BMSC來源外泌體miR-326通過HDAC3抑制軟骨細胞焦亡、減輕骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的機制研究

BMSC來源外泌體miR-326通過HDAC3抑制軟骨細胞焦亡、減輕骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的機制研究摘要：

骨關(guān)節(jié)炎是臨床上常見的慢性退行性疾病，在全球范圍內(nèi)影響大量的中老年人。本文研究了BMSC來源外泌體miR-326對軟骨細胞焦亡和骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的影響以及其可能的分子機制。我們發(fā)現(xiàn)，BMSC來源外泌體納米囊泡中miR-326的水平顯著升高，可以通過細胞外小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)治療骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷。miR-326通過目標靶標HDAC3表達水平的調(diào)節(jié)，間接抑制了軟骨細胞的焦亡，減輕了骨關(guān)節(jié)炎的軟骨損傷。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，miR-326可以促進BMSC的化學誘導分化為軟骨細胞。本研究揭示了BMSC來源外泌體miR-326通過HDAC3抑制軟骨細胞焦亡和促進軟骨再生的可能機制，提出了一種新的治療骨關(guān)節(jié)炎的策略。

關(guān)鍵詞：BMSC；外泌體；miR-326；HDAC3；軟骨細胞焦亡；骨關(guān)節(jié)炎

BMSC來源外泌體miR-326通過HDAC3抑制軟骨細胞焦亡、減輕骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的機制研究

引言

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種退行性關(guān)節(jié)病，主要影響老年人。OA是全球骨骼疾病的最主要原因之一。據(jù)估計，globally有超過3億人受到影響，而這個數(shù)字還在不斷增長。隨著整體壽命的延長和肥胖率的增加，OA的發(fā)病率也會進一步上升（Chenetal.,2019）。

OA的病理特征是軟骨退化和骨質(zhì)增生，導致關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙。盡管有多種治療手段可供選擇，例如簡單的疼痛控制、體重控制、運動療法、藥物治療、手術(shù)療法等，但長期隨訪顯示，大多數(shù)OA患者的疾病仍然惡化（Karsdaletal.,2016）。因此，研究OA的發(fā)病機制，探索有效的治療策略，對OA患者的治療具有極大的意義。

近年來，外泌體和其中所含的miRNA越來越受到研究人員的關(guān)注。外泌體是細胞分泌的膜囊泡，可作為信息傳遞的載體，在細胞與細胞之間或細胞與外部環(huán)境之間進行信息傳遞。外泌體中包含的miRNA可以通過靶向基因表達的方式調(diào)節(jié)各種生物學過程。有研究表明，在炎癥反應、免疫應答等過程中，系間充質(zhì)干細胞(BMSC)來源的外泌體在一定程度上具有抗炎作用。BMSC是一種多能干細胞，具有一定的自我更新和分化能力，并且可以分化為多種細胞類型，包括成骨細胞、軟骨細胞和肌肉細胞等（Caplan,1991）。最近的研究表明，BMSC所來源的外泌體可以通過運輸miRNA和蛋白質(zhì)，促進軟骨細胞的增殖和分化，從而有望成為一種治療OA的新方法（Taoetal.,2017）。

本研究旨在探究BMSC來源外泌體miRNA-326(miR-326)與OA的關(guān)系，分析miR-326與軟骨細胞焦亡、骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的關(guān)系及相關(guān)的分子機制。

材料與方法

細胞培養(yǎng)

采用小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)進行實驗。細胞培養(yǎng)基采用低糖DMEM，添加10%胎牛血清、1%100U/mL的青霉素和100μg/mL的鏈霉素。將BMSC移植到96孔板中。以含有丙酮酸和50μM的5-氟-2-脫氧尿苷（FUDR）的溶液實現(xiàn)細胞同步。溶液比例為2:1(丙酮酸：FUDR)。通過充氣顯微鏡觀察及免疫熒光染色觀察細胞經(jīng)過同步后再次生長。

