氨基酸缺陷性實(shí)驗(yàn)方案

2010級(jí)生物技術(shù)曹學(xué)敏學(xué)號(hào)：2010445007 2組氨基酸營養(yǎng)缺陷型的篩選及鑒定實(shí)驗(yàn)方案一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諏?xì)菌進(jìn)行誘變處理的方法以及對突變體檢出、鑒定和獲得營養(yǎng)缺陷型的方法二、 實(shí)驗(yàn)材料（一） 菌種芽孢桿菌（二） 培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基（CM）：葡萄糖0.5g牛肉膏0.3g酵母膏0.3g蛋白胨1gMgSO4.7H2O0.2g瓊脂2g蒸餾水100mLpH7.2100Pa滅菌20min?；九囵B(yǎng)基：（MM）葡萄糖0.5g（NH4）2SO40.2g檸檬酸鈉0.1gMgSO4?7H2O0.02gK2HPO40.4g0.6g蒸餾水100mLpH7.2100Pa滅菌20min（二）主要藥品：葡萄糖牛肉膏酵母膏蛋白胨MgSO4.7H2O（NH4）2SO4檸檬酸鈉K2HPO4KH2PO4亞硝基胍甲酰胺磷酸青霉素20種氨基酸（鳥氨酸苯丙氨酸谷氨酸甘氨酸組氨酸亮氨酸酪氨酸絲氨酸半胱氨酸異亮氨酸色氨酸丙氨酸蛋氨酸精氨酸蘇氨酸天冬氨酸胱氨酸賴氨酸脯氨酸纈氨酸）（四） 主要試劑：蒸餾水0.2mol/LpH6.0磷酸緩沖液生理鹽水：0.9g氯化鈉溶于100mL蒸餾水（五） 器材及儀器：pH試紙黑紙吸水紙酒精燈接種環(huán)試管250ml錐形瓶、100ml錐形瓶培養(yǎng)皿試管移液管10ml離心管玻璃棒玻璃珠玻璃刮滅菌牙簽培養(yǎng)箱搖床離心機(jī)分析天平恒溫水浴鍋三、 實(shí)驗(yàn)步驟（一） 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備按配方配制培養(yǎng)基（配制200mL基本培養(yǎng)基、100mL完全培養(yǎng)基、100mL完全培養(yǎng)液和50mL基本培養(yǎng)液）和實(shí)驗(yàn)中所用藥品。取4mL融化完全培養(yǎng)基于試管中，蓋上棉塞；分別取20mL完全培養(yǎng)液于兩個(gè)250mL錐形瓶；然后將剩余的完全培養(yǎng)基與基本培養(yǎng)基放于錐形瓶中高溫滅菌消毒，備用。還需取7支10mL離心管、4支1mL移液管、3支5mL移液管、1支10mL移液管、10個(gè)大培養(yǎng)皿、10個(gè)玻璃刮250mL錐形瓶3個(gè)進(jìn)行高溫滅菌，備用。（二） 誘變處理菌種的活化將保存的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基,37^培養(yǎng)24h,備用⑴。前培養(yǎng)取新活化的芽孢桿菌菌種一環(huán)，接入盛有20mL完全培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中，30°C（有待確定）振蕩培養(yǎng)14~16h，再取1mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于另一盛有20mL完全培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中，30C振蕩培養(yǎng)4?6h，使細(xì)胞處于對數(shù)生長期⑵。突變型的誘導(dǎo)（1）分別稱取0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg亞硝基胍于4支無菌離心管中，再加0.05mL甲酰胺助溶，然后加入0.2mol/LpH6.0磷酸緩沖液1mL,使完全溶解，用黑紙包好在37r水浴中保溫（臨用時(shí)配制）。（2）分別取4mL細(xì)胞懸浮液加入上四只述離心管中，充分混勻，立即置37r水浴振蕩處理30min，離心管中亞硝基胍的最終濃度分別為50ug/mL60ug/mL、70ug/mL、80ug/mL后，3500r/min離心10min收集菌體⑶，將含亞硝基胍的上清液倒入濃氫氧化鈉溶液中棄去，用無菌水洗滌菌體3次，以大量稀釋法終止亞硝基胍的誘變作用。