肺癌分子診斷小標(biāo)本取材共識(shí)解讀：經(jīng)皮肺穿刺篇

分子診斷的規(guī)范化及質(zhì)量控制北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部張波內(nèi)容分子檢測(cè)規(guī)范化指南共識(shí)檢測(cè)質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化標(biāo)本處理SOP病理質(zhì)控合適的檢測(cè)方法中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者EGFR突變檢測(cè)的參考標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范中華病理學(xué)雜志2011，40（10）：700-2;JournalofThoraciconcology,2010,5(10):1706-13.對(duì)于肺腺癌患者要優(yōu)先進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)。中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變檢測(cè)的共識(shí)

（2011）所有非小細(xì)胞肺癌患者，只要條件允許，都應(yīng)嘗試腫瘤組織的EGFR基因突變檢測(cè)。*進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)時(shí)，需要臨床醫(yī)師與病理醫(yī)師協(xié)作配合，提高臨床醫(yī)師的檢測(cè)意識(shí)。中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變檢測(cè)的共識(shí)

（2016）“無(wú)法取得足夠組織及細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的晚期肺腺癌患者，可用血液標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)。對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移肺癌患者或耐藥患者推薦行重復(fù)活檢，及時(shí)監(jiān)測(cè)耐藥突變?！敝腥A病理學(xué)雜志2016，45（4）：217-220;JournalofThoraciconcology,Dio：10.3760/cma.j.issn.0529-5807.2016.04.001操作規(guī)范因ctDNA含量低，為提高EGFR突變檢出率，建議使用10毫升全血分離出的血漿（4-5毫升）。為了最小化獲得假陰性結(jié)果的可能性，推薦使用高敏感度的的檢測(cè)方法用于ctDNA樣本的EGFR突變檢測(cè)。目前，檢測(cè)基因突變最常用的方法是擴(kuò)增阻遏突變系統(tǒng)(ARMS法)，歐盟批準(zhǔn)用于指導(dǎo)吉非替尼治療的血液檢測(cè)方法也是ARMS檢測(cè)方法。檢測(cè)必須在具有資質(zhì)的檢測(cè)中心進(jìn)行。檢測(cè)方法必須進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證及質(zhì)控。檢測(cè)試劑須使用經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)批準(zhǔn)的檢測(cè)試劑盒。病理質(zhì)控,重中之重病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之一:實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化規(guī)范化——實(shí)驗(yàn)室建設(shè)各區(qū)獨(dú)立、注意風(fēng)向、防止污染、因地制宜、方便工作符合《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》的要求產(chǎn)物分析唯一流向規(guī)范化——儀器與試劑儀器及試劑經(jīng)CFDA認(rèn)證,建立訂購(gòu)、接受和驗(yàn)收程序性文件病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之一:實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化規(guī)范化——人員人員的內(nèi)部和外部培訓(xùn)、技術(shù)人員持PCR上崗證簽字人員需具備執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之一:實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化規(guī)范化——室間質(zhì)評(píng)、室內(nèi)質(zhì)控室間質(zhì)量評(píng)價(jià)、室內(nèi)質(zhì)量控制(病理、DNA質(zhì)量、不同方法的比對(duì)、定期重復(fù)檢測(cè))、質(zhì)量的持續(xù)改進(jìn)2016病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之一:實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化臨床醫(yī)生臨床醫(yī)生/護(hù)士轉(zhuǎn)運(yùn)人員病理科/檢驗(yàn)科病理醫(yī)師/遺傳分析師病理醫(yī)生/臨床醫(yī)生送檢申請(qǐng)樣本采集樣品轉(zhuǎn)運(yùn)分子檢測(cè)結(jié)果判讀報(bào)告解讀目標(biāo)申請(qǐng)單填寫(xiě)規(guī)范：信息準(zhǔn)確、全面，為后續(xù)分子檢測(cè)及患者治療提供參考明確可開(kāi)展分子檢測(cè)的樣品類型，規(guī)范樣品的采集及預(yù)處理流程強(qiáng)化樣品轉(zhuǎn)運(yùn)的時(shí)效性，保障樣品質(zhì)量，縮短檢測(cè)周期保證檢測(cè)平臺(tái)資質(zhì)（軟硬件），強(qiáng)化檢測(cè)質(zhì)量，優(yōu)化檢測(cè)方法確保結(jié)果分析的專業(yè)性與準(zhǔn)確性及時(shí)發(fā)出檢測(cè)報(bào)告，為臨床與患者提供一定的結(jié)果解釋與參考建議醫(yī)生關(guān)鍵流程病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之:肺癌分子診斷全流程規(guī)范化肺癌分子檢測(cè)申請(qǐng)單設(shè)計(jì)與填寫(xiě)的意義：有效區(qū)別初治患者和耐藥患者，區(qū)隔檢測(cè)結(jié)果；排除不良影響因素，提供更準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果；了解臨床影響因素，更好解釋初治/耐藥檢測(cè)結(jié)果；探索某些臨床因素對(duì)于耐藥檢測(cè)結(jié)果影響；完善患者信息管理，推動(dòng)肺癌多學(xué)科治療；分子檢測(cè)申請(qǐng)單設(shè)計(jì)與填寫(xiě)規(guī)范化送檢申請(qǐng)國(guó)內(nèi)外肺癌分子檢測(cè)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范化規(guī)范化的分子檢測(cè)報(bào)告信息的4項(xiàng)要素患者基本信息與樣本信息檢測(cè)項(xiàng)目與方法學(xué)描述突變位點(diǎn)命名標(biāo)準(zhǔn)化(HGVS)檢測(cè)結(jié)果的正確臨床解讀檢測(cè)報(bào)告簽名與日期√√√√√中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變檢測(cè)專家共識(shí)(2016版)EMQNExternalQualityAssessmentSchemeforlungcaner(2015)選擇合適的標(biāo)本腫瘤組織—目前最可靠的標(biāo)本手術(shù)標(biāo)本活檢標(biāo)本其他樣本—組織學(xué)樣品的有效補(bǔ)充細(xì)胞學(xué)(胸水、支氣管灌洗液、腹水、腦脊液、痰液細(xì)胞學(xué))支氣管刮取物外周血(血漿、血清、循環(huán)腫瘤細(xì)胞)病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之二:標(biāo)本處理規(guī)范病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之二:標(biāo)本處理規(guī)范標(biāo)本的處理離體后處理:及時(shí)切開(kāi)、固定(盡快)固定液:10%中性福爾馬林(pH≈7.0)