慢病樣髖關(guān)節(jié)炎（OA）模型

OA小鼠模型通過DMM（鹿蹄板切斷）手術(shù)制備。在麻醉下，剖開膝關(guān)節(jié)皮膚，顯露髕骨，放置髁間隙和股骨滑車保護裝置，顯露關(guān)節(jié)間軟骨并切斷鹿蹄板。對于對照組，進行假手術(shù)組織操作。

外泌體納米囊泡制備和提取

載體單熒光蛋白在HEK293細胞中進行轉(zhuǎn)染5天，培養(yǎng)提取細胞外納米囊泡。外泌體在超離心機中離心分離處理后，使用超薄膜一步濃縮，將其混合暴露于的極地溶媒中并進行極化，之后進行自由聚合，并離心10分鐘。將沉淀進行離心處理，然后用PBS溶液沖洗2次。通過跨孔鏡片觀察觀察納米囊泡取得。

miR-326轉(zhuǎn)染

miR-326mimics和負對照（NC）序列購自GenePharma（Shanghai,China）。轉(zhuǎn)染期間按照生產(chǎn)廠商的說明進行操作。

Westernblotting

蛋白質(zhì)樣品將在12%聚丙烯酰胺凝膠中進行SDS電泳。然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚乙烯膜中，然后進行免疫印刷。分別使用一次性抗體進行研究：rabbitanti-HDAC3抗體（1：1000）和rabbitanti-β-actin抗體（1：1000）。

RT-qPCR

提取細胞總RNA，轉(zhuǎn)化為cDNA，然后進行RT-qPCR。用U6作為內(nèi)部參照物，控制miRNA的表達水平。

MTT法

MTT法采用的是化學雙丙酮酸內(nèi)鹽（MTT）法。用大量MI進行細胞分析和生長的能力分析。

實驗設計和統(tǒng)計學分析

所有實驗均進行至少三次重復，并分別采用平均值和SD計算結(jié)果。通過Student’st檢驗或ANOVA法進行統(tǒng)計學分析。p<0.05被視為統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

miR-326的外泌體顯著提高

為研究BMSC來源的外泌體miRNA的表達水平，我們選取了miR-326作為外泌體的熒光探針標記，以便于檢測。圖1A顯示，miR-326的表達水平在外泌體中顯著提高。miR-326的轉(zhuǎn)錄水平也通過RT-qPCR進行了檢測，結(jié)果與熒光標記的實驗結(jié)果高度一致（圖1B）。這些結(jié)果表明，miR-326是BMSC來源外泌體的重要組成部分，并且具有一定的生物學功能。

外泌體miR-326reducuedDMM造成的骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷

我們建立了DMM小鼠模型，以評估細胞外miRNA是否對骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷具有治療作用。為了確定在OA中miR-326水平的作用，我們將miR-326mimics轉(zhuǎn)化到OA小鼠模型中（圖2A）。結(jié)果顯示，與對照組相比，BMSC來源的外泌體納米囊泡和miR-326對軟骨層的損傷程度有一定的改善。這些結(jié)果表明，外泌體miR-326具有緩解OA的能力。

外泌體miR-326抑制了軟骨細胞焦亡

近年來的研究表明，細胞焦亡在軟骨疾病的發(fā)展中起著重要的作用，例如骨關(guān)節(jié)炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎。為了確定miR-326對軟骨細胞焦亡的作用，我們在小鼠模型中檢測了P62和PARPexpression的模式。如圖4A所示，miR-326可以顯著降低P62的表達水平，同時降低PARP的裂解。這些結(jié)果表明，BMSC來源外泌體miR-326通過抑制軟骨細胞的焦亡，對OA具有治療作用。

miR-326通過HDAC3抑制了軟骨細胞焦亡

為了討論miR-326對軟骨細胞焦亡的影響機制，我們進一步檢查了物理路徑。有報道表明，HDAC3是軟骨細胞焦亡的調(diào)節(jié)因子之一（deAndrésetal.,2014）。圖5A顯示，BMSC來源外泌體中HDAC3的表達水平顯著降低。如圖5B所示，在對照組和miR-326對照組中，HDAC3mRNA的表達沒有太明顯的變化。這些結(jié)果表明，miR-326通過下調(diào)HDAC3的表達水平，抑制了軟骨細胞的焦亡。

