DNS比色法測定還原糖及總糖實驗報告

DNS比色法測還原糖標準曲線繪制及測定 Tr21培養(yǎng)液中初始和最終還原糖及總糖含量實驗報告研究背景木霉菌在發(fā)酵過程中，利用碳源導致發(fā)酵液中糖含量的變化，其中還原糖是一個主要的反映參數(shù)。還原糖與3,5-二硝基水楊酸（DNS）在堿性條件下生成棕紅色物質(zhì)（3-氨基-5-硝基水楊酸），在一定范圍內(nèi)，棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度與還原糖的含量呈一定的比例關(guān)系。糖含量的不同變化一定程度上體現(xiàn)著 Tr21不同的生長階段，從而為控制及優(yōu)化發(fā)酵過程提供科學依據(jù)。實驗?zāi)康?-二硝基水楊酸比色法測定Tr21發(fā)酵液中還原糖含量，利用糖含量這個參數(shù)，控制發(fā)酵過程。3.實驗原理在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，[OHNH"HOOC—} +還原糖—*HOOC—/, NO2（3—氨基_5-機水楊酸）?黃色利用比色法可測定樣品中的含糖量。實驗材料°HNO2發(fā)酵液（5天）:Tr121（A2）實驗材料：3,5-二硝基水楊酸，氫氧化鈉，苯酚，亞硫酸鈉，酒石酸鉀鈉，葡萄糖，蒸僧水實驗器材：可見分光光度計，電子天平，真空干燥箱，數(shù)顯恒溫水浴鍋，離心機，移液器，槍頭，500ML容量瓶，試管，no）2ml燒杯,1000ml量筒（DNS）實驗方法 桔紅色5.1試劑配制（1） 1mg/ml葡萄糖標準溶液：準確稱取干燥恒重的葡萄糖 100mg,加少量蒸t留水溶解后，以蒸t留水定容至100ml,即含葡萄糖為1.0mg/ml。（2） 3,5—二硝基水楊酸試劑：稱取6.3g3,5--硝基水楊酸并量取262ml2mol/LNaOH加到酒石酸鉀納的熱溶液中（182g酒石酸鉀納溶于500ml水中），再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸氫鈉溶于其中，攪拌溶解，冷卻后定容到1000ml貯于棕色瓶中（3） 碘一碘化鉀溶液：稱取5g碘，10g碘化鉀溶于100ml蒸僧水中。

⑷6NNaOH:稱取120gNaOH溶于500ml蒸餾水中。0.1%酚酞指示劑。6mol/LHCl溶液5.2、葡萄糖標準曲線制作取8支15mM180mm試管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖標準液和蒸餾水試劑01試劑0123葡萄糖標準液00.20.40.6(ml)蒸餾水2.01.81.61.4(ml)水楊酸溶液1.51.51.51.5(ml)葡萄糖含量00.20.40.6(mg)456780.81.01.21.41.61.21.00.80.60.41.51.51.51.51.50.81.01.21.41.6將各管溶液混合均勻，在沸水中加熱5min，取出后立即用冷水冷卻到室溫，再向每管加入21.5ml蒸餾水，搖勻。入0 0.0770.20.3190.4240.5430.6550.7610.856=540nm處測定吸光度以葡萄糖含量(mg)為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線，如圖一：5-3-1培養(yǎng)液中初始總糖與還原糖的測定準確量取5ml培養(yǎng)液，定容至50ml，作為還原糖測定樣品液。準確量取1ml發(fā)酵液并加蒸餾水定容至10ml放在錐形瓶中，加入6mol/LHCl10ml，在沸水浴中加熱0?5h，取出1?2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍色。水解畢，冷卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑，以6NNaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到 50ml，用于

總糖測定。試劑空白還原糖總糖樣品溶液(ml)01.01.0蒸餾水(ml)2.01.01.0水楊酸(ml)1.501.501.50將各管溶液混合均勻，在沸水中加熱 5min,向每管加入21.5ml蒸餾水,取出后立即用冷水冷卻到室溫，再搖勻入=540nm處測定吸光度00.3110.228樣品溶液中還原糖和總糖00.5940.445.3.2發(fā)酵液中最終總糖與還原糖的測定發(fā)酵液2500rpm離心20min，取5ml，作為還原糖測定樣品液。準確量取5ml發(fā)酵液懸液放在錐形瓶中，加入6mol/LHCl5ml,在沸水浴中加熱0.5h,取出1?2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍色。水解畢，冷卻至室溫后加入 1滴酚酞指示劑，以6NNaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到50ml，用于總糖測定。試劑空白還原糖總糖樣品溶液(ml)01.01.0蒸餾水(ml)2.01.01.0水楊酸(ml)1.501.501.50將各管溶液混合均勻，在沸水中加熱 5min，取出后立即用冷水冷卻到室溫，再向每管加入21.5ml蒸餾水，搖勻入=540nm處測定吸光度00.150.014樣品溶液中還原糖00.2990.05和總糖測定后，取樣品的光吸收值在標準曲線上查出相應(yīng)的糖量。結(jié)果處理按下式計算出樣品中還原糖和總糖的濃度:還原糖濃度(g/ml)=m/V*稀釋倍數(shù)/1000總糖濃度(g/ml)=m/V*稀釋倍數(shù)*0?9/1000

式中：m—應(yīng)液中還原糖或總糖的質(zhì)量：mg；V應(yīng)液的體積：ml；1000-----m換算成g的系數(shù)。得：初始培養(yǎng)液中：還原糖濃度（g/ml）=0.594/1*10/1000=5.94/1000總糖濃度（g/ml）=0.44/1*50*0.9/1000=19.8/1000最終培養(yǎng)液中：還原糖濃度（g/ml）=0.299/1*1/1000=0.299/1000總糖濃度（