染色體標(biāo)本的制備及組型觀察實(shí)驗(yàn)報(bào)告

細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)報(bào)告染色體標(biāo)本的制備及組型觀看試驗(yàn)?zāi)康模喊盐杖旧w標(biāo)本制作的根本方法；生疏不同生物的染色體的狀態(tài)，學(xué)會(huì)做染色體組型圖。試驗(yàn)用品：〔1〕 儀器及器材：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、手術(shù)剪、解剖盤、膠頭滴管、離心管、離心機(jī)、小燒杯、冰箱、酒精燈、小燒杯試驗(yàn)藥品：蒸餾水、0.9%NaCl溶液、0.3%KCl溶液，固定液〔甲醇：冰醋酸=3:1試驗(yàn)材料：小鼠試驗(yàn)原理：〔1〕制作染色體標(biāo)本的意義：理解染色體的特征〔形態(tài)、大小、數(shù)目〕——繪制染色體組型圖染色體組型：把真核動(dòng)物一個(gè)體細(xì)胞各染色體按長度、外形、著絲粒位置排列成一定挨次。染色體核型：某一物種特有的一組或一套染色體的形態(tài)特征?！?〕染色體組型圖的應(yīng)用〔1〕制作染色體標(biāo)本的意義：理解染色體的特征〔形態(tài)、大小、數(shù)目〕——繪制染色體組型圖染色體組型：把真核動(dòng)物一個(gè)體細(xì)胞各染色體按長度、外形、著絲粒位置排列成一定挨次。染色體核型：某一物種特有的一組或一套染色體的形態(tài)特征?！?〕染色體組型圖的應(yīng)用44404278387864②遺傳病的診斷和爭論：三體綜合征〔含三條2145條染色體，比正常人缺少一條性染色體〕、睪丸退化癥〔含47條染色體，比正常人多一條XY因此，我們可以給孕婦抽取羊水檢查器胎兒的染色體，做遺傳病早期診斷?！?〕染色體標(biāo)本的制作①觀看：由于分裂期中期的染色體染色體凝集程度最高，因此我們應(yīng)盡量使細(xì)胞停留在分裂期中期以便觀看。②細(xì)胞：為盡量看到多的染色體，我們應(yīng)中選取具有旺盛分裂才能的細(xì)胞，這樣的細(xì)胞可以來自:胸腺、骨髓、睪丸、小腸等。我們在此試驗(yàn)中使用的是小鼠的精巢細(xì)胞。在做人的染色體標(biāo)本時(shí)，我們使用的是血液里的淋巴細(xì)胞。③藥物：PHA〔植物細(xì)胞凝集素〕：PHAPHA液中的淋巴細(xì)胞復(fù)原至淋巴母細(xì)胞〔只存在于骨髓中〕秋水仙素：秋水仙素可以破壞微管的組裝，紡錘體不能形成，細(xì)胞分裂停在中秋水仙素：秋水仙素可以破壞微管的組裝，紡錘體不能形成，細(xì)胞分裂停在中期。與秋水仙素作用一樣的藥物還有長春花堿、鬼臼素、苯環(huán)己烯等?？梢源龠M(jìn)胃管組裝的藥物有紫杉酚、重水等。④空氣枯燥：使細(xì)胞與染色體易于別離⑤低滲作用：水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)容空間變大，染色體間隔變大，易于別離、展平。⑥固定：Camoy’ssolution,使組蛋白變性〔變硬〕，維持染色體原有形態(tài)〔4〕描繪染色體的四個(gè)參數(shù)①相對長度=〔每條染色體的長度〕/〔單倍常染色體之和+X*100相對長度可以用來表示每條染色體的長度④空氣枯燥：使細(xì)胞與染色體易于別離⑤低滲作用：水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)容空間變大，染色體間隔變大，易于別離、展平。