(不推薦使用任何其它溶液)固定液量:

≥10倍體積固定時(shí)間:6~48小時(shí)(組織固定不當(dāng)影響核酸的純化和擴(kuò)增)病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之二:標(biāo)本處理規(guī)范標(biāo)本問(wèn)題石蠟組織:盡可能送檢一年內(nèi)的石蠟標(biāo)本.石蠟切片:含腫瘤細(xì)胞越多越好(50%以上);組織部位面積約6mmx6mm以上;包埋組織:組織塊不小于0.5×0.5×0.5(cm).

新鮮組織:比石蠟等處理過(guò)的舊組織,DNA保存得更完整,對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)更有利,但一定要經(jīng)病理學(xué)確認(rèn).含有腫瘤組織50%以上;重量≥10ｍg(約米粒大小以上),經(jīng)PBS或生理鹽水沖洗干凈.取癌組織的中心位置組織塊(避開(kāi)壞死區(qū)域),固定于10%中性福爾馬林溶液中,盡快送病理科.適宜的切片HE片確認(rèn)*,癌細(xì)胞數(shù)≥200個(gè)(不推薦依經(jīng)驗(yàn)盲取)常規(guī)切片(4~5μm厚,普通載玻片)連續(xù)切片8~10張刀片:一次性(不推薦交叉使用)病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之二:標(biāo)本處理規(guī)范病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之二:標(biāo)本處理規(guī)范各類型標(biāo)本的特點(diǎn)標(biāo)本類型標(biāo)本的特點(diǎn)腫瘤DNA對(duì)檢測(cè)方法的要求手術(shù)切除標(biāo)本標(biāo)本較大,能提供足夠的腫瘤組織量多,高質(zhì)量腫瘤DNADNA直接測(cè)序的靈敏度支氣管鏡、穿刺活檢測(cè)標(biāo)本標(biāo)本較小;腫瘤組織較少量少,但腫瘤DNA質(zhì)量仍好靈敏度高的檢測(cè)方法細(xì)胞學(xué)標(biāo)本腫瘤細(xì)胞含量較少量少靈敏度高的檢測(cè)方法血清、血漿標(biāo)本含腫瘤DNA含量不穩(wěn)定,DNA片段化靈敏度高的檢測(cè)方法循環(huán)腫瘤細(xì)胞含腫瘤DNA量少,較高質(zhì)量腫瘤DNA靈敏度高的檢測(cè)方法1.DacicS.AdvAnatPathol2008;15(4):241-247.2.SequistLV,etal.ClinCancerRes2006;12(14S):4403s-4406s.3.BaiH,etal.JClinOncol2009;27(16):2653-2659.18血液樣本采集與轉(zhuǎn)運(yùn)流程規(guī)范化采集管采樣量分離時(shí)間提取時(shí)間Plasma保存溫度血漿DNA

Kit提取cfDNA濃度評(píng)估cfDNA質(zhì)量評(píng)估cfDNA保存溫度K2EDTA管<2.5mL<1h<1h-80YesYesqPCR-80檸檬酸鈉管2.5mL-5mL1h-24h1h-24h-20NoNoSequencing-20肝素管5mL-10mL24h-48h24h-48h4--PCR+qPCR4其他>10mL>48h>48hRT--其他RTMalentacchiF,etal.,ClinChemLabMed,2015,March僅有12.5%實(shí)驗(yàn)室合格19血液樣本與采集轉(zhuǎn)運(yùn)流程規(guī)范化-保存溫度的優(yōu)化外周血保存溫度和時(shí)間對(duì)于cfDNA得率與降解的影響外周血保存溫度的設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)最優(yōu)保存溫度10-37攝氏度IM

