基因工程原理與技術植物基因工程

基因工程原理與技術植物基因工程第1頁/共51頁第2頁/共51頁第一節(jié)農桿菌及其轉化體系一、根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciences)的生物學特征1、形態(tài)細胞呈桿狀，大小為0.8um×1.5~3.0um，1~4根周生鞭毛，菌落無色、光滑。2、生長條件最適溫度：25~30℃，28℃培養(yǎng)；最適pH：6.0~9.03、宿主植物雙子葉植物、裸子植物4、侵染宿主的癥狀及原因

冠癭瘤，Ti質粒(tumorinducingplasmid)的T-DNA。

T-DNA是指農桿菌質粒上一段能轉移并整合到植物染色體上的DNA片段。

第3頁/共51頁二、Ti質粒的結構和功能1、Ti質粒的類型與分區(qū)

環(huán)狀雙鏈DNA分子，140~235

kb。

根據其誘導植物細胞產生冠癭堿的種類，分為章魚堿型、胭脂堿型、農桿堿型、農桿菌素堿型(琥珀堿型)。

功能區(qū)毒性區(qū)(Vir區(qū))T-DNA區(qū)

接合轉移區(qū)

復制起始區(qū)

章魚堿型第4頁/共51頁2、T-DNA的結構與功能邊界序列：25bp，TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC

右邊界序列是完全保守的，對T-DNA轉移是必須的。T-DNA的編碼基因第5頁/共51頁3、Vir區(qū)的結構與功能

30~40kb，有virA~virM等操縱子。

virA操縱子：組成型，長約為2.8kb，virA基因。VirA蛋白(92kD)是內膜受體蛋白，感應并結合酚類化合物(乙酰丁香酮，AS)，是一種自激酶并使VirG蛋白磷酸化而被激活。

virG操縱子：組成型，1.0kb，virG基因。VirG蛋白(30kD)為轉錄激活因子，誘導其他vir基因的表達。

virB操縱子：誘導型，virB1~virB11基因。VirB蛋白構成跨膜復合體(T-鏈復合體運輸器)供T-DNA越膜轉移。

virC操縱子：誘導型，virC1、virC2基因。VirC1蛋白與超驅動序列(離右邊界外側17bp處的一個24bp的保守序列)結合，促進T-DNA加工。

第6頁/共51頁

virD操縱子：誘導型，virD1~virD4基因。

VirD1(16kD)、VirD2(47kD)蛋白參與T-DNA加工形成T-鏈：首先VirD1與25bp邊界序列親和結合，使其松弛，然后使VirD2在特異位點剪切。VirD2與T-鏈的5’端共價結合，并核定位信號，將T-鏈復合體導向細胞核。

virE操縱子：誘導型，virE1、virE2基因。VirE2蛋白(60.5kD)是ssDNA結合蛋白，與T-鏈結合，參與T-鏈復合體形成，還具有核定位信號，引導T-鏈復合體進入植物細胞核。

virF操縱子：誘導型，virF基因。

VirF蛋白(23kD)參與T-鏈復合體的運輸。

virH操縱子：誘導型，virH1、virH2基因。VirH蛋白功能是降解植物傷口細胞產生的殺菌物質。

第7頁/共51頁三、T-DNA轉移至植物細胞的機理(農桿菌介導轉化的機理)

①植物創(chuàng)傷反應與農桿菌對植物細胞的識別和附著；②信號分子的釋放積累與VirA蛋白的感應；

③VirG蛋白激活與vir基因的誘導表達；

④T-鏈復合體的形成；

T-鏈是指vir基因被誘導表達后加工T-DNA而產生的單鏈T-DNA。

T-鏈復合體是指結合了VirD2、VirE2蛋白的T-鏈。⑤T-鏈復合體的跨膜轉運；通過T-鏈復合體運輸器和T菌毛進入植物細胞。

⑥T-DNA整合到植物染色體上。

第8頁/共51頁第9頁/共51頁四、Ti質粒的改造與轉化載體系統(tǒng)的構建

野生型Ti質粒不能直接作為植物轉化載體：①Ti質粒分子過大，沒有單一的限制性內切酶位點，基因操作困難，不能直接將外源基因插入其T-DNA中；

②T-DNA區(qū)的onc基因產物將干擾受體植物內源激素的平衡，導致冠癭瘤的產生，阻礙細胞的分化和植株的再生；現(xiàn)已通過中間載體途徑構建許多植物轉化載體系統(tǒng)，主要有共整合載體系統(tǒng)、雙元載體系統(tǒng)、隔端載體系統(tǒng)。1、共整合載體系統(tǒng)(cointegratevectorsystem)

