3.細菌的分離培養(yǎng)

?目的：得到單個純菌落

?甄別污染菌方法①觀察菌落是否在劃線上②觀察菌落是否與直接涂片染色結果相符③觀察菌落是否符合擬培養(yǎng)細菌的生長特點④注意培養(yǎng)時間第一節(jié)概述第18頁/共84頁4.細菌的鑒定?選擇細菌檢驗鑒定方法的原則★選擇有鑒定價值的試驗：兩種細菌出現(xiàn)不同的結果★選擇快速、簡易的試驗：如觸酶、氧化酶★綜合考慮試驗的敏感性和特異性

第一節(jié)概述第19頁/共84頁5.細菌對抗菌藥物敏感性試驗

?紙片擴散法

?肉湯稀釋法

?自動化儀器法

?E-test法等。第一節(jié)概述第20頁/共84頁返回本章內容四、細菌學檢驗報告原則?標本周轉時間（TAT）：從標本采集起到臨床醫(yī)生收到檢驗結果的時間?危急值：指危及到患者生命健康安全的檢驗結果檢驗報告原則?初報告?預報告?最終報告?報告抗菌藥物敏感性試驗結果第一節(jié)概述第21頁/共84頁一、血液及骨髓標本的細菌學檢驗（一）標本的采集1.皮膚消毒

?嚴格執(zhí)行三步法2.采血部位：

?肘靜脈

?肘動脈或股動脈采血

?嬰幼兒采頸靜脈血

第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第22頁/共84頁3.采集方法

?嚴格無菌操作4.采血量

?比例：1:10

?成人8～10ml/瓶

?兒童1～5ml/瓶

?嬰兒1～2ml/瓶

?骨髓1～2ml/瓶

第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第23頁/共84頁疾病24小時內24小時后菌血癥、敗血癥2～3份細菌性心內膜炎3份（1～2小時）2份不明原因發(fā)熱2～3份2份5.采血時間和頻度6.標本的運送和保存立即送檢，室溫保存，切勿冷藏第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第24頁/共84頁（二）微生物學檢驗

1.常見病原菌第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第25頁/共84頁2.

檢驗程序第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第26頁/共84頁培養(yǎng)基性狀改變疑似病原菌均勻混濁，指示劑變色革蘭陰性桿菌微混濁，有綠色變化肺炎鏈球菌有菌膜，均勻混濁有綠色熒光銅綠假單胞菌上層澄清，下層有沉淀鏈球菌細胞層自上而下的溶血溶血性鏈球菌混濁、有膠凍狀凝固現(xiàn)象葡萄球菌灰白色菌膜、培養(yǎng)基清晰枯草芽孢桿菌或類白喉棒狀桿菌3.檢驗方法（1）普通細菌的培養(yǎng)與鑒定

?增菌培養(yǎng)：培養(yǎng)陽性指證及疑似菌列表第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第27頁/共84頁陽性培養(yǎng)瓶直接藥敏試驗分離培養(yǎng)涂片染色鏡檢細菌鑒定藥敏試驗報告報告報告?陽性培養(yǎng)瓶處理?陰性培養(yǎng)瓶處理于12～18小時、第3天和第7天至少做3次盲傳，7天無細菌生長報告陰性第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第28頁/共84頁（2）特殊細菌培養(yǎng)與鑒定?腦膜炎奈瑟菌血液骨髓胰胨肉湯或專業(yè)培養(yǎng)瓶巧克力培養(yǎng)基（35℃,

5％～10％C02）鑒定：葡萄糖、麥芽糖發(fā)酵陽性藥敏：CLSI標準腦膜炎奈瑟菌菌落第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第29頁/共84頁（2）特殊細菌培養(yǎng)與鑒定?草綠色鏈球菌血液骨髓血瓊脂平板（35℃,

5％～10％C02、需氧和厭氧環(huán)境）胰酶解酪蛋白大豆肉湯培養(yǎng)瓶鑒定藥敏試驗草綠色鏈球菌草綠色鏈球菌菌落7天培養(yǎng)無細菌生長，培養(yǎng)至第4周，仍無細菌生長則報告“經4周培養(yǎng)無草綠色鏈球菌生長”第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第30頁/共84頁血液骨髓葡萄糖膽汁或膽鹽肉湯MAC、SS35℃培養(yǎng)鑒定;KIA、生化反應、血清學試驗等藥敏試驗血液骨髓肝浸液肉湯肝浸液平板或血平板（35℃,

