不同單株大葉女貞對冬季低溫的生理響應(yīng)

不同單株大葉女貞對冬季低溫的生理響應(yīng)近年來，由于全球氣候多變，極端天氣頻發(fā)，溫帶氣候區(qū)的木本植物在自然周年生長過程中經(jīng)常遭受環(huán)境低溫脅迫的威脅［1-2］，甚至出現(xiàn)因冷害導(dǎo)致植物死亡的現(xiàn)象。低溫傷害每年都給全世界農(nóng)林生產(chǎn)造成巨大損失。研究表明，植物受低溫冷害時(shí)，體內(nèi)的細(xì)胞膜透性、滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)及代謝過程等一系列生理過程都會(huì)發(fā)生顯著的變化［4-5］。5種酢漿草屬植物經(jīng)過自然低溫處理，結(jié)合形態(tài)特征觀測，測定相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、可溶性蛋白含量等指標(biāo)，評價(jià)其抗寒性，結(jié)果表明在自然低溫處理下，5種植物的生理生化指標(biāo)變化趨勢基本一致，與自然低溫處理下的觀測結(jié)果一致。王娜等研究八角金盤、夾竹桃、闊葉十大功勞、樟葉槭4種常綠植物的抗寒性表明，在低溫下植物體的可溶性糖含量、游離脯氨酸含量、過氧化物酶活性和相對電導(dǎo)率整體呈上升趨勢。也有研究表明，低溫可以誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片中苯丙氨酸解氨酶的基因表達(dá)。葉片中相對電解質(zhì)滲漏率和丙二醛含量顯著升高，提高了胞內(nèi)抗氧化酶（過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶）活性，可有效地清除活性氧分子，維持抗氧化物質(zhì)抗壞血酸（AsA）氧化還原狀態(tài)，緩解低溫引起的光損傷和氧化損傷。大葉女貞（Ligustrunlucidum）別稱蠟樹，又名女貞、高桿女貞、冬青等，為木樨科女貞屬常綠闊葉喬木，原產(chǎn)亞熱帶地區(qū)。中國栽培以長江以南及西南地區(qū)為主，甘肅南部與華北南部少有栽培;其葉片光潔亮綠，經(jīng)冬不落，是南方園林綠化中的主要樹種之一。隨著中國北方城市園林綠化的發(fā)展，大葉女貞已引種到北京、上海、青島等地。然而我國絕大部分北方地區(qū)冬季寒冷，大葉女貞常表現(xiàn)較嚴(yán)重的凍害，影響其觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。選育出適合北方發(fā)展優(yōu)良抗寒品種，安全越冬已成為推廣大葉女貞在北方地區(qū)生產(chǎn)栽培發(fā)展中的重要制約因素。本試驗(yàn)通過對青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)栽植的大葉女貞冬季受凍情況進(jìn)行全面調(diào)查并分級，初選出部分優(yōu)良抗寒單株。而表型選擇通常會(huì)受到環(huán)境因子的影響，為確定初選的耐寒植株、正常植株及受凍嚴(yán)重的植株之間在生理水平上是否有差異，筆者通過不同抗寒性植株枝條水分含量以及防御性酶活性的變化，進(jìn)一步在生理水平上對篩選出的耐寒植株進(jìn)行評定，以期為培育大葉女貞優(yōu)良抗寒品系提供科學(xué)依據(jù)。1材料與方法試驗(yàn)材料供試大葉女貞枝條采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)位于120°12‘E、36°20'N,屬暖溫帶季風(fēng)大陸性氣候，年均氣溫12.6℃,1月最低，月平均氣溫-2℃，8月最高，月平均氣溫25.7℃，年平均降水量700mm左右。試驗(yàn)方法大葉女貞受凍調(diào)查等級試驗(yàn)于2018年3月1日至4月14日在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根生物技術(shù)研究所進(jìn)行。調(diào)查方法為實(shí)地普查記錄受凍害植物的受害程度以及具體表現(xiàn)，同時(shí)為了便于比較分析，本研究在參考相關(guān)研究資料［9-11］的基礎(chǔ)上，以綜合所調(diào)查植物總體受凍害狀況的特點(diǎn)為依據(jù)，制定了凍害分級標(biāo)準(zhǔn)，具體見表1。隨機(jī)選擇不同受害等級的植株3株，隨機(jī)剪取1年生發(fā)育枝10根，并迅速在剪切口封蠟，裝入塑封袋封好。帶回實(shí)驗(yàn)室后，迅速用刀分離1年生枝條的韌皮部與木質(zhì)部。把韌皮部分8份，分裝后，放入-20℃的低溫冰箱內(nèi)備用。測定指標(biāo)大葉女貞枝條總含水量測定取任一稱量瓶并稱質(zhì)量（ml）;取相同大小的枝條3根，立即裝入稱量瓶中，蓋緊瓶蓋并精確稱質(zhì)量（m2）;再將稱量瓶連同枝條放入烘箱中105℃殺青，其間敞開瓶蓋，于85℃下烘至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量（m3）。質(zhì)量差等于葉片含水量，以上測定重復(fù)3次，總含水量計(jì)算公式如下：植物組織的總含水量=（m2-m3）/（m2-m1）x100%。大葉女貞枝條自由水含量的測定任取一稱量瓶并稱質(zhì)量（m4）,取相同大小的枝條3根，立即裝入稱量瓶中，蓋緊瓶蓋并稱質(zhì)量（m5）,再在稱量瓶中加入5mL蔗糖（濃度為C1），再分別稱質(zhì)量（m6）。