由卸甲Ti質粒載體、中間表達載體組成。例如：pGV3850、pLGVneo1103

第10頁/共51頁Ampr第11頁/共51頁pLGVneo1103Cointegrateplasmid第12頁/共51頁2、雙元載體系統(tǒng)(binaryvectorsystem)

由微型質粒、輔助Ti質粒組成。例如：Bin19、pAL4404

雙元載體系統(tǒng)比共整合載體系統(tǒng)更優(yōu)越：①插入外源基因的操作較簡單；②轉化效率較高。lacZ’第13頁/共51頁3、隔端載體系統(tǒng)與共整合載體系統(tǒng)一樣，由卸甲Ti質粒載體和中間表達載體通過同源重組共整合成轉化載體，但與基因轉移相關的T-DNA左右邊界序列分別位于兩個載體上。

共整合載體系統(tǒng)和隔端載體系統(tǒng)統(tǒng)稱為一元載體系統(tǒng)或順式載體系統(tǒng)。

雙元載體系統(tǒng)也稱為反式載體系統(tǒng)。第14頁/共51頁五、Ri質粒載體系統(tǒng)

發(fā)根農桿菌(Agrobacterium

rhiizogenes)Ri質粒分為農桿堿型、甘露堿型、黃瓜堿型

Ri質粒的Vir區(qū)與Ti質粒的高度同源，T-DNA區(qū)的邊界序列與Ti質粒的高度同源，只含有編碼與生長素合成有關的酶(iaaM和iaaH)和與冠癭堿合成有關的酶，不具細胞分裂素合成相關的基因。

共整合載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)Ri質粒載體系統(tǒng)第15頁/共51頁第二節(jié)目的基因的導入植物一、植物轉化受體系統(tǒng)及其考慮因素建立一個高效再生體系是植物遺傳轉化的關鍵。1、植物轉化受體系統(tǒng)

植物轉化受體系統(tǒng)是指用于植物遺傳轉化的再生體系或繁殖體系。

植物轉化的受體系統(tǒng)愈傷組織受體系統(tǒng)

原生質體受體系統(tǒng)

胚狀體受體系統(tǒng)

直接分化受體系統(tǒng)生殖細胞受體系統(tǒng)

第16頁/共51頁2、建立植物轉化受體系統(tǒng)的主要考慮因素①具有穩(wěn)定的外植體來源；

②具有高效穩(wěn)定的再生能力；

③具有較好的遺傳穩(wěn)定性；

④對選擇性抗生素敏感。二、植物基因轉移的方法1、農桿菌介導法

一般程序：制備工程農桿菌侵染液→農桿菌侵染外植體→共培養(yǎng)→篩選與分化培養(yǎng)→獲得抗性植株→分子檢測→轉基因植株

第17頁/共51頁1、工程農桿菌的制備把構建好的中間載體導入到農桿菌的方法：①三親交配法

含有中間載體質粒的大腸桿菌、含有遷移質粒的大腸桿菌、含有Ti質粒的農桿菌

②直接轉化法如電擊法、液氮冷凍法。效率低，但簡單、快速。2、農桿菌轉化植物的操作方法①整株感染法創(chuàng)傷整株感染法、非創(chuàng)傷整株感染法

優(yōu)點：免去了組織培養(yǎng)過程，操作簡單。

②外植體轉化法如：葉盤轉化法、子葉柄轉化法、原生質體轉化法

第18頁/共51頁葉盤轉化法第19頁/共51頁2、基因槍法(微彈轟擊法、粒子轟擊法)

①原理利用火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作驅動力，將載有外源DNA的金粉(鎢粉)等金屬微粒加速射入受體細胞，從而將外源DNA分子導入細胞并實現(xiàn)轉化。

