基于納米材料構(gòu)建的新型電化學(xué)傳感器及其在生物大分子分析中的應(yīng)用研究報告

-.z基于納米材料構(gòu)建的新型電化學(xué)傳感器及其在生物大分子分析中的應(yīng)用研究【摘要】：生物傳感器是一種用來監(jiān)測生命體系或與之相關(guān)聯(lián)的生物基元的器件,其完整的概念是由作為識別元件的固定化的生物敏感材料(包括酶、抗體、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì)),以及作為理化換能器的適當(dāng)?shù)男盘栟D(zhuǎn)換器(如氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等)所組成的體系。因其具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、所需儀器簡便等優(yōu)點,是當(dāng)前科學(xué)研究中普遍使用的檢測技術(shù)之一,在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、藥物分析、食品和農(nóng)業(yè)檢測等方面得到了高度重視和廣泛應(yīng)用。納米技術(shù)逐步引入生物分析化學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域,并顯示了廣闊的前景。納米顆粒具有大比外表積,高活性、特異性等特點；作為傳感器材料,具有高選擇性、高靈敏度、快速方便檢測等特點,改造傳統(tǒng)的生物傳感器,可以增加生物分子的固定量,從而增強響應(yīng)信號,制得高選擇性、高靈敏度的生物傳感器能用于探測許多細胞化學(xué)物質(zhì),可以監(jiān)控活細胞的蛋白質(zhì)以及其他所感興趣的生物化學(xué)物質(zhì)。

本論文的工作主要集中在制備多種功能性的納米復(fù)合材料、聚合物材料及半導(dǎo)體復(fù)合材料,結(jié)合光電化學(xué)技術(shù)和電化學(xué)傳感技術(shù),開發(fā)新型的生物傳感器,用于α-突觸核蛋白和SirTl蛋白的檢測研究,以及酶活性的檢測及其抑制動力學(xué)的研究。本論文的具體工作包括以下幾個方面：

第一章緒論

本章系統(tǒng)介紹了生物傳感器的概念和工作原理,根據(jù)敏感元件的不同進展了分類比較,著重介紹了電化學(xué)酶傳感器和電化學(xué)免疫傳感器的特點。評述了納米技術(shù)的開展及其在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用,簡述了光電化學(xué)的概念、檢測原理,光電化學(xué)中的材料,及其在生物傳感器中的應(yīng)用研究,介紹了電化學(xué)生物傳感器在三種生物樣品檢測中的應(yīng)用。最后闡述本論文的工作及意義。

第二章：Au-TiO2光電化學(xué)免疫傳感器的制備及其對α-突觸核蛋白的檢測

α-突觸核蛋白(a-synuclein,a-SYN)是一種與帕金森病密切相關(guān)的神經(jīng)蛋白。本文制備了一種新型光電化學(xué)免疫傳感器用于α-突觸核蛋白的檢測。首先采用陽極氧化技術(shù),制備了高序排列的二氧化鈦納米管陣列(Ti02),并通過光電協(xié)同催化法將Au納米顆粒嵌入Ti02中。沉積的Au納米顆粒不僅能夠提高光電流響應(yīng),而且為單抗(Ab1)的固定提供了良好的基底,使抗體保持高度的穩(wěn)定性和生物活性。此外,將多抗(Ab2)和葡萄糖氧化酶(GO*)固定在Au納米顆粒外表制備成{Ab2-Au-GO*}生物復(fù)合物,同樣能夠顯著提高光電流響應(yīng)。當(dāng)測試體系中參加葡萄糖后,葡萄糖氧化酶能夠催化葡萄糖產(chǎn)生H202,當(dāng)光源照在Ti02未修飾蛋白的一側(cè)時,H202能夠捕獲Ti02納米管的光生空穴,表現(xiàn)為光電流強度升高。光電流響應(yīng)與α-SYN在50pg/mL至100ng/mL呈良好的線性關(guān)系,檢測限為34pg/mL。實驗結(jié)果說明此方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點,有望成功應(yīng)用于其它重要生物蛋白的分析檢測。

第三章：基于樹枝狀高分子化合物及功能化納米金的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建及其對α-突觸核蛋白的檢測

本文利用雙重信號放大策略,制備了一種新型電化學(xué)免疫傳感器,并將其用于α-突觸核蛋白的定量分析。該傳感器利用聚酰胺胺-金/聚鄰氨基苯甲酸/玻碳電極(PAMAM-Au/o-ABA/GCE)為基底,通過共價鍵和作用固定α-突觸核蛋白。另外,采用納米金為載體固定辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗,制備了{HRP-Ab2-GNPs}納米金標(biāo)復(fù)合物。通過抗原-抗體特異性反響,將一抗、納米金標(biāo)復(fù)合物組裝到電極外表。以固定在電極外表的硫堇為電子媒介體,通過測定辣根過氧化酶催化過氧化氫產(chǎn)生的電流信號對α-突觸核蛋白進展檢測。結(jié)果說明,在優(yōu)化的實驗條件下,本文所提出的檢測策略具有寬的線性*圍(20pg/mL-200ng/mL)和低的檢測限(14.6pg/mL),且具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)快速等優(yōu)點,為生物分子的測定提供了新的方法。

