第八講干細胞與iPS技術

LucasCranach,1472-1553第一頁，共72頁。自然界中生物的再生現象將渦蟲切斷后，斷面能夠識別頭部或者尾部的位置，如果切掉的是頭，頭部將在該位置再生；如果切掉的是尾，尾巴將在該位置再生蠑螈的四肢、壁虎的尾巴都具有自然再生的能力青蛙與蠑螈同屬兩棲動物，卻不具備再生的能力，但青蛙的前身蝌蚪卻又顯示出四肢再生的能力。

第二頁，共72頁。第三頁，共72頁。第四頁，共72頁。20世紀初，遺傳學家ThomasMorgan利用渦蟲（flatworm,Planaria）為材料研究過再生問題。研究表明切割下來的組織塊小到渦蟲蟲體的1/279時仍然能夠再生出一條小渦蟲。因此,渦蟲又被譽為“切不死的動物”。他將這個過程稱為變形再生（morphallaxis）。再生組織是由傷口處已分化細胞的去分化衍生而來,還是來源于稱為全能干細胞的neoblasts(未分化細胞),這是一個長期爭論不休的問題。第五頁，共72頁。后來研究發(fā)現，在渦蟲體內有一種散布在全身，好似沒什么功能的非常小的細胞，它們就是干細胞。渦蟲的干細胞能夠轉變成“其他任何種類的細胞”，具有這種性質的細胞在生物學上被稱為“全能干細胞”。第六頁，共72頁。第一節(jié)干細胞

一、干細胞的定義

干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。第七頁，共72頁。二.干細胞特性及分類

干細胞的特性：1，形態(tài)和生化特征:圓形、體積小、核質比例大，端粒酶活性高第八頁，共72頁。

2，干細胞的增殖特點

緩慢性：干細胞的增殖速度一般比較慢。而一旦機體需要時，干細胞就可以進入分化。自穩(wěn)性：會自我更新維持自身數目的恒定。（self-maintenance）干細胞維持自穩(wěn)性的機制：對稱分裂和不對稱分裂

第九頁，共72頁。

干細胞的對稱分裂和不對稱分裂對稱分裂（symmetrydivision）不對稱分裂（asymmetrydivision）干細胞

分化細胞

干細胞

分化細胞第十頁，共72頁。緩慢性干細胞若干次分裂過渡放大細胞是介于干細胞和分化細胞之間的中間態(tài)細胞。它可以起到通過較少的干細胞產生較多的分化細胞的作用。分化細胞過渡放大細胞第十一頁，共72頁。3，干細胞的分化特點

1）.多潛能性2）.去分化和轉分化的能力第十二頁，共72頁。在不同生長因子刺激下干細胞可表現出不同分化潛能第十三頁，共72頁。（內胚層）

胃上皮（中胚層）

骨、軟骨、平滑肌、橫紋?。ㄍ馀邔樱?/p>

神經表皮、神經節(jié)、復層鱗狀上皮人胚胎干細胞具分化的多潛能性

小鼠皮下注射

混合組織瘤人胚胎干細胞第十四頁，共72頁。（1）去分化

一種干細胞向其前體細胞的逆向轉化的過程。（2）轉分化（transdifferentiation）

一種組織類型的干細胞在適當條件下分化為另一種組織類型細胞的過程。

例一：將成年雄性小鼠的造血干細胞移植到雌鼠體內，3天后在雌鼠的神經膠質細胞中檢測到Y染色體的存在，證明成體動物的造血干細胞可轉分化成為神經膠質細胞。2）.去分化和轉分化的能力第十五頁，共72頁。例二：造血干細胞向骨骼肌細胞的轉分化第十六頁，共72頁。（二）干細胞的分離與純化

1.通過干細胞表面的標記分子進行造血干細胞標記物為CD34＋等；神經干細胞的巢素蛋白。2.通過干細胞不同于一般分化細胞的物理特性進行

干細胞不被Hoechst33342和Rhodamine123染色。第十七頁，共72頁。三，干細胞的分類（1）全能干細胞：具有全能性，能夠分化成全身200多種細胞類型，并能進一步形成機體的任何組織和器官。以生殖干細胞（embryonicgermcells,EG細胞）為代表。（2）多能干細胞：具有分化成多種細胞和組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力。以胚胎干細胞（embryonicstemcells,ES細胞）為代表。（3）專能干細胞：只能向一種或密切相關的兩種類型的細胞分化。第十八頁，共72頁。第十九頁，共72頁。第二十頁，共72頁。第二十一頁，共72頁。（一）胚胎干細胞

