水稻os930突變體的脅迫分析研究

摘要水稻是世界上重要的糧食作物，占全球糧食作物種植面積的1/3，為人類提供40%的熱能。為了滿足日益增長的人口對糧食作物的需求，必須不斷提高水稻產(chǎn)量。然而，在栽培過程中，水稻極易受到逆境脅迫，嚴(yán)重影響產(chǎn)量的提高。因此，選擇簡便、快速、準(zhǔn)確的方法研究水稻逆境脅迫具有重要意義。葉綠素?zé)晒獾膭討B(tài)技術(shù)在測量葉片光合作用過程中光系統(tǒng)對光能的吸收、傳輸、耗散和分布方面具有獨特的作用。與表觀氣體交換指數(shù)相比，葉綠素?zé)晒鈪?shù)具有更多的內(nèi)在特征。近年來，隨著葉綠素?zé)晒饫碚摵蜏y量技術(shù)的進步，對原初反應(yīng)超快光合作用及其相關(guān)光合機制的研究得到了極大的推動。目前，葉綠素?zé)晒獾姆治黾夹g(shù)在光合作用機理、植物抗逆性生理學(xué)和作物產(chǎn)量潛力預(yù)測等方面的應(yīng)用已經(jīng)取得了一定的進展，植物中的葉綠素?zé)晒庑盘柼N含著豐富的光合作用信息。它們的特性與植物的營養(yǎng)和脅迫水平密切相關(guān)。它們可以快速、靈敏、無損地研究和檢測完整植物在脅迫下的真實光合作用行為。它們常被用來評價光合機構(gòu)的功能和環(huán)境脅迫對其的影響，通過檢測植物光合作用過程中的熒光特性，可以了解植物生長、病害和脅迫的生理狀況。目前，基于葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)的優(yōu)勢，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于高光照光脅迫、溫度脅迫、水分脅迫、養(yǎng)分脅迫、外源物質(zhì)對水稻脅迫的影響研究等領(lǐng)域。關(guān)鍵詞：水稻；葉綠素?zé)晒?；脅迫；高光照

ABSTRACTRiceisanimportantfoodcropintheworld,accountingfor1/3oftheglobalfoodcropplantingarea,providing40%oftheheatenergyforhumanbeings.Inordertomeettheincreasingpopulationdemandforfoodcrops,riceproductionmustbecontinuouslyincreased.However,intheprocessofcultivation,riceisveryvulnerabletostress,whichseriouslyaffectstheyield.Therefore,itisofgreatsignificancetochooseasimple,rapidandaccuratemethodtostudythestressofrice.Thedynamictechnologyofchlorophyllfluorescencehasauniqueeffectontheabsorption,transmission,dissipationanddistributionoflightenergyintheprocessofphotosynthesisofleaves.Comparedwiththeapparentgasexchangeindex,chlorophyllfluorescenceparametershavemoreintrinsiccharacteristics.Inrecentyears,withtheprogressofchlorophyllfluorescencetheoryandmeasurementtechnology,theresearchonthesuperfastphotosynthesisanditsrelatedphotosyntheticmechanismoftheinitialreactionhasbeengreatlypromoted.Atpresent,theapplicationofchlorophyllfluorescenceanalysistechnologyinphotosynthesismechanism,plantstressresistancephysiologyandcropyieldpotentialpredictionhasmadesomeprogress.Chlorophyllfluorescencesignalinplantscontainsabundantphotosynthesisinformation.Theircharacteristicsarecloselyrelatedtothenutritionalandstresslevelsofplants.Theycanstudyanddetectthetruephotosynthesisbehaviorofcompleteplantsunderstressquickly,sensitivelyandnondestructive.Theyareoftenusedtoevaluatetheeffectsofphotosyntheticmechanismandenvironmentalstressonthem.Bydetectingthefluorescencecharacteristicsofphotosynthesis,wecanunderstandthephysiologicalstatusofplantgrowth,diseaseandstress.Atpresent,basedontheadvantagesofchlorophyllfluorescenceanalysistechnology,thetechnologyhasbeenwidelyusedinthefieldsofhighlightstress,temperaturestress,waterstress,nutrientstress,andtheinfluenceofexogenoussubstancesonricestress.KEYWORDS:Rice，Chlorophyllfluorescence，coercion，GaoGuangzhao3結(jié)果與分析目錄摘要 IABSTRACT II1緒論 11.1水稻突變體的概述 11.2光照和光強對水稻的影響 11.3葉綠素?zé)晒獾难芯繗v史 21.4葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù) 21.5手持葉綠素?zé)晒鈨x及相關(guān)熒光參數(shù) 41.5.1應(yīng)用領(lǐng)域 41.5.2功能特點 41.5.3測量程序與功能 51.5.4技術(shù)參數(shù) 61.6選題目的意義及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析 71.6.1研究目的意義 71.6.2水稻脅迫分析研究現(xiàn)狀 72材料與方法 92.1實驗材料和儀器 92.2實驗方法 92.2.1培養(yǎng)基的制備及滅菌 92.2.2水稻無菌苗的獲取 92.2.3實驗處理 92.2.4葉綠素相關(guān)參數(shù)測定 103結(jié)果與分析 124結(jié)論與展望 164.1結(jié)論 164.2展望 16參考文獻(xiàn) 17致謝 18附錄 19

1緒論1.1水稻突變體的概述突變體對于遺傳學(xué)和生物學(xué)都有著重要的研究意義，測序使我們獲得了大量的關(guān)于擬南芥和水稻基于序列信息。水稻作為重要的糧食作物和研究的模式植株，合理的利用突變，研究突變體對于研究水稻基因有著重要的意義，突變是指染色體數(shù)量，結(jié)構(gòu)及組成等遺傳物質(zhì)發(fā)生多種變化，包括基因突變和染色體畸變。一個基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變，而導(dǎo)致的遺傳變化稱為基因突變。產(chǎn)生水稻突變體的方法主要有理化誘變、T．DNA插入、轉(zhuǎn)座子插入等。到現(xiàn)在，我們已經(jīng)培育出大約500多種突變的水稻品種，在其他糧食作物中，利用各種誘變使其突變也培育成很多新品種。改變植株種子的基因使其變異，選育出優(yōu)良的新品種有利于改變世界糧食缺乏。這也是培育新物種的必須經(jīng)過和必要過程。通過實踐實驗證明，誘發(fā)突變可以選育出許多品質(zhì)好，性質(zhì)優(yōu)良，周期短，抗病性和抗藥性的種子資源。還有這也能為構(gòu)建水稻基因庫，水稻突變體庫提供原始樣本?，F(xiàn)代的分子生物學(xué)技術(shù)定位和克隆使得分析突變基因更加方便快捷。水稻的突變主要包括對葉子形狀，植株高矮，穗型及長短，水稻粒型，根系，抗性等。1.2光照和光強對水稻的影響水稻進行光合作用的主要部位是水稻葉片，葉片也是感知外界光環(huán)境變化的器官，水稻葉片光合特性直接決定了水稻對光能的利用效率。