最后向離心管中加5mL無菌水，搖勻后從中取出0.5mL亞硝基胍處理后的菌懸液，用4.5mL完全培養(yǎng)液稀釋至10-3稀釋度，37攝氏度培養(yǎng)3?4小時(shí)，取0.5mL培養(yǎng)液于49.5mL的基本培養(yǎng)基，配成50mL的液體。70u的青霉素，加50mL蒸餾水配成溶液，然后將其與基本培養(yǎng)基混合，最終青霉素的濃度達(dá)到70u/，37攝氏度過夜培養(yǎng)。（3） 取5mL青霉素處理后的培養(yǎng)液，3500r/min離心10min收集菌體，用無菌水洗滌菌體3次。最后向離心管中加5mL無菌水，搖勻后從中取出0.5mL，加入含有20mL完全培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中，37攝氏度培養(yǎng)24小時(shí)。（4） 取5mL上述菌液，3500r/min離心10min收集菌體，用無菌水洗滌菌體3次。最后向離心管中加5mL生理鹽水，搖勻后從中取出0.5mL，用4.5mL生理鹽水稀釋至10-3稀釋度，制成菌懸液。（5） 取一個(gè)無菌培養(yǎng)皿，倒入融化的完全培養(yǎng)基，室溫冷卻凝固，并風(fēng)十因冷卻而在培養(yǎng)基表面形成的小水珠。取上步稀釋獲得的菌液，均勻涂布在培養(yǎng)基的表面，置于37攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)⑷，選擇微小型菌落作進(jìn)一步篩選。（三）突變株的篩選1、 取無菌平皿兩個(gè)，在底面外表用筆劃分若干等份（按培養(yǎng)皿大小分為合適的大?。?，分別編號(hào)為1和2，培養(yǎng)皿1中加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿2中加入基本培養(yǎng)基，室溫凝固。2、 于誘變平皿上選擇微小型菌落，做好標(biāo)記，然后用接種環(huán)挑取單只菌落劃線于平皿1與2的同一位置，接種時(shí)應(yīng)注意先劃線于基本培養(yǎng)基（培養(yǎng)皿2），后劃線于完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)皿1）。3、 將劃好種的兩個(gè)培養(yǎng)皿置于37攝氏度培養(yǎng)48小時(shí)，觀察結(jié)果，如某一菌落，在完全培養(yǎng)基上生長良好，在基本培養(yǎng)基上絲毫不長，則為營養(yǎng)缺陷型。4、 挑取營養(yǎng)缺陷型的菌落接種于新的完全培養(yǎng)基平板中37攝氏度擴(kuò)大培養(yǎng)48小時(shí)。（四）營養(yǎng)缺陷型菌株的鑒定1、 用接種環(huán)挑取培養(yǎng)好的營養(yǎng)缺陷型菌體，于10mL用無菌的生理鹽水制成菌懸液。2、 取1ml待鑒定營養(yǎng)缺陷型菌液，將其均勻涂布于基本培養(yǎng)基（MM）平板表面，用蘸有不同氨基酸混合液（下表，各氨基酸的濃度均為10mg/ml）的9片圓形無菌濾紙（直徑約1cm）覆蓋其上，28攝氏度培養(yǎng)2~3天，觀察濾紙表面有無菌落長出，然后根據(jù)長出菌落的濾紙的不同組號(hào)，結(jié)合表格鑒定出突變株的缺陷型⑸組號(hào)123456鳥氨酸甘氨酸半胱氨酸蛋氨酸胱氨酸7組氨酸亮氨酸異亮氨酸纈氨酸賴氨酸8苯丙氨酸酪氨酸色氨酸蘇氨酸脯氨酸9谷氨酸絲氨酸丙氨酸天冬氨酸精氨酸參考文獻(xiàn)秦艷，李衛(wèi)芬，黃琴.枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化.飼料研究,2007年，第12期:第70頁.氨基酸營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選./experiment/17-2084-1.html蔣金龍，賈建波.亞硝基胍誘變處理氧化亞鐵硫桿菌的育種研究.礦產(chǎn)綜合利用，2005年2月，第1期：21~22頁.盧純惠，林大榕，葉舜