人體發(fā)生過程：受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子

合子卵裂球桑椹胚囊胚滋養(yǎng)層胎盤及胎兒附屬結構囊胚內胚層消化道、呼吸道上皮和腺體；肝；膽；胰。內細胞群中胚層結締組織；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系統(tǒng)外胚層體表結構；神經系統(tǒng)第二十二頁，共72頁。胚胎干細胞的概念胚胎干細胞（embryonicstemcell,ES細胞）指從著床前的內細胞團或原始生殖細胞獲得的一種具有多潛能性、可發(fā)育成為各種細胞、同時可保持不分化狀態(tài)而持續(xù)生長的克隆細胞系。第二十三頁，共72頁。胚胎干細胞的生物學特性

(1)ES細胞形態(tài)結構與核型：

各種動物的ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形態(tài)結構，細胞體積小、核大、有1個或多個核仁。

第二十四頁，共72頁。

(2)ES細胞的生長特性：對于高等脊椎動物而言，干細胞在機體組織中的居所被稱為干細胞巢第二十五頁，共72頁。

(3)ES細胞高度分化潛能：ES細胞的全能性是區(qū)別于成纖維細胞等體細胞的特點。ES細胞體外生長時應該培養(yǎng)在飼養(yǎng)層細胞上才能維持其未分化狀態(tài)，脫離飼養(yǎng)層就會自發(fā)地進行分化。第二十六頁，共72頁。增殖速度：18－24h分裂增殖一次ES必須在含有白血病抑制因子（LIF）的培養(yǎng)基及成纖維細胞飼養(yǎng)層(提供干細胞生長不可缺少的成纖維細胞生長因子FGF)條件下才能保持繁殖而不分化。

ES體外培養(yǎng)要解決的關鍵問題是維持細胞的分裂增殖而抑止其分化。具有分化形成外、中、內三個胚層的潛能。第二十七頁，共72頁。（三）人胚胎干細胞的來源與鑒定

HumanEmbryonicStemCell

胚胎干細胞的來源為早期胚胎內細胞群或原始生殖細胞。哺乳動物早期胚胎的發(fā)育屬于調整型，每個胚胎細胞都具有全能性。第二十八頁，共72頁。a.取自體外受精胚胎囊胚期內細胞群。

Thomson法1.來源

第二十九頁，共72頁。b.取自終止妊娠的胎兒的性器官組織。

Gearhart法第三十頁，共72頁。c.通過體細胞核轉移技術（克隆技術）獲得第三十一頁，共72頁。2.克隆技術克隆是英文clone的音譯，簡單講就是一種人工誘導的無性繁殖方式。但克隆與無性繁殖是不同的。無性繁殖是指不經過雌雄兩性生殖細胞的結合、只由一個生物體產生后代的生殖方式，常見的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、莖、葉等經過壓條或嫁接等方式產生新個體也叫無性繁殖。綿羊、猴子和牛等動物沒有人工操作是不能進行無性繁殖的?？茖W家把人工遺傳操作動物繁殖的過程叫克隆，這門生物技術叫克隆技術。第三十二頁，共72頁。先前一直認為，高等動物的細胞分化是一個不可逆的過程，因此無法利用已分化的動物細胞進行克隆的。英國劍橋大學的約翰?戈登教授首先通過實驗研究從理論上證明了動物細胞重新編程是完全有可能的，1962年，他通過實驗把青蛙腸上皮的細胞的細胞核移植進入去掉核的卵母細胞質中，并培育出成體青蛙。這一實驗首次證實分化了的細胞基因組是可以逆轉變化的，具有劃時代的意義，并且為動物克隆實驗奠定了基礎，大名鼎鼎的克隆羊多利就是依照戈登所創(chuàng)造的方法被克隆出來的。第三十三頁，共72頁?？寺⊙駾olly的誕生1996年7月5日，位于蘇格蘭愛丁堡市郊的羅斯林研究所里誕生了一頭大個頭兒羊羔，實驗室編號為6LL3，克隆羊項目小組主管伊恩·威爾默特以著名鄉(xiāng)村歌手多利·帕頓的名字命名這頭羊。多利于1997年首次公開亮相，震動整個世界，美國《科學》雜志把多利的誕生評為當年世界十大科技進步的第一項。第三十四頁，共72頁。第三十五頁，共72頁。第三十六頁，共72頁。哺乳動物克隆技術的發(fā)展克隆羊：1996年7月，蘇格蘭克隆鼠：1997年10月，日、美、英克隆牛：1998年7月，日本克隆貓：2002年2月，美國克隆狗：2005年4月，韓國，黃禹錫克隆恒河猴：2007年11月，美國

