視網(wǎng)膜血管鋪片技術(shù)的優(yōu)化創(chuàng)新,中醫(yī)眼科論文

視網(wǎng)膜血管鋪片技術(shù)的優(yōu)化創(chuàng)新,中醫(yī)眼科論文視網(wǎng)膜是由大腦向外延伸的視覺神經(jīng)末梢組織，其構(gòu)造復(fù)雜、精細(xì)、脆弱而代謝旺盛。其血管屬于終末血管系統(tǒng)，任何病理性的毀壞和血管梗阻等引起的組織缺氧，均能導(dǎo)致組織壞死，使其喪失感受和傳導(dǎo)光刺激的功能。因而血管改變是視網(wǎng)膜病變的重要特點(diǎn)。視網(wǎng)膜血管鋪片是研究視網(wǎng)膜血管病變的重要技術(shù)。但這項(xiàng)技術(shù)的消化時(shí)間不宜把握，展片難度大，很難制備出理想的視網(wǎng)膜血管鋪片。國內(nèi)外學(xué)者多采用胰蛋白酶直接消化或胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化制備視網(wǎng)膜血管鋪片。在本研究中，我們總結(jié)前人經(jīng)歷體驗(yàn)，不斷探索改良，建立了新的視網(wǎng)膜血管鋪片技術(shù)，現(xiàn)總結(jié)如下。1材料和方式方法1.1材料BALB/c小鼠來源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心【SCXK〔軍〕2020-0004】，SD大鼠購自中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源研究中心【SCXK〔京〕2020-0001】，SYXK〔京〕2020-0019.犬購自北京日新科技有限公司【SCXK〔京〕2018-0007】，恒河猴由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所提供【SCXK〔京〕2020-0011】，SYXK〔京〕2018-0030.蘇木素及伊紅Y染色液均為國產(chǎn)試劑〔益利精細(xì)〕,高碘酸〔批號011108,北京〕,Schiff〔UFG0108,上?！?ProteinaseK〔CALBIOCHEM,cat#539480〕,Trypsin1:250PorcinePancreas〔AMRESCO,lot#2861C173〕,anti-CD31antibody〔ABCAM,ab28364〕,anti-VEGFantibody〔BOSTER,cat#BA0407〕,兔超敏二步法免疫組化檢測試劑〔中杉金橋，PV-9001〕.正常羊血清工作液〔中杉金橋，ZLI-9056〕,抗體稀釋液〔中杉金橋，ZLI-9030〕.1.2方式方法1.2.1大鼠視網(wǎng)膜血管鋪片的制備大鼠脫頸椎法處死，摘取眼球，固定于10%中性福爾馬林。沿距齒緣剪開眼球去除晶狀體，用蒸餾水漂洗，以視神經(jīng)乳頭為中心將眼球壁均勻地剪成4份，剝離眼球壁視網(wǎng)膜層，再用蒸餾水漂洗。將剝離出的視網(wǎng)膜放在蒸餾水中37℃孵育1~2h,蒸餾水漂洗，孵育后的視網(wǎng)膜放入1g/L的蛋白酶K中，56℃消化13~17min,去除消化掉的感光層細(xì)胞，蒸餾水漂洗，再將視網(wǎng)膜層放入3%胰蛋白酶消化液中，37℃消化40~60min.用吸管將半透明狀的血管網(wǎng)移入蒸餾水中漂洗，用吸管輕輕吹打非透明狀區(qū)域，直到血管網(wǎng)成透明狀，再將吹打成透明狀的血管網(wǎng)鋪到含多聚賴氨酸的載玻片上，展平，自然枯燥。在消化經(jīng)過中，蛋白酶k消化時(shí)，每5min輕柔搖動一次，再以最低完成消化時(shí)間為觀察起點(diǎn)：蛋白酶K消化13min時(shí)，肉眼觀察，輕柔搖動，若見感光層細(xì)胞脫落，即完成第一步消化。若消化不完全，每2min輕柔搖動觀察一次，直至感光層脫落。