第四章：單分子聚合物納米顆粒構(gòu)建的光電化學(xué)免疫傳感器用于SirTl蛋白的檢測研究

本文制備了單分子聚合物納米顆粒和TiO2-Au復(fù)合納米粒子,研制了一種新型光電化學(xué)免疫傳感器,用于SirT1蛋白的分析研究。首先將超支化偶氮聚合物巰基化,通過Au-S鍵將膠體金結(jié)實結(jié)合到單分子聚合物納米顆粒上,制成單分子GC-HBAP(?)內(nèi)米顆粒。單分子GC-HBAP納米顆粒修飾于ITO電極外表,不僅可以顯著提高光電利用效率,而且能夠提高抗體的負載量,從而提高光電響應(yīng)。采用“**治〞夾心構(gòu)造,將捕獲抗體(Ab1*1),目標(biāo)蛋白(SirTl),檢測抗體(Ab1*2),和{TiO2-Au/Ab2}生物復(fù)合物固定到電極外表。實驗結(jié)果說明,光電流信號對SirT1呈較寬的線性*圍為：1ng/mL～1000ng/mL,檢測限為0.29ng/mL。同時,將該光電化學(xué)免疫傳感器定量測定了不同細胞模型中SirT1蛋白的表達水平,獲得了滿意的結(jié)果。該傳感器具有良好的分析性能,靈敏度高,選擇性好,響應(yīng)快速,為超支化聚合物和TiO2在電化學(xué)生物傳感器方面開拓了新的應(yīng)用前景。

第五章：基于AuSiO2核殼納米材料的電化學(xué)免疫傳感器的建立及其對SirT1蛋白的檢測研究

本文基于AuSiO2核殼納米材料、MWNTP-Au內(nèi)米復(fù)合物材料制備了一種新型電化學(xué)免疫傳感器,用于SirTl的分析測定。將酶標(biāo)二抗分子(HRP-Ab2)巰基化后,通過Au-S共價鍵和作用固定到AuSiO2核殼納米材料外表,制成{AuSiO2/HRP-Ab2}生物復(fù)合物。采用夾心免疫構(gòu)造,首先將捕獲抗體(Ab1*1)固定在MWNTP-Au修飾的玻碳電極外表,接著通過免疫反響結(jié)合SirT1,檢測抗體(Ab1*2),進而吸附{AuSi02/HRP-Ab2}生物復(fù)合物,最后用示差脈沖伏安法(DPV)檢測電極外表的電流信號。結(jié)果說明,該傳感器響應(yīng)*圍寬(0.02ng/mL500ng/mL),檢測限低(12.5pg/mL),制備方法簡單、響應(yīng)迅速、靈敏度高、穩(wěn)定性好,在免疫分析生物分子方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

第六章：基于TiO2-Au建立的光電化學(xué)方法用于內(nèi)源性神經(jīng)毒素對乙酰膽堿酯酶活性損傷的研究

乙酰膽堿酯酶(AChE)是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵酶,它活性的異常變化與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病密切相關(guān)。本文利用電化學(xué)陽極氧化技術(shù)制備了排列有序的TiO2納米管陣列,并通過光電催化法將Au納米顆粒嵌入TiO2納米管中,最后利用交聯(lián)法將乙酰膽堿酯酶(AChE)固定到納米管上,制得TiO2-Au-AChE半導(dǎo)體復(fù)合納米材料體系,并將其應(yīng)用于內(nèi)源性神經(jīng)毒素1(R),2-二甲基-6,7-二羥基-1,2,3,4-四氫異喹啉[(R)-NMSal]對AChE活性抑制的作用機理研究。實驗結(jié)果說明,基于Ti02-Au-AChE酶傳感器的光電化學(xué)方法用于(R)-NMSal對AChE活性抑制作用的研究是可行的,這為乙酰膽堿酯酶在神經(jīng)退行性疾病的致病機理、藥物篩選等方面提供了重要的實驗依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：電化學(xué)生物傳感器納米材料光電化學(xué)α-突觸核蛋白sirT1乙酰膽堿酯酶

【學(xué)位授予單位】：華東師*大學(xué)