第三十七頁，共72頁。轟動世界的黃禹錫造假事件2004年2月黃禹錫在《科學》雜志上發(fā)表論文，宣布在世界上率先用卵子成功培育出人類胚胎干細胞；2005年5月，他又在《科學》雜志上發(fā)表論文，宣布攻克了利用患者體細胞克隆胚胎干細胞的科學難題，其研究成果一時轟動全球。2005年4月黃禹錫在《自然》雜志上發(fā)表論文，成功實現了狗的克隆?！八辜{皮”正是世界上第一條克隆狗。

第三十八頁，共72頁。2006年1月首爾大學調查委員會公布了造假事件調查結果，稱發(fā)表在science上的兩篇論文都屬于造假?？寺」返哪瞧撐谋蛔C明是可信的。首爾大學隨后宣布解除黃禹錫的教授職務，韓國政府也取消了授予黃禹錫的“最高科學家”稱號。第三十九頁，共72頁。黃禹錫東山再起2010年10月17日，黃禹錫及其團隊宣布利用狗的卵子，成功異種克隆了８只郊狼。2012年3月13日，黃禹錫與俄羅斯研究人員13日簽署合作協(xié)議，打算利用克隆技術復活大約1萬年前滅絕的史前生物猛犸象。第四十頁，共72頁?？寺∪?？第四十一頁，共72頁。a

胚胎干細胞具有正常穩(wěn)定的二倍體核型和帶型。b胚胎干細胞具有較高的端粒酶活性及堿性磷酸酶的表達。

人胚胎干細胞系端粒酶活性都很高，說明其可在體外未分化狀態(tài)進行長期培養(yǎng)。3.胚胎干細胞的鑒定第四十二頁，共72頁。c.人胚胎干細胞特異表面抗原的表達

胚胎階段特異性抗原:SSEA-1SSEA-3SSEA-4

Thmoson分離的hES陰性弱陽性強陽性Gearhart分離的hES陽性弱陽性陽性小鼠ES陽性陰性陰性鼠和人胚胎干細胞表達的表面抗原有種屬差異。Gearhart等認為SSEA-1陽性可能是源于原始生殖細胞的多能干細胞分化的標志.細胞膜表面有特殊的標記：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81第四十三頁，共72頁。d.具有轉錄因子Oct-4的表達

Oct-4只限定在多潛能細胞中表達。人和小鼠的胚胎干細胞都表達轉錄因子Oct-4，當胚胎干細胞分化時，其表達能力大大降低。Oct-4可能是哺乳動物不同發(fā)育階段多潛能細胞所特有的少數特異的調控分子之一。第四十四頁，共72頁。

e.不被Hoechst33342和Rhodamine123染色f.能分化成三個胚層的細胞，將胚胎干細胞植入免疫缺陷小鼠皮下可產生畸胎瘤g.可誘導分化為各種成體干細胞第四十五頁，共72頁。胚胎干細胞的誘導分化：胎牛血清，骨髓基質細胞共培養(yǎng)胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－造血細胞 RA胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－神經細胞DMSO胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－肌肉細胞TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－血管和內皮細胞RA+胰島素+T3胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－脂肪細胞BMP-2,BMP-4胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－軟骨細胞地塞米松，磷酸甘油胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－骨細胞基因轉染胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－胰島素分泌細胞第四十六頁，共72頁。（二）成體干細胞

