實驗三細胞外周血DNA提取

實驗三細胞外周血DNA提取第1頁/共16頁實驗三、外周血細胞基因組

DNA的提取(NaI法)第2頁/共16頁基因組DNA提取原理Loparev等報道利用NaI提取DNA的方法，從全血制備白細胞DNA，可用雙蒸水溶漲紅細胞及白細胞膜，釋放出血紅蛋白及細胞核。加NaI破核膜并使DNA從核蛋白中解離，用氯仿/異戊醇抽提使蛋白質(zhì)沉淀完全（異戊醇去泡沫），DNA存在于上層水相中，以異丙醇沉淀DNA，離心棄去異丙醇，并重復操作一次，即可獲得白細胞DNA。第3頁/共16頁氯仿/異戊醇：使蛋白變性。氯仿的作用是蛋白變性劑、抽提脂溶性物質(zhì);

異戊醇作用是A.降低表面張力、阻止氣泡的產(chǎn)生(劇烈震蕩時容易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用);B.有助于分相(使離心后水相、有機相穩(wěn)定)異丙醇：沉淀DNA70%乙醇：洗滌DNA;(鹽、蛋白等溶于70%乙醇，而DNA不溶)100%乙醇：可以用于沉淀DNA，也可以用于使DNA快速干燥第4頁/共16頁限制性核酸內(nèi)切酶作用原理

限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4—8bp），并對其進行切割的核酸內(nèi)切酶。

第5頁/共16頁PCR反應原理

基于DNA的半保留復制，兩條鏈都可以作為模板。在體內(nèi)，DNA復制是周期性的，所以基因擴增的數(shù)量有限；PCR技術在體外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合適的底物和因子，通過對溫度的控制，使DNA不斷位于變性、復性和合成的循環(huán)中，達到擴增DNA的目的。第6頁/共16頁PCR反應反復進行三步驟的循環(huán)過程：熱變性——退火——引物延伸1）熱變性：基因組DNA在95℃下加熱5分，雙螺旋結構被熱變性解鏈為兩股單鏈。2）退火：將反應混合物降溫至55~65℃，引物與上述單鏈DNA上互補的序列雜交在一起，即退火，形成模板——引物復合。3）引物延伸：將反應混合物調(diào)節(jié)至72℃，在DNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，從引物3’端開始，沿著5’—3’的方向，按照模板鏈的序列，合成一條新DNA鏈，其序列與模板序列互補。第7頁/共16頁第8頁/共16頁第9頁/共16頁器具和試劑離心機、振蕩器、Eppendorf管，移液器等抗凝人外周血，雙蒸水，6MNaI溶液，氯仿/異戊醇，70％乙醇，TE溶液第10頁/共16頁試劑

抗凝人外周血，雙蒸水，6MNaI溶液，氯仿/異戊醇，70％乙醇，TE溶液第11頁/共16頁步驟1．取外周抗凝血（全血）200ul于Eppendorf管中，12000rpm離心12min。2.棄上清，加雙蒸水200ul溶解，搖勻20s?；靹蚝蠹?MNaI溶液200ul，充分搖勻20s。3.加入氯仿/異戊醇（24：1）400ul，邊加邊搖，搖勻20s，12000rpm離心12min。第12頁/共16頁步驟4.取上層液350ul，加入另一新Eppendorf管中，加210ul異丙醇，重新?lián)u勻20s，室溫放置15min，靜置后的反應體系15000rpm離心12min，使沉淀緊貼Eppendorf管壁。5.棄異丙醇，加70％乙醇1ml（不振動，可輕輕顛倒混勻），以15000rpm離心12min。第13頁/共16頁步驟6.棄乙醇，敞開Eppendorf管蓋，烘干（37℃恒溫箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA。（制成的DNA液置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?．用DNA／RNACalculator檢測DNA的含量和純度。純DNA的此比值約為1.8～2.0。純RNA的比值約為大于2.0。第14頁/共16頁步驟8、限制性內(nèi)切酶酶切：下述各試劑加入Eppendorf管內(nèi)：a、渦旋混勻，短暫離心。b、置恒溫水浴箱內(nèi)，按EcoRI限制酶的活性溫度要求，37℃酶解過夜C、置于4℃或-20℃保存。人類基因組DNA0.1-1ug10×