把稱量瓶放置于暗處6h，其間不時(shí)輕輕搖動(dòng)，到預(yù)定的時(shí)間后充分搖動(dòng)溶液，分別測定各瓶蔗糖的濃度（C2），以上測定重復(fù)3次，具體計(jì)算公式如下：植物組織中自由水的含量=（m6-m5）x（C1-C2）/[（m5-m4）xC2]x100%；束縛水=總含水量-自由水含量。防御性酶活性的測定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定參照紫外分光光度計(jì)法;抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參照Xia等的方法;過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用紫外線吸收法;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法;相對電導(dǎo)率測定采用電導(dǎo)率法;丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法;多酚氧化酶（PPO）活性、可溶性糖含量參考王學(xué)奎的方法測定。數(shù)據(jù)分析采用MicrosoftExcel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和繪圖，采用DPSv7.5分析軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan“s法進(jìn)行多重比較。與分析不同單株大葉女貞葉片冬季自由水和束縛水含量自由水與束縛水的含量與抗寒性緊密相關(guān)。自由水直接參與細(xì)胞各種代謝活動(dòng)，當(dāng)自由水含量升高時(shí)，代謝的活性升高，生長發(fā)育較快;當(dāng)束縛水的含量升高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)變成凝膠狀態(tài)，植物的代謝活性減弱，生長緩慢。自由水與束縛水的比值可以用來評價(jià)植株的抗寒性。由表2可見，在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級枝條中自由水與束縛水比值差異明顯，0級大葉女貞自由水與束縛水比值最小，為1.42，V級比值最大，為3.85。植物抗寒性與自由水與束縛水比值呈負(fù)相關(guān)，大葉女貞不同枝條抗寒性的順序?yàn)?級I級II級III級IV級V級。不同單株大葉女貞葉片冬季PAL和PPO活性苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是苯丙烷類次生代謝途徑的限速酶和關(guān)鍵酶，與植物的非生物逆境抗性密切相關(guān)。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級枝條中PAL活性差異顯著。II級大葉女貞PAL活性最高為20.4U/mgV級活性最低為7.6U/mg。植物抗寒性與PAL活性呈正相關(guān)，大葉女貞不同枝條抗寒性的順序?yàn)镮I級0級I級III級IV級V級（圖1）。多酚氧化酶（PPO）廣泛存在于植物體的各種器官或組織中，是植物抗寒性的基礎(chǔ)條件之一。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級枝條中PPO活性差異顯著。0級大葉女^枝條PPO活性最高，為170U/g,V級活性最低，為86.3U/g,植物抗寒性與PPO活性呈正相關(guān)，抗寒性的順序?yàn)?級I級I級II級V級V級（圖1）。不同單株大葉女貞葉片冬季APX和CAT活性植物通過調(diào)節(jié)自身一系列的代謝反應(yīng)對低溫脅迫作出適應(yīng)性響應(yīng)，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性和胞內(nèi)滲透平衡，其中APX能夠積累抗氧化物質(zhì)抗壞血酸（AsA）含量，保護(hù)細(xì)胞免受傷害。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級枝條中APX活性差異顯著。I級大葉女貞APX活性最高，為216U/g,V級活性最低，為135.4U/g。植物抗寒性與APX活性呈正相關(guān)，抗寒性的順序?yàn)镮級I級I級零級V級V級（圖2）。同時(shí),植物離體后還會(huì)產(chǎn)生較多的抗氧化酶及其他非酶類抗氧化劑來提高適應(yīng)性，以抵御活性氧氧化損傷及致死效應(yīng)。其中，CAT可以將過氧化氫分解成水，可清除體內(nèi)具有潛在危害的0-2和H2O2,這樣可避免羥自由基對細(xì)胞的破壞。在同一低溫脅迫下,6個(gè)大葉女貞受凍等級枝條中CAT活性差異顯著。0級大葉女貞CAT活性最高，為5.4U/g,V級活性最低，為2.2U/g。植物抗寒性與CAT活性呈正相關(guān)，抗寒性的順序?yàn)?級I級I級I級V級V級（圖2）。不同單株大葉女貞葉片冬季可溶性蛋白和可溶性糖含量在低溫條件下可溶性蛋白含量提高是植物對低溫的適應(yīng)性反應(yīng)?？扇苄缘鞍讓ξ唇?jīng)抗寒鍛煉的原生質(zhì)膜有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是增加了質(zhì)膜中蛋白質(zhì)之間的親和力，從而增強(qiáng)了膜結(jié)構(gòu)在冰融過程中的穩(wěn)定性。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級枝條中可溶性蛋白含量差異顯著。0級大葉女貞可溶性蛋白含量最高，為7.4mg/g，V級含量最低，為3.7mg/g。抗寒性與可溶性蛋白含量呈正相關(guān)，抗寒性的順序?yàn)?