成體干細胞是成體組織內具有自我更新及分化一種或一種以上子細胞的未成熟細胞。

在成體組織或器官中，許多細胞自我更新及分化產生不同組織細胞的能力，如血液和皮膚細胞。第四十七頁，共72頁?？茖W家鑒定或分離出多種成體組織的干細胞，造血干細胞、神經干細胞、皮膚干細胞等等。由于分離神經干細胞所需的胎兒腦組織較難取材，加之胚胎細胞研究的爭議尚未平息，神經干細胞的研究仍處于初級階段。隨著干細胞研究領域向深度和廣度不斷擴展，人們對干細胞的了解也將更加全面。

第四十八頁，共72頁。實際上，克隆羊Dolly的誕生就已經證明，通過體細胞核移植實驗實現哺乳動物體細胞的重編程是可能的，將已分化細胞的細胞核植入卵細胞內可以使已分化細胞基因組中處于沉默狀態(tài)的基因再次被激活，形成多能干細胞，最終發(fā)育形成一個新的完整的生命體。重編程的體細胞幾乎能夠實現對胚胎干細胞的替代。但是，體細胞核移植試驗具有很大的局限性：1.克隆的效率極低2.產生的許多后代在各個階段都體現出嚴重的發(fā)育異常3.由于需要卵母細胞，核移植實驗在人類中的應用受到強烈的倫理學質疑。

第四十九頁，共72頁。有沒有相對簡單，又可擺脫材料來源和倫理學諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢？50第五十頁，共72頁。第二節(jié)iPS技術概念：iPS，誘導性多能干細胞（inducedpluripotentstemcells,iPScells）iPS技術，即誘導多能干細胞技術，也稱細胞重新編程技術，是在特定的條件下將成體成熟、分化的體細胞逆轉恢復到全能分化的狀態(tài)，成為一類類似胚胎干細胞（多能干細胞）的新興技術。2009年，iPS技術榮膺《自然-方法》年度生命科學技術。

第五十一頁，共72頁。iPS技術的誕生

2006年8月，日本京都大學的山中伸彌（ShinyaYamanaka)教授領導的研究團隊發(fā)現，只需要將四個基因(Oct3/4,Sox2,c-myc和Klf4)送入已分化完全的小鼠纖維母細胞，即可以把纖維母細胞重新編排變成全能性的類胚胎干細胞。他們將這種”返老還童”的重新編排細胞稱之為”誘導式多能性干細胞”，即iPS細胞。山中伸彌教授

ShinyaYamanakahttp://qnet.nishinippon.co.jp/InductionofPluripotentStemCellsfromMouseEmbryonicandAdult

FibroblastCulturesbyDefinedFactors.Yamanaka,S.,Takahashi,K.Cell126,663–676,August25,2006第五十二頁，共72頁。2007年11月20日，美國的Thomson實驗室在science上發(fā)表文章，第一次成功地由人類的體細胞誘導為IPS細胞。他們從14個保持人類ES細胞多能性狀態(tài)的基因篩選出四個基因OCT3/4,SOX2,NANOG,andLIN28，將之用慢病毒載體轉入人類體細胞中，得到了在增殖能力、，形態(tài)學，核型，端粒酶活性，細胞表面標志，ES特征基因表達，畸胎瘤擬胚體形成能力上與人類ES相似的IPS細胞。InducedPluripotentStemCellLinesDerivedfromHumanSomaticCells.JUNYINGYU,MaximA.Vodyanik,JamesA.Thomson,SCIENCE21December2007:Vol.318.no.5858,pp.1917-1920第五十三頁，共72頁。2007年11月20日，日本Yamanaka實驗室在CELL上發(fā)表了用人類的成纖維細胞（皮膚成纖維細胞，成纖維細胞樣滑膜細胞，BJ細胞），通過逆轉錄病毒載體導入Oct3/4,Sox2,Klf4,c-Myc四個基因，也成功得到了人類的IPS細胞，并證明它們在形態(tài)學，核型，端粒酶活性，細胞表面標志，ES特征基因表達，畸胎瘤擬胚體形成方面與ES細胞相似。同時，他們還成功的將這些IPS細胞誘導成神經細胞，心肌細胞。在這次實驗中，他們通過對MEF引入了小鼠的你轉錄位點，提高了轉到率。