葉片中有許多光合色素，具有吸收光能和傳遞質(zhì)子的功能的色素就是葉綠素，單位面積的葉綠素含量與植物光合作用吸收有關(guān)，植物本身還具有光適應(yīng)特性，當(dāng)光照和光強發(fā)生變化，植物葉片的葉綠素含量即種類和數(shù)量也會隨之改變，一般來說，當(dāng)光照較弱時，葉綠素含量會增加，可以加強對弱光的利用，確保同化物和能量的積累。當(dāng)光照過強時，葉片能吸收的光能超過了環(huán)境能提供的能量時，超過的光能會導(dǎo)致植物的光反應(yīng)階段效率降低，從而引發(fā)光合作用效率降低，產(chǎn)生光抑制，繼續(xù)增強光照，更有可能誘導(dǎo)產(chǎn)生有害物質(zhì)，破壞光反應(yīng)階段。其中就出現(xiàn)了幾個關(guān)鍵詞：光飽和點，光補償點和凈光合速率。光飽和度是指在除光照強度以外的條件一致，在一定范圍內(nèi)，植物的光合速率會隨著光照強度的提高而增高，但達(dá)到某個值后光合效率不在變化，這個值就是光飽和點。1.3葉綠素?zé)晒獾难芯繗v史在十九世紀(jì)就有記錄出現(xiàn)了葉綠素?zé)晒猬F(xiàn)象，1834年由歐洲傳教士Brewster偶然發(fā)現(xiàn)，當(dāng)強光穿過月桂椰子的乙醇提取液時，溶液顏色發(fā)生了變化，由綠到了紅。1825年Stokes將這種變色現(xiàn)象命名為熒光反應(yīng)（fluorescence）。1931年，德國科學(xué)家Kautsky和Hirsch直接觀察到這種現(xiàn)象，他們記錄下來了。他們指出暗適應(yīng)處理的葉片經(jīng)過強光誘導(dǎo)后葉綠素?zé)晒獾膹姸鹊母淖兒投趸嫉墓潭ㄓ兄喾吹年P(guān)系。在此后十余年他和他的學(xué)生針對這一現(xiàn)象進行了眾多的實驗研究。之后又有人進一步對葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象做出了深入的分析和實驗研究。逐步出現(xiàn)了光合作用熒光誘導(dǎo)理論，后來被眾多人選來研究光合作用。比如光合作用存在兩個光反應(yīng)的提出也是利用這一理論。那個時候也有也有許多的不足，大大限制了葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)在其他鄰域的研究。盡管如此，后面還是慢慢的得到了好轉(zhuǎn)，葉綠素?zé)晒庑盘栯m然復(fù)雜易變，它卻可以提供出植株此時最真實的信息，后面測量的儀器也越發(fā)精密和便攜。調(diào)制試葉綠素?zé)晒鈨xPAM的出現(xiàn)使得葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)跨出了里程碑的一步。隨著技術(shù)的進步和儀器的改善，也出現(xiàn)了葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)。1.4葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)葉綠素?zé)晒馐侨~綠素分子產(chǎn)生的一種主要的光學(xué)信號，吸收來自激發(fā)態(tài)的平衡光。細(xì)胞中的葉綠素分子直接或通過吸光顏料間接吸收光以獲取能量，然后從基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)。波長越短，能量越高，因此在葉綠素分子吸收紅光之后，電子切換到最低的激發(fā)態(tài)，而在吸收藍(lán)光之后，電子切換到比紅光更高的能級。高激發(fā)的葉綠素分子非常不穩(wěn)定，通過數(shù)百飛秒內(nèi)的振動衰減將熱量釋放到周圍的環(huán)境中，并返回到最低的激發(fā)態(tài)。處于最低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以穩(wěn)定存在幾納秒。低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以通過多種方式釋放能量以返回穩(wěn)定的基態(tài)。有很多釋放能量的方法。1）再次發(fā)射光子并返回到基態(tài)。換句話說，它產(chǎn)生熒光。因為在發(fā)射熒光光子之前，一些激發(fā)能以熱的形式耗散，所以熒光的波長比吸收的光的波長長，葉綠素?zé)晒馔ǔＮ挥诩t光區(qū)域。