第20頁/共51頁②基因槍的類型

火藥爆炸基因槍(1987年

Sanfrod等)：污染、可控性低

高壓氣體基因槍(杜邦公司的PDS-1000HE型)：無污染、可控性較高

高壓放電基因槍：無污染，可控性最高第21頁/共51頁

③操作步驟

a、受體細胞或組織的預處理；高滲(甘露醇、山梨醇)培養(yǎng)

b、DNA微彈的制備；

鎢粉微粒的直徑一般為0.7~1um，金粉微粒的直徑一般為1~1.6um。金粉對細胞的傷害、毒性小，但較貴。

c、受體材料的轟擊；根據基因槍操作說明選擇適當大小外植體、裝配DNA微彈等。無菌操作

d、過渡培養(yǎng)與篩選培養(yǎng)過渡培養(yǎng)：無選擇、高滲培養(yǎng)，1~2周

第22頁/共51頁3、花粉管通道法

花粉管通道法是利用植物受精過程中形成的花粉管通道將外源DNA導入植物的技術。

1983年周光宇等提出并建立。①原理授粉一定時間后，將外源DNA加在柱頭上，外源DNA能沿著花粉管通道滲入，經過珠心進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞。②操作方法

a、柱頭切除法；b、柱頭涂抹法；c、花粉粒攜帶法。

③優(yōu)點操作簡單、無需組織培養(yǎng)、避免了組培中無性變異帶來的優(yōu)良農藝性狀喪失。但受植物花器、花期的限制。

第23頁/共51頁4、聚乙二醇法(PEG法)

①原理

PEG可通過改變細胞膜表面的電荷，引起細胞膜透性變化，并促進DNA與膜接觸、粘連，同時Ca2+離子與DNA結合成DNA-磷酸鈣復合物而沉積于原生質體的膜表面，從而促進外源大分子進入原生質體。

②優(yōu)點

a、實驗成本低廉，不需要特殊的儀器設備；

b、受體植物不受種類的限制；

c、嵌合體很少；

d、結果比較穩(wěn)定，重復性也較好；

e、轉化效率較高，可達10-3。

第24頁/共51頁5、電擊法優(yōu)點：操作簡便、不需制備原生質體、轉化效率較高、無受體限制。6、顯微注射法顯微注射法是利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體細胞而實現(xiàn)轉化的方法。固定受體細胞的方法：瓊脂糖包埋法、多聚-L-賴氨酸粘連法、吸管支持法。優(yōu)點：轉化效率高、不受植物種類的限制缺點：工作效率低、不能規(guī)?；D化、需要昂貴儀器

第25頁/共51頁7、浸漬法(浸泡法)

浸漬法是指將葉子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、懸浮細胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用滲透作用把外源基因導入受體細胞并得到整合與表達的一種轉化方法。

優(yōu)點：簡單、快速、便宜、可規(guī)?；D化

缺點：轉化頻率低、重復性差8、其他轉化方法：超聲波導入法、激光微束法、碳化硅纖維法、脂質體介導法、病毒介導法、轉座子介導法

第26頁/共51頁常用植物轉化方法比較評價內容植物轉化方法農桿菌法PEG法電擊法微注射法基因槍法花粉管通道法受體材料外植體原生質體懸浮細胞細胞或組織外植體卵細胞宿主限制有無無無無開花植物培養(yǎng)條件簡單復雜復雜復雜簡單無轉化頻率10-2~10-110-5~10-410-5~10-410-2~10-110-3~10-210-1~101嵌合體有無無無或有多無操作簡單簡單復雜更復雜復雜簡單設備要求便宜便宜昂貴昂貴昂貴簡便工作效率高低低更低高低第27頁/共51頁第三節(jié)外源基因的表達、檢測與遺傳特性一、轉基因植物的外源基因表達及其調控

轉基因沉默是指轉入植物的外源基因不表達或表達水平很低的現(xiàn)象。1、轉基因沉默的原因及其克服措施分為轉錄沉默、轉錄后沉默，或分為同源依賴性沉默、位置依賴性沉默。同源依賴性沉默是由于轉基因出現(xiàn)多拷貝而發(fā)生轉基因之間或轉基因與內源基因之間相互作用而誘發(fā)的轉基因沉默。