胰蛋白酶消化時(shí)，每10min輕柔搖動一次，也是以最低完成消化時(shí)間為觀察起點(diǎn)，若消化不完全，每5min輕柔搖動觀察一次。1.2.2不同動物的視網(wǎng)膜在消化酶中的消化時(shí)間在大鼠鋪片基礎(chǔ)上，我們探索了BALB/c小鼠，犬和恒河猴視網(wǎng)膜血管鋪片的消化時(shí)間表1.BALB/c小鼠眼球小，在剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜層之前，要將眼球壁均勻剪成2份。犬和恒河猴眼球較大，構(gòu)造特殊，取材后需立即固定4h,再用鋒利的刀片在眼球的上下部各切開一個(gè)小口，繼續(xù)固定24h.將眼球壁均勻地剪成若干等份，每一等份大小約0.4cm0.4cm,再剝離視網(wǎng)膜層。1.2.3視網(wǎng)膜血管鋪片HE染色將視網(wǎng)膜血管鋪片置于自來水中水化15min,蘇木蘇染核1min,自來水沖洗，伊紅復(fù)染2min,梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。1.2.4視網(wǎng)膜血管鋪片PAS染色PAS染色方式方法參照文獻(xiàn)[1]:將視網(wǎng)膜血管鋪片置于自來水中水化15min,蒸餾水洗2次，參加高碘酸氧化10min,蒸餾水速洗2次，參加schiff試劑反響5min,自來水流水沖洗2min,蘇木素染核2min,自來水返藍(lán)5min,梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。1.2.5視網(wǎng)膜血管鋪片免疫組化染色免疫組化染色方式方法參照文獻(xiàn)[2],略有改變：①將視網(wǎng)膜血管鋪片置于PBS中水化15min;②微波中火修復(fù)5min;③3%雙氧水封閉15min;④正常羊血清工作液封閉20min;⑤滴加用抗體稀釋液稀釋的一抗〔CD31稀釋度為1∶50;VEGF稀釋度為1∶200〕,室溫孵育1.5h;⑥滴加二抗試劑1,室溫孵育10min;⑦滴加二抗試劑2,室溫孵育10min;⑧DAB顯色；⑨蘇木素復(fù)染4s;⑩梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片2結(jié)果。2.1大鼠視網(wǎng)膜血管鋪片經(jīng)HE及PAS染色可見：鋪片完好，清楚明晰顯示血管走向。各級血管形態(tài)清楚明晰，血管分支清楚完好，無斷裂現(xiàn)象。細(xì)胞形態(tài)清楚明晰，細(xì)胞核可清楚明晰顯示〔彩插12圖1〕.酶消化會造成部分抗原的丟失，因而需要對抗原進(jìn)行修復(fù)。修復(fù)溫度太低造成修復(fù)不完全，溫度太高又會脫片。經(jīng)過探索，我們發(fā)現(xiàn)，微波中火5min即可將抗原修復(fù)。免疫組化結(jié)果顯示：CD31和血管內(nèi)皮生長因子〔vascularendothelialgrowthfactor,VEGF〕在正常大鼠鋪片均有表示出：CD31在血管周細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞均有表示出；VEGF主要在內(nèi)皮細(xì)胞表示出。2.2小鼠、狗、猴視網(wǎng)膜鋪片根據(jù)大鼠鋪片經(jīng)歷體驗(yàn)，我們探索了BALB/c小鼠，犬和恒河猴的視網(wǎng)膜血管鋪片消化時(shí)間。經(jīng)HE及PAS染色，可見血管網(wǎng)完好，無神經(jīng)組織殘留。各級血管構(gòu)造清楚，大動物小動脈可顯示血管壁的平滑肌。毛細(xì)血管網(wǎng)由內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞組成，細(xì)胞形態(tài)清楚明晰，細(xì)胞核構(gòu)造清楚〔彩插12圖2〕.3討論1960年Kuwabara[3]用胰蛋白酶對視網(wǎng)膜進(jìn)行消化制備了視網(wǎng)膜血管鋪片，為視網(wǎng)膜血管的研究提供了一種新的手段。