2）光子不發(fā)射，而是直接以熱的形式發(fā)射（非輻射能量發(fā)射）。3）能量從一個葉綠素分子轉(zhuǎn)移到另一個相鄰的葉綠素分子。能量在一系列葉綠素分子之間轉(zhuǎn)移，最終到達(dá)反應(yīng)中心。反應(yīng)中心的葉綠素分子通過電荷分離將能量轉(zhuǎn)移至電子受體。進行光化學(xué)反應(yīng)。以上三個過程相互競爭，而最快的過程通常處于主導(dǎo)地位。對于許多色素分子，熒光發(fā)生在納秒級，光化學(xué)發(fā)生在ps級，因此，當(dāng)光合生物處于正常生理狀態(tài)時，天線色素吸收的大部分光能都用于光化學(xué)反應(yīng)，并且僅占對于非常小的熒光。熒光的波長通常長于激發(fā)光的波長，并且激發(fā)光和熒光不重疊。當(dāng)葉片吸收紅光時，葉綠素分子的電子從基態(tài)躍遷到最低激發(fā)態(tài)，這時電子變得不穩(wěn)定并發(fā)出熒光回到基態(tài)。當(dāng)葉子吸收藍(lán)光時，葉綠素分子的電子直接從基態(tài)轉(zhuǎn)換為更高的激發(fā)態(tài)，而當(dāng)電子尋求穩(wěn)定性以返回基態(tài)并以熱的形式耗散能量時。它達(dá)到最低的激發(fā)狀態(tài)，然后再次發(fā)出熒光。耗散能量的形式達(dá)到基態(tài)。熒光的變化與葉綠素的濃度成正比，與光合作用的效率成反比。人們還將葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象稱為考茨基效應(yīng)。在正常的生理溫度下檢測到的葉綠素?zé)晒庑盘枎缀跤?5來自與PsII相關(guān)的葉綠素分子，而PsII色素系統(tǒng)基本上不發(fā)出熒光。因此，葉綠素?zé)晒夤庾V的研究主要針對與PsII相關(guān)的葉綠素分子發(fā)出的熒光。根據(jù)當(dāng)前的國際統(tǒng)一命名法，熒光誘導(dǎo)曲線可分為熒光升高階段和熒光猝滅階段，反映出當(dāng)綠色植物物質(zhì)經(jīng)歷黑暗適應(yīng)時體內(nèi)葉綠素的熒光強度隨時間變化的規(guī)律。被動熒光（基于太陽能的熒光）隨著新設(shè)備的開發(fā)以及遙感技術(shù)的不斷更新。太陽誘導(dǎo)熒光（SIF）測量已成為近期研究的熱門話題。技術(shù)的進步使衛(wèi)星遙感技術(shù)能夠在區(qū)域或全球范圍內(nèi)監(jiān)測植物的葉綠素?zé)晒?。衛(wèi)星遙感受到一系列大氣輻射傳輸過程（如大氣吸收和散射）的影響，葉綠素?zé)晒獾姆囱萏岢隽撕艽蟮睦щy和挑戰(zhàn)。國內(nèi)外許多專家學(xué)者對此領(lǐng)域進行了大量的研究。JIP-test（JIPI測定）是一種基于生物膜能量流的分析方法。利用該方法，可以快速地獲得關(guān)于PS11（光學(xué)系統(tǒng)）的基本信息。分析了不同環(huán)境條件和處理水平的光合功能和機理。如PSII光能分布、供體側(cè)、受體側(cè)、反應(yīng)中心等。[1]裝置光合用裝置包含光系統(tǒng)II，光系統(tǒng)和光系統(tǒng)即PSI和PS1I，接收光后的光合材料暗適應(yīng)。葉綠素?zé)晒馐紫仍黾拥阶畲笾担≒點）。然后就逐漸下降了。最終保持穩(wěn)定。從初始點（0點）到峰值（P點），整個過程具有豐富的熒光變化信息。這里有兩個拐點。J和I分別指出。4點通常稱為熒光誘導(dǎo)動力學(xué)曲線的0、J、I、P相。1.5手持葉綠素?zé)晒鈨x及相關(guān)熒光參數(shù)FluorPenFP110手持式葉綠素?zé)晒鈨x用于實驗室、溫室和野外快速測量植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)，具有便攜性強、精確度高、性價比高等特點；雙鍵操作，具圖形顯示屏，內(nèi)置鋰電和數(shù)據(jù)存儲，廣泛應(yīng)用于研究植物的光合作用、脅迫監(jiān)測、除草劑檢測或突變體篩選，還可用于生態(tài)毒理的生物檢測，如通過不同植物對土壤或水質(zhì)污染的葉綠素?zé)晒忭憫?yīng)，找出敏感植物作為生物傳感器用于生物檢測。FP110配備多種葉夾型號，用于不同的樣品與研究。1.5.1應(yīng)用領(lǐng)域適用于光合作用研究和教學(xué)，植物及分子生物學(xué)研究，農(nóng)業(yè)、林業(yè)，生物技術(shù)領(lǐng)域等。