位置依賴性轉基因沉默是指由于轉基因整合到宿主基因組的一定位置而引起的轉基因失活。

第28頁/共51頁①DNA甲基化常發(fā)生在外源基因的啟動子區(qū)，是轉錄沉默或位置依賴性轉基因沉默的直接誘因。

導致外源基因失活的機制：

a、甲基化序列與甲基化DNA結合蛋白結合，后者再與協(xié)同抑制蛋白mSin3A、組蛋白去乙酰酶等形成多蛋白抑制復合物，阻礙了轉基因啟動子與轉錄因子的接觸，從而引起轉錄抑制。

b、甲基化導致DNA構象轉變?yōu)閆型，從而降低轉錄水平，造成轉基因失活。

第29頁/共51頁②多拷貝整合

重復誘導的轉基因沉默是指外源基因多拷貝整合而引起轉基因表達水平降低或失活的現(xiàn)象。

順式失活是指相互串聯(lián)或緊密連鎖的轉基因間產生的失活。

反式失活是指非同一染色體上轉基因間引起的失活。導致外源基因失活的機制：

a、轉基因間異位配對，形成三鏈或四鏈結構，導致染色體異染色質化，阻礙了轉錄因子與轉基因啟動子的結合，從而使轉錄受到抑制；

b、轉基因mRNA的特異降解(空載tRNA觸發(fā)機制、反義RNA觸發(fā)機制)。

第30頁/共51頁③位置效應

a、外源基因整合在異染色質區(qū)和轉錄不活躍區(qū)域(占植物基因組90%)；

b、外源基因整合在非等容線位點，被宿主的特定識別機制識別而被甲基化，導致轉基因沉默。④后成修飾作用

后成修飾作用是指轉基因的表達在個體發(fā)育的某一階段受到細胞內因子的修飾作用而關閉。⑤與內源基因競爭性結合某些轉錄、翻譯因子

克服轉基因沉默的措施：

a、單拷貝插入；b、建立位點特異整合的轉基因體系；c、采用非甲基化啟動子；d、外源基因的密碼子優(yōu)化；e、將核基質結合區(qū)序列置于外源基因兩側，使其成為一個獨立的表達結構；f、篩選穩(wěn)定表達的轉基因植株。

第31頁/共51頁2、提高外源基因表達水平的策略

①啟動子的選擇和改造；組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子人工雜合啟動子

②利用增強子序列；

③利用真核基因的翻譯調控序列；如：5’端Ω因子、kozak序列、3’端poly(A)信號序列、內含子等

④利用定位信號序列；如：內質網定位信號KDEL的編碼序列

⑤葉綠體轉化。

a、葉綠體DNA拷貝數(shù)多；b、具原核表達方式，可直接表達來自原核生物的基因；c、能以多順反子的形式表達多個基因。

第32頁/共51頁二、外源基因表達的檢測

Northern雜交、RT-PCR、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、Western雜交、報告基因檢測法。1、gus基因的檢測底物：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)

組織化學法、分光光度法、熒光法2、NPT-II基因的檢測底物：[γ-32P]ATP

凝膠原位檢測法、點漬法、層析法3、熒光素酶基因的檢測底物：熒光素熒光分光光度法、熒光顯微鏡法

第33頁/共51頁4、胭脂堿和章魚堿的檢測紙電泳分析法菲醌(熒光染料)染色5、cat基因的檢測底物：乙酰CoA、氯霉素分光光度計法6、pat基因的檢測

PPT乙酰轉移酶底物：乙酰CoA、PPT

分光光度計法第34頁/共51頁三、外源基因的遺傳特性1、外源基因的遺傳穩(wěn)定性一旦外源基因整合，就隨植物基因組而穩(wěn)定遺傳。但也會發(fā)生外源基因丟失。其原因是：①轉基因植株是嵌合體；②減數(shù)分裂同源染色體對等交換；③有絲分裂的同源重組和基因重排；④外源基因整合在細胞器基因組中，在隨后的細胞質分裂中丟失。2、外源基因的遺傳規(guī)律孟德爾式遺傳單拷貝整合多拷貝整合第35頁/共51頁第四節(jié)植物基因工程的應用一、植物基因工程在植物分子生物學研究中的應用1、轉座子標簽法玉米的Ac/Ds、En/Spm和金魚草的Tam轉座子系統(tǒng)