⑥固定：Camoy’ssolution,使組蛋白變性〔變硬〕，維持染色體原有形態(tài)〔4〕描繪染色體的四個(gè)參數(shù)①相對長度=〔每條染色體的長度〕/〔單倍常染色體之和+X*100相對長度可以用來表示每條染色體的長度②臂指數(shù)=〔長臂的長度〕/(短臂的長度)臂指數(shù)可以用來確定臂的長度為了更準(zhǔn)確的區(qū)分亞中部和亞端部著絲粒染色體1964Levan1.0-1.7M〕；1.7-3.0亞中部著絲粒染色體〔SM〕；3.0-7.0之間，為亞端部著絲粒染色體〔ST〕；7.0T〕③著絲粒指數(shù)=〔斷臂長度〕/〔染色體全長〕*100著絲粒指數(shù)可以打算著絲粒的相對位置Levan50.0-37.5M；37.5-25.0SM；25.0-12.5之間，為ST；12.5-0.0之間，為T④染色體臂數(shù)〔NF〕，依據(jù)著絲粒的位置來確定端著絲粒染色體〔T〕，NF=1中部，亞中部，亞端部著絲粒染色體〔M,SM,ST〕,NF=2〔5〕2040數(shù)其次期分裂時(shí)期。試驗(yàn)步驟：取雄性小鼠，以每克體重4微克注射秋水仙素〔約1mL14-16h后，用斷頭法處死小鼠，取出睪丸用生理鹽水〔0.9%NaCl剖盤中。1mL0.3%KCl0.3%KCl4mL。37℃30mins，低滲處理。800-1000r/min8棄上清液，參與2mL甲醇·冰醋酸固定液。用吸管吹氣，輕輕打散細(xì)胞，8mins。800-1000r/min8棄上清液，參與1mL甲醇·冰醋酸固定液制成細(xì)胞懸液，固定5mins。10-15cm2-3滴細(xì)胞懸液，從一邊輕輕吹氣，并隨時(shí)輕小扣打，以使細(xì)胞均勻分布和促使染色體開放。用濾紙擦去載片上的多余液體，空氣枯燥或文火枯燥，染色30-35mins。呈V字形，視野中也可見大量精子，處于分裂期但不是分裂中期的細(xì)胞。10*40顯微鏡下觀看：一般細(xì)胞40精子 精子中，中期染色體20條分析與爭論結(jié)果分析：本試驗(yàn)承受的是小鼠的精巢，所以視野中可見大量的精子，它們有一個(gè)比較圓的頭部和鞭毛，有局部細(xì)胞在進(jìn)展減數(shù)第一次分裂的中期，這樣的細(xì)胞是二倍體，可觀看到40條染色體，有些在進(jìn)展減數(shù)其次次分裂中期，這樣的細(xì)胞是單倍體，應(yīng)有20條染色體。還有一些細(xì)胞處于細(xì)胞分裂期，但不是中期，可以觀看到凝集程度不是很好的染色體。但是，試驗(yàn)中沒有得到完全開放好的染色體，染色體大多呈棒狀而不是V字形，這說明在對染色體展平的步驟沒有做好，以后應(yīng)改進(jìn)。本卷須知①注射秋水仙素：應(yīng)選擇腹腔注射，假設(shè)觀看到小鼠被注射后皮膚隆起，那么說明注射到皮下，應(yīng)重注射；假設(shè)在拔出針時(shí)觀看到有血珠溢出，那么是由于注射時(shí)損傷了局部器官或血管，秋水仙素會(huì)隨血液傳遞到全身，其傳遞速度會(huì)加快，其死亡時(shí)間可能小于15-16h，應(yīng)隨時(shí)觀看小鼠，以防其突然死亡。即使注射到小鼠的腹腔中，也很有可能注射到起脂肪組織中，使小鼠的死亡時(shí)間變慢。因此應(yīng)依據(jù)具體試驗(yàn)，適當(dāng)調(diào)整注射時(shí)間和等待時(shí)間。②處死小鼠：最好選擇在小鼠將要死亡時(shí)處死小鼠，由于此時(shí)，秋水仙素的作用發(fā)揮到最大，分裂期中期的細(xì)胞最多；假設(shè)等小鼠死亡后處死小鼠，小鼠尸體可能已僵硬，難以取到精巢。1mL0.3%KCl很難剪到組織，比較鋪張時(shí)間。④銅網(wǎng)過濾：應(yīng)把組織盡量剪碎后再用銅網(wǎng)過濾；假設(shè)燒杯中仍有較大顆粒，那0.3%KCl溶液，連續(xù)剪；0.3%KCl溶液將其沖入燒杯，再進(jìn)展剪碎。⑤試驗(yàn)步驟中的〔430mins5〕中的離心配尋常間，因此，真正的靜置時(shí)間應(yīng)少于30mins，細(xì)胞與0.3%KCl接觸的總時(shí)間應(yīng)為45mins左右。另外，由于是在冬季做試驗(yàn)，我們可適當(dāng)延長低滲時(shí)間。假設(shè)在最終的鏡檢時(shí)，觀看到細(xì)胞呈圓形，比較膨脹，即證明低滲這一步驟的成功。反之，假設(shè)低滲不成功，那么細(xì)胞會(huì)比較癟，且這樣的細(xì)胞很難摔碎。