5％～10％C02）涂片、生化鑒定血清學試驗?傷寒沙門菌及其他沙門菌?布魯菌培養(yǎng)4周無細菌生長，報告“經4周培養(yǎng)無細菌生長”第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第31頁/共84頁標本牛心腦浸液或肝浸液血平板或巧克力平板35℃、厭氧培養(yǎng)生化鑒定?厭氧菌?真菌：真菌增菌肉湯增菌→沙保弱培養(yǎng)基（25℃或37℃）→菌落特征→生化鑒定、報告?L型細菌高滲液體培養(yǎng)基→血瓊脂平板和L型細菌培養(yǎng)基→典型“油煎蛋”菌落→返祖、鑒定第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第32頁/共84頁4.結果報告采取分級和限時報告制度?初報告：將鏡檢結果電話通知主管醫(yī)生?預報告：6～8小時內報告直接藥物敏感結果?最終報告：報告細菌種屬、藥敏試驗、結果評價及建議?陰性報告第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第33頁/共84頁（三）臨床意義?排除雜菌污染，從血液和骨髓標本中檢出任何細菌都具有臨床意義?葡萄球菌是血液感染最常見的細菌?草綠色鏈球菌是亞急性心內膜炎的主要致病菌?尿路、膽道、胃腸道炎癥粘膜損傷引起的敗血癥以大腸埃希菌多見?產單核李斯特菌主要引起新生兒敗血癥第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第34頁/共84頁互動討論草綠色鏈球菌屬人體正常菌群，試分析從血液和痰液標本中分離出草綠色鏈球菌各有何臨床意義？第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第35頁/共84頁二、腦脊液標本的細菌學檢驗（一）標本的采集1.采集部位?腰椎穿刺法2.采集量?3～5ml3.標本的運送和保存?15分鐘內送檢，最遲不能超過1小時。疑似苛養(yǎng)菌感染時，應保溫送檢第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第36頁/共84頁（二）微生物學檢驗1.常見病原菌第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第37頁/共84頁2.檢驗程序第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第38頁/共84頁肺炎鏈球菌腦膜炎奈瑟菌流感嗜血桿菌3.檢驗方法（1）涂片檢查

?革蘭染色第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第39頁/共84頁

?抗酸染色?墨汁負染色

新型隱球菌結核桿菌第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第40頁/共84頁（2）分離培養(yǎng)與鑒定?普通細菌標本→血瓊脂平板和巧克力平板（35℃，CO2環(huán)境）→可疑菌落→形態(tài)、生化試驗及血清學試驗、藥敏試驗?結核分枝桿菌標本→羅-琴培養(yǎng)基或米氏7H-10培養(yǎng)基→35℃溫箱孵育→可疑菌落→鑒定第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第41頁/共84頁?真菌標本→血平板或沙保弱培養(yǎng)基→25℃及37℃孵育→可疑菌落→形態(tài)、鏡檢及生化反應等鑒定。?厭氧菌標本→血平板、厭氧血瓊脂平板和硫乙醇酸鈉肉湯→35℃需氧、厭氧培養(yǎng)→可疑菌落→染色鏡檢及生化鑒定、藥敏試驗第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第42頁/共84頁4.結果報告

?初報告：報告標本直接涂片結果?預報告：報告標本直接藥敏試驗結果?最終報告：報告細菌種屬、藥敏試驗、結果評價及建議?陰性報告第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第43頁/共84頁（三）臨床意義?腦膜炎奈瑟菌引起細菌性腦膜炎?結核分枝桿菌引起的結核性腦膜炎?真菌性腦膜炎最常見的病原體是新型隱球菌，白假絲酵母菌、球孢子菌好發(fā)于免疫功能低下和惡性疾病患者第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第44頁/共84頁三、尿液（泌尿生殖道）標本的細菌學檢驗（一）標本的采集1.中段尿采集法2.導尿法3.膀胱穿刺采集法4.集尿法

5.標本的運送和保存

?立即送檢、及時接種

?室溫不超過2小時，4℃不超過8小時

?淋病奈瑟菌感染尿液標本不能冷藏第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第45頁/共84頁（二）微生物學檢驗1.常見病原菌第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第46頁/共84頁2.檢驗程序第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第47頁/共84頁3.檢驗方法（1）涂片檢查?普通細菌檢查：取沉淀涂片、染色、鏡檢?淋病奈瑟菌檢查第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第48頁/共84頁?念珠菌檢查?結核分枝桿菌檢查：應與恥垢分枝桿菌相鑒別?鉤端螺旋體檢查：暗視野顯微鏡下，發(fā)現(xiàn)一串細密亮珠、兩端呈鉤狀且沿縱軸旋轉運動的螺旋體時，報告找到螺旋體第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第49頁/共84頁（2）尿液細菌計數(shù)?