Ds農桿菌介導轉化Ac轉Ac植株轉Ds植株Ac/Ds植株從F2代篩選Ds插入目標突變植株自交突變植株基因組文庫突變基因克隆以Ds制備探針篩選文庫野生型植株基因組文庫以突變基因制備探針篩選文庫目標基因第36頁/共51頁2、T-DNA標簽法

野生型植株T-DNA插入突變植株農桿菌轉化突變植株基因組文庫以T-DNA制備探針篩選文庫突變基因克隆野生型植株基因組文庫以突變基因制備探針篩選文庫目標基因第37頁/共51頁3、反義RNA技術

反義RNA技術是指將某反義基因轉入植物而抑制其相應內源基因表達的技術。

原理：反義RNA與內源目標RNA互補結合形成穩(wěn)定的雙鏈，從而影響RNA加工和翻譯，導致基因表達被抑制。轉查爾酮合成酶反義基因的矮牽牛，開白色花。4、位點特異性重組技術

Cre/loxP位點特異重組系統(tǒng)應用：①刪除轉基因植株的選擇標記NPTII目的基因引入Cre酶(與cre植株雜交)目的基因第38頁/共51頁②基因敲除③轉基因的活化(與特異表達Cre酶的轉基因植株雜交)第39頁/共51頁二、改良植物品種基因工程育種的優(yōu)勢：①目的性強；②育種周期短；③打破物種界限，擴大育種基因資源庫。1、抗蟲轉基因植物

Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因(豇豆胰蛋白酶抑制劑)、淀粉酶抑制劑基因(菜豆淀粉酶抑制劑基因)、植物凝集素基因(雪蓮花凝集素基因)、昆蟲特異性神經毒素基因

防止或延緩害蟲產生耐受性的方法：①采用特異性的啟動子，使目的基因在適當?shù)臅r間和特定的組織進行表達；②在同一植物中轉入兩種以上抗蟲基因；③在種植模式上控制昆蟲的抗性。

第40頁/共51頁2、抗病轉基因植物

①抗病毒病轉基因植物

病毒外殼蛋白基因、病毒衛(wèi)星RNA、病毒復制酶突變基因、病毒反義RNA基因

②抗真菌病轉基因植物

幾丁質酶基因、葡聚糖酶基因、核糖體失活蛋白基因、PR基因、植物抗真菌蛋白基因③抗細菌病轉基因植物溶菌酶基因、抗菌肽基因、植物抗病基因(Xa21)

第41頁/共51頁3、抗除草劑轉基因植物抗除草劑基因工程的策略：①過量表達靶標酶或靶標蛋白質，使作物吸收除草劑后，仍能進行正常代謝作用；②導入除草劑不敏感靶標酶或蛋白的突變基因；③產生能修飾除草劑的酶，使除草劑降解或解毒。

除草劑

機理

靶標酶或蛋白

基因草丁膦(PPT)谷氨酰胺合成谷氨酰胺合成酶bar

或pat草甘膦芳香氨基酸合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP)aroA(細菌EPSP突變基因)磺酰脲支鏈氨基酸合成乙酰乳酸酶(ALS)植物ALS突變基因阿特拉津光合系統(tǒng)IIQB蛋白QB蛋白突變基因溴笨腈光合作用?腈水解酶基因第42頁/共51頁4、抗逆境轉基因植物

①導入抗?jié)B透脅迫相關基因甘露醇、果聚糖、甜菜堿、海藻糖、脯氨酸等小分子的合成酶基因

②導入抗凍蛋白基因

③導入胚胎發(fā)育后期豐富蛋白(LEA)基因

LEA蛋白表面有豐富帶電基團，可中和因脫水而增加的離子，因此，LEA蛋白的積累與植物抗旱性有關。

④導入氧化脅迫相關酶的基因超氧化物歧化酶(SOD)基因、過氧化物酶基因

第43頁/共51頁5、改良營養(yǎng)品質轉基因植物

①導入富含人體必需氨基酸蛋白質的基因巴西豆2S清蛋白基因②導入淀粉合成相關酶的基因

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因③導入脂肪酸合成相關酶的基因月桂酰載體蛋白基因④導入提高維生素和礦物質含量的相關基因轉鐵蛋白基因水稻轉植酸酶基因水稻(增加腸道吸收鐵)

轉八羥番茄素合酶基因水稻(β-胡蘿卜素)

第44頁/共51頁6、轉基因“工