InductionofPluripotentStemCellsfromAdultHumanFibroblastsbyDefinedFactorsYamanaka,S.,Takahashi,K.Cell131,861–872,November30,2007iPS被《自然》和《科學》雜志評為2007年第一和第二大科學進展。

第五十四頁，共72頁。誘導iPS細胞四個基因的選擇體細胞可藉由將核送入卵中或是和胚胎干細胞核融合而被重建(Cowanetal.,2005;Tadaetal.,2001)必定有某些基因將細胞維持在多能性的狀態(tài)胚胎細胞中：Oct3/4、Sox2、Nanog(Nicholsetal.,1998;Niwaetal.,2000;Avilionetal.,2003;Chambersetal.,2003;Mitsuietal.,2003)癌細胞中：Stat3、E-Ras、c-myc、Klf4、b-catenin

(Matsudaetal.,1999;Niwaetal.,1998;Takahashietal.,2003;Cartwrightetal.,2005;Lietal.,2005;Kielmanetal.,2002;Satoetal.,2004)4/24：Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4iPScell：inducedpluripotentstemcell第五十五頁，共72頁。材料：HDF-Slc7a1高加索36歲女性臉部皮膚0天：轉入基因Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf46天：放置于mytomycinC-treatedSNLfeedercell中(5×104~5×105)7天：置換成干細胞專用培養(yǎng)液實驗材料及誘導方案0天轉染10%FBSESmedium+bFGF6天30天培養(yǎng)于feeder上收取colony第五十六頁，共72頁。B、HDF形態(tài)D、25天后形成顆粒狀群落(與hES形態(tài)相似)C、14天后形成之顆粒狀群落重建人類體細胞-產生iPS第五十七頁，共72頁。從顆粒狀群落中挑出類似hES細胞的群落：7/122，8/84，8/171，5/73，6/122，11/213發(fā)育成緊密堆疊且扁平狀的群落類似hES：細胞核大、細胞質少會自發(fā)性分化需要feedercell才可生存圖E、培養(yǎng)出的iPS細胞型態(tài)圖F、放大后的iPS細胞圖G、iPS細胞群落中間自發(fā)性分化的細胞重建人類體細胞-產生iPS第五十八頁，共72頁。iPS細胞檢測-hESmarker表現stage-specificembryonicantigen-1(SSEA-1)Sell-specificsurfaceantigens(Adewumietal.,2007)第五十九頁，共72頁。iPS細胞檢測-hESmarker表現RT-PCR：iPS表現hESmarkerES：胚胎干細胞NTRA-2：人類胚胎瘤細胞HDF：人類真皮纖維母細胞圖一、RT-PCR分析hESmarker基因表現結果第六十頁，共72頁。iPS細胞檢測-hESmarker表現Westernblotting：

OCT3/4、SOX2、NANOG、SALL4、E-CADHERIN、hTERT(Adewumietal.,2007)

蛋白質表達量和hES細胞相似ES：胚胎干細胞NTRA-2：人類胚胎瘤細胞HDF：人類真皮纖維母細胞圖二、hESmarker的westernblot分析第六十一頁，共72頁。端粒酶活性測試胚胎干細胞會高度表達hTERT基因-：實驗組+：加熱抑制端粒酶活性(陰性對照)IC：internalcontrol圖三、用TRAP法測試trlomerase活性第六十二頁，共72頁。iPS細胞培養(yǎng)為類胚胎體將iPS細胞放入懸浮的培養(yǎng)液中生長8天后形成球狀的類胚胎體(embryoidbodies,EBs)將類胚胎體置于覆蓋gelatin的培養(yǎng)基中生長8天iPScells附著于培養(yǎng)基上并分化成各種細胞形態(tài)第六十三頁，共72頁。類胚胎體的分化可在invitro的狀態(tài)下將iPS細胞分化成三種胚層似神經元細胞表皮細胞