研究內(nèi)容涉及光合活性、脅迫響應(yīng)、農(nóng)藥藥效測試、突變篩選等?！ぶ参锕夂咸匦匝芯俊す夂贤蛔凅w篩選與表型研究·生物和非生物脅迫的檢測·植物抗脅迫能力或者易感性研究·農(nóng)業(yè)和林業(yè)育種、病害檢測、長勢與產(chǎn)量評估·除草劑檢測·教學(xué)1.5.2功能特點1結(jié)構(gòu)緊湊、便攜性強，LED光源、檢測器、控制單元集成于僅手機大小的儀器內(nèi)，重量僅188g2功能強大，是葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的高端結(jié)晶產(chǎn)品，具備了大型熒光儀的所有功能，可以測量所有葉綠素?zé)晒鈪?shù)3內(nèi)置了所有通用葉綠素?zé)晒夥治鰧嶒灣绦?，包?套熒光淬滅分析程序、3套光響應(yīng)曲線程序、OJIP快速熒光動力學(xué)曲線等4高時間分辨率，可達(dá)10萬次每秒，自動繪出OJIP曲線并給出26個OJIP–test參數(shù)5FluorPen專業(yè)軟件功能強大，可下載、展示葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖表，也可以通過軟件直接控制儀器進行測量6具備無人值守自動監(jiān)測功能7內(nèi)置藍(lán)牙與USB雙通訊模塊，GPS模塊，輸出帶時間戳和地理位置的葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖表8配備多種葉夾型號：固定葉夾式（適于實驗室內(nèi)暗適應(yīng)或夜間快速測量）、分離葉夾式（適用于野外暗適應(yīng)測量）、探頭式（透明光纖探頭，用于非接觸性測量監(jiān)測或光適應(yīng)條件下的葉綠素?zé)晒獗O(jiān)測）、用戶定制式等9可選配野外自動監(jiān)測式熒光儀，防水防塵設(shè)計1.5.3測量程序與功能·Ft：瞬時葉綠素?zé)晒?暗適應(yīng)完成后Ft＝F0·QY：量子產(chǎn)額，表示光系統(tǒng)II的效率，等于Fv/Fm(暗適應(yīng)狀態(tài))或ΦPSII

(光適應(yīng)狀態(tài))?！JIP：快速熒光動力學(xué)曲線，用于研究植物暗適應(yīng)后的快速熒光動態(tài)變化·NPQ：熒光淬滅動力學(xué)曲線，用于研究植物從暗適應(yīng)到光適應(yīng)狀態(tài)的熒光淬滅變化過程。·LC：光響應(yīng)曲線，用于研究植物對不同光強的熒光淬滅反應(yīng)?！AR：光合有效輻射，測量環(huán)境中植物生長可以利用的400-700nm實際光強（限PAR型號）。1.5.4技術(shù)參數(shù)測量參數(shù)包括F0、Ft、Fm、Fm’、QY、QY_Ln、QY_Dn、NPQ、Qp、Rfd、PAR（限PAR型號）、Area、Mo、Sm、PI、ABS/RC等50多個葉綠素?zé)晒鈪?shù)，及3種給光程序的光響應(yīng)曲線、3種熒光淬滅曲線、OJIP曲線等OJIP–test時間分辨率為10μs（每秒10萬次），給出OJIP曲線和26個參數(shù)，包括F0、Fj、Fi、Fm、Fv、Vj、Vi、Fm/F0、Fv/F0、Fv/Fm、Mo、Area、FixArea、Sm、Ss、N、Phi_Po、Psi_o、Phi_Eo、Phi–Do、Phi_Pav、PI_Abs、ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC、DIo/RC等測量程序：Ft、QY、OJIP、NPQ1、NPQ2、NPQ3、LC1、LC2、LC3、PAR（限PAR型號）、Multi無人值守自動監(jiān)測葉夾類型：FP110/S固定葉夾式、FP110/D分離葉夾式、FP110/P探頭式、FP110/X用戶定制式PAR傳感器（限PAR型號）：80o入射角余弦校正，讀數(shù)單位μmol(photons)/m2.s，可顯示讀數(shù)，檢測范圍400-700nm測量光：每測量脈沖最高0.09μmol(photons)/m2.s，10-100%可調(diào)光化學(xué)光：10-1000μmol(photons)/m2.s可調(diào)飽和光：最高3000μmol(photons)/m2.s，11-100%可調(diào)光源：標(biāo)準(zhǔn)配置藍(lán)光455nm，可根據(jù)需求配備