計算：cfu/ml=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)

或cfu/ml=

?

意義革蘭陽性球菌大于104cfu/ml,革蘭陰性桿菌大于105cfu/ml，應考慮為泌尿系統(tǒng)感染第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第50頁/共84頁淋球菌菌落（3）分離培養(yǎng)與鑒定

?

普通細菌培養(yǎng)：沉淀物→血平板和麥康凱平板→35℃培養(yǎng)→菌落觀察→染色鏡檢、生化反應、抗菌藥物敏感試驗

?

淋病奈瑟菌培養(yǎng)：標本→TM或MTM平板→35℃、5％～10％CO2環(huán)境→疑似菌落→涂片鏡檢、生化反應鑒定第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第51頁/共84頁4.結果報告

?

初級報告：標本涂片染色鏡檢結果，如“找到革蘭陰性雙球菌，存在于細胞內（外），形似淋病奈瑟菌”

?

最終報告：報告細菌種屬、菌落計數(shù)、藥物敏感性試驗、結果評價及建議

?

陰性報告：48小時無細菌生長者，報告“48小時培養(yǎng)無細菌生長”第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第52頁/共84頁（三）臨床意義?

尿液中細菌數(shù)少于104cfu／ml或104～105cfu/ml之間，反復多次查出同一細菌時，一般也認為是病原菌。?

同份尿液中檢出三種或以上不同微生物，應認為標本采集或處理不當被污染。?

尿液細菌學檢查結果，應結合臨床考慮綜合第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第53頁/共84頁直腸肛拭子四、糞便標本的細菌學檢驗（一）標本的采集1.自然排便法?

膿血、黏液糞便2～3克2.直腸拭子法?

成人4～5厘米?

幼兒2～3厘米3.標本的運送和保存?

卡-布（Cary-Blair）運送培養(yǎng)基第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第54頁/共84頁（二）微生物學檢驗1.常見病原菌第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第55頁/共84頁2.檢驗程序第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第56頁/共84頁3.檢驗方法（1）涂片檢查?

霍亂弧菌檢查：①動力檢查：動力及制動試驗②染色鏡檢：革蘭染色，發(fā)現(xiàn)魚群狀排列的革蘭陰性弧菌，可做出初步報告?

酵母樣菌檢查第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第57頁/共84頁葡萄球菌艱難梭菌彎曲菌（1）涂片檢查?葡萄球菌、艱難梭菌、彎曲菌檢查

?糞便中優(yōu)勢菌檢查：推定主要優(yōu)勢菌并及時報告結果第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第58頁/共84頁沙門菌志賀菌（2）分離培養(yǎng)與鑒定

?

沙門菌及志賀菌培養(yǎng)糞便或直腸拭子→SS平板、麥康凱平板、GN增菌液→35℃、需氧培養(yǎng)→可疑菌落→生化試驗、血清學反應鑒定第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第59頁/共84頁五種致病性大腸埃希菌

ETEC----腸產毒大腸埃希菌EPEC----腸致病大腸埃希菌EIEC----腸侵襲大腸埃希菌EHEC----腸出血大腸埃希菌EaggEC—腸凝聚性大腸埃希菌（2）分離培養(yǎng)與鑒定

?致病性大腸埃希菌培養(yǎng)膿血或糊狀糞便→麥康凱/伊紅美藍/中國藍平板→35℃、需氧培養(yǎng)→可疑菌落→生化反應、多價血清凝集試驗鑒定第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第60頁/共84頁?

霍亂弧菌培養(yǎng)米泔水樣糞便→堿性蛋白胨水增菌→堿性瓊脂平板或TCBS平板→35℃需氧培養(yǎng)→可疑菌落→形態(tài)檢查、動力及制動試驗、血清學試驗鑒定?

副溶血性弧菌培養(yǎng)糞便、可疑食物、嘔吐物→3.5%NaCl蛋白胨水增菌→SS平板、TCBS平板→35℃需氧培養(yǎng)→可疑菌落→生化試驗及耐鹽試驗鑒定第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第61頁/共84頁?

金黃色葡萄球菌培養(yǎng)糞便、肛拭子、可疑食物→甘露醇高鹽瓊脂平板、血瓊脂平板→35℃需氧培養(yǎng)→可疑菌落→革蘭染色、凝固酶、DNA酶及甘露醇發(fā)酵鑒定?

小腸結腸耶爾森菌培養(yǎng)標本→NYE、1/15M磷酸鹽増菌液→4℃、25～30℃、35℃、需氧環(huán)境→可疑菌落→生化反應、血清學試驗鑒定第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗小腸結腸炎耶爾森菌第62頁/共84頁?