⑥離心：離心的轉(zhuǎn)速是800-1000r/min，這樣低的轉(zhuǎn)速是為了防止細(xì)胞裂開。⑦再次離心和固定：這樣做是由于第一次離心之前細(xì)胞經(jīng)過了低滲處理，雖然抽去了上清液，但是不行能抽干凈，因此，再次離心保證細(xì)胞分開低滲環(huán)境。⑧吹散細(xì)胞：應(yīng)當(dāng)輕輕地吹細(xì)胞，假設(shè)太用力會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞裂開。⑨摔碎細(xì)胞：摔碎細(xì)胞時(shí)應(yīng)留意滴管與載玻片的間隔，假設(shè)間隔太小，那么細(xì)胞很難摔碎，不會(huì)觀看到染色體；但假設(shè)間隔太大，會(huì)使細(xì)胞完全的碎開，染色體布滿視野，雖然觀看到染色體，但不能明確分出哪些是同一個(gè)細(xì)胞的，會(huì)給計(jì)數(shù)造成肯定的難度。⑩實(shí)際操作覺察，細(xì)胞很難摔碎，這可以歸結(jié)為多方面緣由。首先，假設(shè)在剪碎組織時(shí)沒有剪好，那么會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞勻漿中含有大量細(xì)胞團(tuán)，由于這些細(xì)胞聚攏在一起，就有肯定的組織強(qiáng)度，十幾厘米的高度很難摔碎，因此，這一步驟格外關(guān)鍵。然后，假設(shè)低滲不完全，細(xì)胞可能膨脹程度不夠，很難摔碎。再次，假設(shè)混勻細(xì)胞時(shí)沒有完全混勻，那么會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞聚攏在一起，敲細(xì)胞時(shí)很難敲碎，同樣觀看不到抱負(fù)的效果；假設(shè)吹得太用力，那么會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞被吹碎，視野中有大量細(xì)胞碎片，影響觀看。固然，假設(shè)摔細(xì)胞時(shí)高度不夠，細(xì)胞不行能被摔碎。染色：染色之后應(yīng)沖去染液并晾干，留意使用小水流并從反面沖洗，這樣可以防止沖去細(xì)胞。染色體疾?。喝旧w數(shù)目或構(gòu)造特別引起的疾病稱為染色體病〔chromosomaldisorder胎兒。少數(shù)即使能存活到誕生，也往往表現(xiàn)有生長、智力或性發(fā)育特別和先天性多發(fā)畸形。預(yù)防。染色體病表型的輕重程度主要取決于染色體上所累及基因的數(shù)量和功能。即雙親染色體正常，畸變?nèi)旧w來自雙親生殖細(xì)胞或受精卵早期卵裂發(fā)生的染色體畸變，不平衡而致病，這類患者常伴有家族史。5p-1/50000，在智能低兒中約占1%～％，在小兒染色體病中占％，器官性或功能性病變引起呼氣時(shí)喉部漏氣所致〔表14-75DAN5p15為本病5p158010發(fā)生的，呈散發(fā)性；但約10%～15％患者為攜帶者的子代。13三體綜合征：生兒中的發(fā)病率約為1/25000，女性明顯多于男性。發(fā)病率與母親年齡增大有關(guān)?；颊叩幕伪壬鲜鰞煞N綜合征嚴(yán)峻〔表14-799％以上的胎兒流產(chǎn)，誕生后45％患兒在1個(gè)月內(nèi)死亡，90％在6個(gè)月內(nèi)死亡。80％的病例為游離型13三體，即47，+13；13易位型，從13q14q為多見，約占易位型的58％，13q13q占38％，13q15q占4％；易位可以是2％；假設(shè)雙親之一為13q13q易位攜帶者，也由于只能產(chǎn)生三體或單體的合子，流產(chǎn)率可達(dá)100％，故不宜妊娠，應(yīng)絕育。少數(shù)病例為與正常細(xì)胞并存的嵌合型，即46/47，+13，一般體征較輕。181/3500～1/8000達(dá)1/450～800。男女性別比為1:4，可能女性易存活?；颊邔m內(nèi)生長緩