【學(xué)位級別】：博士

【學(xué)位授予年份】：2012

【】：TP212.3

【目錄】：

論文摘要6-9Abstract9-18第一章緒論18-54 第一節(jié)電化學(xué)生物傳感器19-30 第二節(jié)納米材料及其在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用30-36 第三節(jié)光電化學(xué)的概述及其在生物傳感器中的應(yīng)用研究36-42 第四節(jié)本論文的選題背景和研究內(nèi)容42-44 第五節(jié)本論文的工作和意義44-46 參考文獻46-54第二章Au-TiO_2光電化學(xué)免疫傳感器的制備及其對α-突觸核蛋白的檢測54-68 1.引言54-55 2.實驗局部55-58 2.1試劑與儀器56 2.2TiO_2-Au納米管陣列的制備56-57 2.3{Ab_2-Au-GO*}生物復(fù)合物的制備57 2.4光電化學(xué)免疫傳感器的制備57-58 2.5光電化學(xué)檢測58 3.結(jié)果與討論58-65 3.1Au及TiO_2-Au的SEM表征58 3.2{Ab_2-Au-GO*}生物復(fù)合物的表征58-59 3.3光電化學(xué)免疫傳感器的電化學(xué)表征59-60 3.4光電化學(xué)免疫傳感器的檢測原理60-61 3.5沉積Au納米顆粒對光電流的影響61 3.6外加電壓和酶催化反響時間對光電流的影響61-62 3.7實驗條件的優(yōu)化62-63 3.8重現(xiàn)性和穩(wěn)定性研究63-64 3.9光電化學(xué)免疫傳感器對α-SYN的檢測64-65 4.結(jié)論65 致謝65 參考文獻65-68第三章基于樹枝狀高分子化合物及功能化納米金的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建及其對α-突觸核蛋白的檢測68-84 1.引言68-69 2.實驗局部69-72 2.1試劑與材料70 2.2儀器70 2.3PAMAM-Au納米復(fù)合物的制備70 2.4{HRP-Ab_2-GNPs}納米金標(biāo)的制備70-71 2.5電化學(xué)免疫傳感器的制備71-72 2.6電化學(xué)檢測72 3.結(jié)果與討論72-80 3.1電聚合鄰氨基苯甲酸72-73 3.2PAMAM-Au納米復(fù)合物的表征73-74 3.3{HRP-Ab_2-GNPs}納米金標(biāo)的表征74-75 3.4修飾電極的AFM表征75 3.5免疫傳感器界面的電化學(xué)表征75-76 3.6免疫傳感器的電化學(xué)性質(zhì)76-77 3.7檢測條件的優(yōu)化77-78 3.8實驗條件的優(yōu)化78-79 3.9基于雙重信號放大的電化學(xué)免疫分析79 3.10電化學(xué)免疫傳感器檢測α-SYN79-80 3.11傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和再生性能80 4.結(jié)論80-81 致謝81 參考文獻81-84第四章單分子聚合物納米顆粒構(gòu)建的光電化學(xué)免疫傳感器用于SirT1蛋白的檢測研究84-99 1.引言84-86 2.實驗局部86-88 2.1試劑86 2.2儀器86 2.3單分子GC-HBAP納米顆粒的制備86-87 2.4制備{TiO_2-Au/Ab_2}生物復(fù)合物87-88 2.5光電化學(xué)免疫傳感器的制備88 2.6光電化學(xué)測試方法88 3.結(jié)果與討論88-96 3.1單分子GC-HBAP納米顆粒的表征88-89 3.2{TiO_2-Au/Ab_2}生物復(fù)合物的表征89-90 3.3光電化學(xué)傳感器的電化學(xué)表征90-91 3.4光電化學(xué)免疫傳感器的檢測原理91-92 3.5光電化學(xué)條件的優(yōu)化92-93 3.6單分子GC-HBAP納米顆粒對光電響應(yīng)的影響93-94 3.7傳感器的穩(wěn)定性和再生性能94-95 3.8光電化學(xué)免疫傳感器檢測SirT195 3.9光電化學(xué)免疫傳感器用于生物樣品的檢測95-96 4.結(jié)論96-97 致謝97 參考文獻97-99第五章基于AuSiO_2核殼納米材料的電化學(xué)免疫傳感器的建立及其對SirT1蛋白的檢測研究99-114 1.引言99-100 2.實驗局部100-104 2.1試劑和材料100-101 2.2儀器101 2.3MWNTP-Au納米復(fù)合物的制備101-102 2.4AuSiO_2核殼納米材料的制備102-103 2.5{AuSiO_2/HRP-Ab_2}生物復(fù)合物的制備103 2.6電化學(xué)免疫傳感器的制備103-104 2.7實驗方法104 3.結(jié)果與討論104-111 3.1MWNTP-Au納米復(fù)合物的表征104-105 3.2AuSiO_2核殼納米材料的表征105-107 3.3不同修飾過程的電化學(xué)表征107 3.4免疫反響條件的優(yōu)化107-108 3.5檢測條件的優(yōu)化108-109 3.6不同電化學(xué)免疫傳感器性能的比較109 3.7免疫傳感器的檢測分析109-110 3.8免疫傳感器的穩(wěn)定性和再生性能110-111 4.結(jié)論111 致謝111 參考文獻111-114第六章基于TiO_2-Au建立的光電化學(xué)方法用于內(nèi)源性神經(jīng)毒素對乙酰膽堿酯酶活性損傷的研究114-126 1.引言114-115 2.實驗局部115-116 2.1試劑和儀器115-116 2.2TiO_2納米管的制備1