不同波長的LED光源檢測器：PIN光電二極管，667–750nm濾波器尺寸大小：超便攜，手機大小，134×65×33mm（不包括探頭），重量僅188g數(shù)據(jù)存儲：容量16Mb，可存儲149000數(shù)據(jù)點顯示與操作：圖形化顯示，雙鍵操作，待機5分鐘自動關(guān)閉供電：2000mA可充電鋰電池，USB充電，可連續(xù)工作48小時，低電報警工作條件：0–55℃，0–95%相對濕度（無凝結(jié)水）存貯條件：-10–60℃，0–95％相對濕度（無凝結(jié)水）通訊方式：藍(lán)牙+USB雙通訊模式，藍(lán)牙在20m距離最大傳輸速度3MbpsGPS模塊：內(nèi)置，最高精度1.5m軟件：FluorPen1.1專用軟件，用于數(shù)據(jù)下載、分析和圖表顯示，輸出Excel數(shù)據(jù)文件及熒光動力學(xué)曲線圖，適用于Windows7及更高操作系統(tǒng)1.6選題目的意義及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析1.6.1研究目的意義水稻的葉色和葉形研究也是相對較多，通常覺得這是葉綠體合成或者降解過程發(fā)生變異所導(dǎo)致的，根據(jù)統(tǒng)計控制水稻葉綠素合成和含量的相關(guān)基因超過150多個，針對突變體的研究有利于了解控制性狀的相關(guān)分子機制，這也能提高對水稻遺傳研究，便于提高水稻的育種率和產(chǎn)率。本文研究的是在高光照脅迫下，os930突變體與野生型中花11在幼苗階段，葉綠素相關(guān)參數(shù)的差異，幼苗葉片中葉綠素的生長直接決定了成熟水稻的生長，進而影響水稻的產(chǎn)量，葉綠素含量是綠色葉片植物最常見的生理指標(biāo)之一，植物同化作用產(chǎn)量的多少取決于光合作用，受到全球變暖的影響，地球夏季跨越的時間越來越長，而隨之到來的就是長時間的強烈的光照和高溫，稻米作為人類賴以生存的糧食之一，我們有必要根據(jù)環(huán)境的改變研究出最適應(yīng)于未來環(huán)境的水稻。1.6.2水稻脅迫分析研究現(xiàn)狀近幾年，水稻脅迫分析研究相對較多，有干旱脅迫，高溫脅迫，酸堿脅迫，缺鉀脅迫，鎘脅迫等金屬脅迫。而沒有人研究高光照脅迫，并且是針對生長12天的幼苗，他們都是基于基因?qū)用孀龅难芯?，我們是直接研究葉綠素參數(shù)，用手持葉綠素?zé)晒鈨x測量水稻幼苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，這一技術(shù)能夠快速檢測，成本低，能夠?qū)崟r顯示測量結(jié)果。葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)能夠檢測到葉片對光能的利用效率和電子的傳遞過程，具有反映“內(nèi)在性”的特點，在很大程度上推動了植物光合作用的研究。因此，葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)被稱為研究植物光合功能的快速、無損傷的敏感探針，使它迅速在植物各種抗性生理、高產(chǎn)生理、作物育種栽培、植物生態(tài)、甚至植物遙感遙測等不同植物學(xué)分支和農(nóng)學(xué)中得到廣泛的應(yīng)用。

2材料與方法2.1實驗材料和儀器本實驗所用的水稻組合為S1（os930突變體）、S2（中花11），種子由實驗老師提供。1/2MS培養(yǎng)基，75%酒精，甲酮溶液，無菌水，電子天平，加熱電爐，暗培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)箱，手持式葉綠素?zé)晒鈨x。2.2實驗方法2.2.1培養(yǎng)基的制備及滅菌準(zhǔn)確稱取19.725g加熱溶解于500ml蒸餾水中，完全溶解后分裝至試管中，每只試管15ml左右。將試管和蒸餾水一起放入116℃高壓滅菌30分鐘，備用。2.2.2水稻無菌苗的獲取1秈稻種子的準(zhǔn)備挑取水稻S1、S2的金黃色、顆粒飽滿的種子，人工剝?nèi)シN皮2在超凈工作臺中，用組培養(yǎng)配置75%的酒精10ml左右，將兩種秈稻種子分別放入瓶中浸洗1~2min3棄酒精，加入無菌水沖洗2~3次，每次1min4加30%NaClO至淹沒種子，輕緩晃動后浸泡15min5重復(fù)上一步驟6用滅菌的蒸餾水沖洗種子3~5次每次1min7接種到1/2MS固體培養(yǎng)基上（試管），一支試管一顆種子，分別貼好標(biāo)簽。