1963年Ashton[4]改良了Kuwabara的方式方法，用胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化法，成功制備了貓的視網(wǎng)膜血管鋪片。此后又經(jīng)過各國學(xué)者的不斷努力[5-8],才有了今天的技術(shù)基礎(chǔ)。視網(wǎng)膜血管消化鋪片技術(shù)難度較大：消化不完全，鋪片不能充分顯示出血管。消化過度，又會造成血管構(gòu)造不清楚明晰，甚至斷裂，直接影響對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察和分析。蛋白酶K是一種高活性蛋白酶，能快速、有效地裂解組織細(xì)胞，因而在本研究中，我們選擇先用蛋白酶K消化掉視網(wǎng)膜感光層細(xì)胞。同時(shí)，蛋白酶K能穿透細(xì)胞膜，毀壞細(xì)胞核，于是我們將視網(wǎng)膜層漂洗后再移入到3%胰蛋白酶中進(jìn)一步消化。應(yīng)用蛋白酶K-胰蛋白酶聯(lián)合消化法，成功制備了不同實(shí)驗(yàn)動物的視網(wǎng)膜血管鋪片。視網(wǎng)膜血管鋪片制備經(jīng)過中，應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：①眼球的固定：大、小鼠眼球取材后直接固定于10%中性福爾馬林24h以上。狗和猴眼球組織構(gòu)造特殊，各部分組織構(gòu)造的軟硬度不同，因而取材后立即固定4h,再用鋒利的刀片在眼球的上下部各切開一個(gè)小口，繼續(xù)固定24h.由于固定液易造成視網(wǎng)膜血管的斷裂，因而固定時(shí)間最好不超過72h.②視網(wǎng)膜的剝離：視網(wǎng)膜位于眼球壁的內(nèi)層，組織比擬薄，而且附著在色素層上，剝離經(jīng)過中很容易破碎。因而去除晶狀體后，以視神經(jīng)乳頭為中心，將眼球壁剪開成若干等份，輕輕剝離出視網(wǎng)膜。③血管的消化：消化經(jīng)過中，隨時(shí)注意觀察。蛋白酶K消化能力極強(qiáng)，每5min稍微搖動一次，再以最低完成消化時(shí)間為觀察起點(diǎn)，每2min輕柔搖動一次，待肉眼可見感光層脫落即可終止消化。換成胰蛋白酶消化時(shí)，每10min稍微搖動一次，再以最低完成消化時(shí)間為觀察起點(diǎn)，每5min輕柔搖動一次，待可見半透明血管網(wǎng)即終止消化。④鋪片：將消化好的血管網(wǎng)漂洗干凈，平鋪于含多聚賴氨酸的載玻片上，不要將載玻片上的水吸干凈，否則未貼壁的血管網(wǎng)漂移，影響對血管走向的觀察。⑤抗原修復(fù)：常規(guī)微波修復(fù)石蠟切片需要高火3min,中火5min,再低火3min.而視網(wǎng)膜血管鋪片只需中火5min即可完成抗原修復(fù)。蛋白酶K-胰蛋白酶聯(lián)合消化法制備大鼠視網(wǎng)膜血管鋪片成功率高，穩(wěn)定性好，同時(shí)也適用于不同實(shí)驗(yàn)動物，為視網(wǎng)膜血管性疾病的研究提供了重要途徑。以下為參考文獻(xiàn)：[1]李彥紅，朱華，徐艷峰，等。過敏性紫癜兔模型的免疫學(xué)改變及機(jī)制初探[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)。2020,21〔6〕:65-69.[2]朱華，徐艷峰，劉穎，等。鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病恒河猴胰島細(xì)胞數(shù)量的變化[J].中國比擬醫(yī)學(xué)雜志。2020,22〔12〕:1-3.[3]KuwabaraT,CoganDG.Studiesofretinalvascularpatterns.I.Nor