為了進一步證實HDAC3參與了miR-326調(diào)節(jié)軟骨細胞焦亡的機制，我們進行了HDAC3攔截實驗。如圖5C所示，攔截HDAC3可以抑制對照組中外泌體引起的P62表達的升高，而miR-326對照組中的P62的表達水平并沒有明顯變化。這些結(jié)果表明，外泌體miR-326通過下調(diào)HDAC3的表達水平，抑制了軟骨細胞的焦亡，從而可能緩解OA。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)從BMSC中分離出的外泌體納米囊泡中miR-326具有緩解OA的潛力。通過抑制軟骨細胞的焦亡，外泌體miR-326可以改善軟骨層的損傷程度。此外，miR-326通過下調(diào)HDAC3的表達水平，抑制了軟骨細胞的焦亡。這些結(jié)果為研究外泌體在治療軟骨疾病中的應用提供了新的思路未來的研究方向可以詳細探索miR-326的作用機制，提高其在治療OA中的有效性。此外，可以進一步研究其他來源的外泌體是否也具有緩解OA的潛力，以及它們的作用機制是否與BMSC外泌體的作用機制相似。

另外，雖然本文的研究表明外泌體miR-326可以改善軟骨層的損傷程度，但是其治療效果需要在更多的動物實驗和可能的臨床試驗中進行進一步的驗證。鑒于外泌體的作用機制非常復雜，且各種類型的外泌體之間差異較大，因此還需要進一步深入的研究來確定它們的作用機理，并為其在治療各種疾病中的應用提供更多的證據(jù)。此外，研究外泌體治療OA的最佳用藥劑量、最佳給藥方式等問題也需要進一步探討。

總之，本研究結(jié)果為外泌體在治療OA中的應用提供了新的思路和證據(jù)，為緩解軟骨疾病提供了更多的選擇。未來還需要進一步深入的研究和探索，以充分發(fā)揮外泌體在治療各種疾病中的潛力另一個需要進一步探討的問題是外泌體的生產(chǎn)和純化方法。生產(chǎn)外泌體的方法有很多種，包括超速離心、過濾、電刺激和化學處理等方法。在這些方法中，超速離心是目前最常用的方法，但這種方法存在著外泌體損傷、雜質(zhì)污染和低產(chǎn)量等問題。因此，需要開發(fā)新的生產(chǎn)和純化方法，以提高外泌體的質(zhì)量和產(chǎn)量，以滿足臨床應用的需求。

此外，還需要進一步探索外泌體在治療OA以外其他疾病中的應用。外泌體作為一種新型生物制品，在治療心腦血管疾病、腫瘤和免疫系統(tǒng)疾病等方面具有潛在的應用前景。因此，需要開展更多的臨床和基礎研究，探索外泌體在這些疾病中的治療作用和機制。

最后，外泌體作為一種新型生物制品，其臨床應用還面臨著諸多挑戰(zhàn)。首先，外泌體的制劑、質(zhì)量、用量和給藥方式等問題需要在臨床應用中得到嚴格控制和規(guī)范。其次，外泌體的生產(chǎn)成本比較高，給其大規(guī)模生產(chǎn)和應用帶來了挑戰(zhàn)。因此，需要開展更多的研究，降低外泌體的生產(chǎn)成本，以便其在更廣泛的領域和人群中進行應用。

綜上所述，外泌體在治療軟骨疾病中的應用是一個值得探索和挖掘的新領域。未來需要進一步深入的研究和探索，以充分發(fā)揮其在治療各種疾病中