空腸彎曲菌培養(yǎng)標本→Camp-BAP、Skirrow或Butzler血瓊脂→43℃、微需氧環(huán)境→有色半透明菌落→動力、生化試驗鑒定。?

艱難梭菌培養(yǎng)標本→CCFA平板→35℃、厭氧環(huán)境→可疑菌落→生化鑒定、毒素試驗第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第63頁/共84頁?

真菌培養(yǎng)標本→沙保弱瓊脂平板、血瓊脂平板→25℃及37℃培養(yǎng)→可疑菌落→鏡檢、芽管及厚膜孢子試驗等鑒定4.結果報告?初級報告：鏡檢典型陽性結果，報告臨床。?

最終報告：報告細菌種屬、藥敏試驗、結果評價及建議；檢出霍亂弧菌應立即向當?shù)丶膊☆A防控制中心報告?

陰性報告：根據分離目的菌而定第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第64頁/共84頁（三）臨床意義?能引起腸道感染的常見致病菌有沙門菌、志賀菌、霍亂弧菌及致病性大腸埃希菌等。?能引起食物中毒的常見致病菌有沙門菌、副溶血弧菌、致病性大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽胞桿菌等?幽門螺桿菌是引起胃炎、消化性潰瘍主要致病菌，胃癌的危險因子第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第65頁/共84頁互動討論正常人糞便中含有大量細菌，而能引起腸道感染的細菌種類較多，致病菌和正常菌往往共存生長。試分析如何快速準確的檢出致病菌？第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第66頁/共84頁五、痰液（呼吸道）標本的細菌學檢驗（一）標本的采集1.自然咳痰法晨痰最佳，深部痰2.小兒取痰法3.特殊器械采集法4.標本的運送和保存立即送檢，室溫不超過2小時第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第67頁/共84頁（二）微生物學檢驗

1.常見病原菌第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第68頁/共84頁2.檢驗程序第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第69頁/共84頁白細胞數(shù)(LP)上皮細胞數(shù)(LP)細菌培養(yǎng)＞25個＜10個合格＜10個＞25個不合格3.檢驗方法

（1）涂片檢查目的:①確定標本是否適合做細菌培養(yǎng)②為選用培養(yǎng)基提供參考適合細菌培養(yǎng)的痰液鏡檢標準第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第70頁/共84頁（1）涂片檢查?普通細菌檢查：涂片行革蘭染色鏡檢，根據染色性、形態(tài)及排列初步報告?結核桿菌檢查：制成厚涂片，抗酸染色鏡檢?放線菌及諾卡菌檢查硫磺樣顆粒涂片衣氏放線菌第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第71頁/共84頁痰培養(yǎng)前的處理①痰液的洗凈②痰液的均質化?普通細菌培養(yǎng)?嗜肺軍團菌培養(yǎng)標本→血瓊脂、巧克力瓊脂和BCYE瓊脂平板→35℃，5％～10％CO2環(huán)境→根據培養(yǎng)時間、菌落特點等鑒定（2）細菌的培養(yǎng)與鑒定第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第72頁/共84頁異染顆粒?

白喉棒狀桿菌培養(yǎng)標本→呂氏血清斜面、血瓊脂平板和亞碲酸鉀瓊脂平板→35℃、需氧環(huán)境→典型菌落→形態(tài)、生化試驗、毒力試驗第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第73頁/共84頁百日咳鮑特菌在CCBA培養(yǎng)基菌落?鮑特菌培養(yǎng)

標本→鮑-金培養(yǎng)基→35℃、需氧環(huán)境→可疑菌落→涂片鏡檢、生化及血清學試驗等鑒定4.結果報告?初級報告：典型陽性結果，立即向臨床報告?最終報告：報告細菌種屬、藥敏試驗、各細菌所占比例、結果評價及建議?陰性報告：報告“正常菌群”或“生長細菌的種類、數(shù)量”第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第74頁/共84頁（三）臨床意義?上呼吸道感染是最常的呼吸道感染癥?下呼吸道感染最常見的疾病是細菌性肺炎，肺炎鏈球菌是主要病原菌?醫(yī)院獲得性肺炎的病原體50%以上是革蘭陰性桿菌?真菌性肺炎的常見菌以白假絲酵母菌為主，曲霉、毛霉和隱球菌也可見第二節(jié)臨床常見標本的細菌學檢驗第75頁/共84頁六、膿液（病灶分泌物）標本的細菌學檢驗（一）標本的采集開放性膿腫瘺管1.拭子采集法

?

開放性性膿腫2.沙布條采集法

?

瘺管的放線菌感染3.注射器抽吸法