級I級II級IV級III級V級（圖3）。在低溫條件下植物體內(nèi)的可溶性糖不斷積累，其主要是作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑起作用，可以降低細(xì)胞的水勢并增強(qiáng)其持水力。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級枝條中可溶性糖含量差異顯著。II級大葉女貞可溶性糖含量最高，為0.86mg/g，V級含量最低，為0.34mg/g。植物抗寒性與可溶性糖含量呈正相關(guān)，抗寒性的順序?yàn)镮I級0級I級I級V級V級（圖3）。不同單株大葉女貞葉片冬季MDA含量和相對電導(dǎo)率膜脂過氧化加劇所導(dǎo)致的細(xì)胞膜透性增加和細(xì)胞滲透壓變化，是導(dǎo)致植株耐寒性強(qiáng)弱的依據(jù)而MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，細(xì)胞滲透壓變化影響植物相對電導(dǎo)率，MDA含量直接反映膜脂過氧化損傷程度。在同一低溫脅迫下，6個(gè)大葉女貞受凍等級枝條中MDA含量和相對電導(dǎo)率差異顯著。I級大葉女貞MDA含量和相對電導(dǎo)率最低，分別為4.5mg/g和43%，V級活性最高，分別為10.4mg/g和73%。植物抗寒性與MDA含量呈負(fù)相關(guān)，抗寒性的順序?yàn)镮級0級I級I級V級與相對電導(dǎo)率也呈負(fù)相關(guān)，抗寒性順序?yàn)镮級0級I級I級V級V級（圖4）。各單項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)系數(shù)矩陣本研究對6個(gè)大葉女貞受凍等級處理及9個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，得到相關(guān)系數(shù)矩陣（表3）。由表3可以看出，大葉女貞枝條PAL活性與PPO活性呈顯著正相關(guān)，與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)。大葉女貞枝條自由水和束縛水比值與PAL活性、PPO活性、APX活性、CAT活性、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量呈負(fù)相關(guān)，與MDA含量、相對電導(dǎo)率呈正相關(guān)。3結(jié)論與討論植物的生長發(fā)育以及對不良環(huán)境脅迫的響應(yīng)是一個(gè)多因素控制的復(fù)雜過程。許多研究證實(shí)，當(dāng)植株受到低溫環(huán)境影響后，植物體內(nèi)自由水和束縛水含量、CAT活性、MDA含量、相對電導(dǎo)率、APX活性、PAL活性、PPO活性、可溶性蛋白含量，可溶性糖含量往往會(huì)發(fā)生較大幅度的變化，這表明均與植物的抗寒性有密切關(guān)系［15-16］。植物醴內(nèi)的水分含量及狀態(tài)在一定程度上決定植物的抗寒性，自由水含量高、束縛水含量低的植物抗寒性差。自由水在低溫狀態(tài)下易結(jié)冰，導(dǎo)致細(xì)胞脫水死亡或者在細(xì)胞內(nèi)部形成冰晶損傷細(xì)胞膜系統(tǒng)，造成植物抗寒性下降;而束縛水通常在-20?-25℃下保持不結(jié)冰。本研究結(jié)果表明，受害情況較輕的0級和I級枝條總含水量和束縛水含量較高，自由水含量較低，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐寒性。植物葉片細(xì)胞膜的穩(wěn)定性與其抗寒性密切相關(guān)。當(dāng)植物受到凍害時(shí)，體內(nèi)活性氧含量會(huì)增多，膜脂過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的MDA會(huì)增多，同時(shí)葉片細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到不同程度的破壞，膜透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的部分電解質(zhì)外滲，引起代謝紊亂，植物的生長發(fā)育受到阻礙，甚至死亡。研究細(xì)胞膜透性、MDA含量與抗寒性的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性與抗寒性呈正相關(guān)，MDA含量與抗寒性呈負(fù)相關(guān)，證明細(xì)胞膜透性和MDA含量是衡量植物抗寒性的有效指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，受害情況較輕的0級和I級枝條內(nèi)MDA含量以及細(xì)胞膜透性較小，凍害程度較大的V級枝條中MDA含量、細(xì)胞膜透性最大，表明外觀凍害程度較大的大葉女貞枝條與生理上的反應(yīng)基本一致，這與林艷等的研究結(jié)果相符合。同時(shí)，植物受低溫后還會(huì)產(chǎn)生較多的抗氧化酶（PAL、PPO、APX、CAT等）及其他非酶類抗氧化劑來提高適應(yīng)性，以抵御活性氧氧化損傷及致死效應(yīng)［19-20］?？寡趸割惪梢詫⑦^氧化氫分解成水，相互之間共同作用可清除體內(nèi)具有潛在危害的0-2?和H2O2,這樣可避免羥自由基對細(xì)胞的破壞。本試驗(yàn)中受害情況較輕的0級和I級枝條PAL活性、PPO活性、APX活性以及CAT活性等較高，具有較強(qiáng)的耐寒性，表明抗氧化酶類可以在一定程度上表現(xiàn)出大葉女貞的抗寒性，