Diaz,etal.,Plosone,2016,November10病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之三:病理評(píng)估病理評(píng)估腫瘤組織標(biāo)本病理學(xué)評(píng)估組織切片H&E染色片用于病理評(píng)估病理學(xué)診斷及評(píng)估:腫瘤細(xì)胞比例、足夠量的腫瘤細(xì)胞、標(biāo)識(shí)腫瘤豐富的區(qū)域富集腫瘤細(xì)胞對(duì)于復(fù)發(fā)的患者,再次活檢不僅可確診,還可以獲得分子標(biāo)志物的信息PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度可擴(kuò)增DNADNA10倍稀釋后病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之三:病理評(píng)估DNA質(zhì)控紫外分光光度計(jì):適合新鮮組織DNA質(zhì)控測(cè)定總量(OD260)及DNA純度(OD260/280)qPCR:FFPE來(lái)源DNA的最可靠質(zhì)控方法檢測(cè)可擴(kuò)增的DNA片斷評(píng)估是否存在PCR抑制劑病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之四:檢測(cè)方法可靠的樣品追蹤記錄DNA質(zhì)量不高(石蠟組織樣品)可靠的DNA抽提方法方便后續(xù)EGFR突變分析嚴(yán)格控制樣品間交叉污染DNA提取Steps采用靈敏高效的檢測(cè)方法,及時(shí)準(zhǔn)確地反應(yīng)檢測(cè)信息指導(dǎo)臨床,在嚴(yán)格執(zhí)行SOP的實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性ME-PCR/SequencingO=產(chǎn)物轉(zhuǎn)移/加入試劑/開(kāi)管操作qPCR:

Real-time

DetectionPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingPCRPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingPCRHetero-

duplexCapillaryElectro-phoresisARMS&PNA-LNAclampPCR/SequencingNestedPCR/SequencingPCR/

HRMA/

dHPLCPCR/

RFLPPCRRFLPElectro-phoresisSizingPCRPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingRFLPOOOOOOOOOOOOTaqManClean-upOClean-upOClean-upOOOOPCRSURVEYORcleavagedHPLCSizingOConfirmationbysequencingPCR/

SURVEYORPCRClean-upPyro-sequencingRxnPyroSequencingOO1234567ConfirmationbysequencingOConfirmationbysequencingOOO1%~10%3-10%10%3-12%20~30%20~30%qPCR:

Real-time

Detection~10%<1%病理質(zhì)控關(guān)鍵因素之四:檢測(cè)方法LDT的概念LDT:laboratorydevelopedtest實(shí)驗(yàn)室建立檢測(cè)項(xiàng)目驗(yàn)證流程：隨機(jī)樣本、雙盲、重復(fù)樣本、標(biāo)準(zhǔn)流程；敏感性：同一樣本稀釋特異性：重復(fù)性：同一實(shí)驗(yàn)人重復(fù)：不同實(shí)驗(yàn)人重復(fù)：實(shí)驗(yàn)重復(fù)性：特殊情況處理：特殊突變的驗(yàn)證；實(shí)驗(yàn)室污染：

數(shù)據(jù)分析和報(bào)告內(nèi)容基因檢測(cè)報(bào)告患者基本信息基因檢測(cè)結(jié)果和結(jié)論檢測(cè)方法和試劑被檢標(biāo)本的基本病理學(xué)狀態(tài)；標(biāo)本種類；腫瘤細(xì)胞數(shù)量；腫瘤細(xì)胞數(shù)所占比例等DNA的質(zhì)控結(jié)果由病理醫(yī)生簽發(fā)！28282016年P(guān)QCC（中國(guó)）質(zhì)控項(xiàng)目

2015年EMQN（全球）質(zhì)控項(xiàng)目國(guó)內(nèi)EGFR突變檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀DatafromPQCCandEMQN(2015)目前，國(guó)內(nèi)突變檢測(cè)方法主要以ARMS法為主，占比93.9%；ARMS法比例較去年明顯增高，此外二代測(cè)序的出現(xiàn)及一代測(cè)序占比的減少都說(shuō)明臨床對(duì)高敏感度檢測(cè)方法需求的提升；29如何選擇不同類型的檢測(cè)平臺(tái)(以T790M檢測(cè)為例)1stARMS2ndARMSddPCRNGS檢測(cè)下限1%0.2%0.01%-0.03%<5%敏感性29%41%71%64%特異性100%100%83%67%豐度定量--++結(jié)果周期1-2天1-2天1-2天7-14