2.2.3實驗處理將貼好標(biāo)簽的試管放入放入暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)發(fā)芽，調(diào)節(jié)溫度32℃，每隔12小時進行觀察一次，觀察水稻長生根發(fā)芽的情況，在觀察8次后發(fā)現(xiàn)水稻已成功發(fā)芽（圖一），之后移至光照培養(yǎng)箱中（添加加濕器），也需要每天進行觀察，調(diào)節(jié)第一段為光照6級、32℃、16h，第二段為光照0級、28℃、8h。培養(yǎng)7天取出如圖二。圖一圖二2.2.4葉綠素相關(guān)參數(shù)測定采用FluorPenFP手持式葉綠素?zé)晒鈨x測定，

Ft——非光化光下的實時熒光，暗適應(yīng)后Ft=Fo；

QY——PSII量子產(chǎn)量。暗適應(yīng)QY=Fv/Fm，光適應(yīng)QY=Fv’/Fm’;Fv/Fm是使用最頻繁的熒光參數(shù)。

OJIP——葉綠素?zé)晒饪焖偎矐B(tài)分析是一種簡單、非侵入性測量葉綠體功能的方法。OJIP分析可以靈敏、準(zhǔn)確的分析光化學(xué)系統(tǒng)的功能和活性。

NPQ——儀器提供2組測量程序，每組程序均有持續(xù)照光和黑暗恢復(fù)階段。NPQ測量是一種典型的量化暗適應(yīng)后樣品光化學(xué)和非光化學(xué)淬滅的工具。

LC——儀器內(nèi)置3組光曲線測量程序，每組程序的脈沖數(shù)量、持續(xù)時間以及光強均不同。LC光曲線程序?qū)B續(xù)光照下不同光強照射的樣品光合作用進行連續(xù)測量，將光合作用速率與光強聯(lián)系起來。PAR——光合有效輻射。本實驗測定Qy，PAR，OJIP，NPQ1。將所有水稻苗葉片表面擦凈，用標(biāo)準(zhǔn)葉夾將其夾住暗適應(yīng)10min后，測定上述參數(shù)，將手持式葉綠素?zé)晒鈨x通過USB連接電腦輸出帶有時間戳和地理位置的葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖表。

3結(jié)果與分析QY中花11o930突變體1234567891011120.820.770.820.820.700.810.830.820.830.820.830.81QY——PSII量子產(chǎn)量，暗適應(yīng)后QY=Fv/Fm，表示最大光化學(xué)效率，其變化由非光化學(xué)淬變效率變化引起，在非脅迫條件下，QY的變化很小，這個數(shù)值不受品種和生長環(huán)境的影響，在脅迫條件下，這個值會明顯偏小。因此這個參數(shù)經(jīng)常用作分析光合作用的指標(biāo)，由上表算出兩種水稻的QY值基本一致，由于實驗測量的誤差可以認(rèn)為QY一致，進而證實QY不受物種的影響。PAR——光合有效輻射。PAR（光合有效輻射）是對全球和陸地生態(tài)系統(tǒng)變化的關(guān)鍵研究之一，不僅是衡量生態(tài)系統(tǒng)光合作用和碳預(yù)算變化的重要數(shù)據(jù)來源，而且還是全球氣候變化的重要反映。驅(qū)動因素。測得12株水稻的光合有效輻射都為1,由于是在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，配置的是LED長生燈，光照更加充分和均勻，更適合植株生長。OJIP中花11Os930突變體123456789101112F0952683888388119647120111191111912354114769396117379656Fj323812425328837403841710135470348193725837225287073962630951Fi394032864230723437921814139794349823625037778277644080132836Fm436953108132966481491898641809378433943641257308354460534754Fm/F04.5873.7053.9304.0242.6673.7603.4033.1923.5963.2843.8003.599Psi_o0.3310.3010.1680.2020.1590.2070.1130.0800.1350.1000.1450.152PhiEo0.2590.2200.1250.1520.0990.1520.0800.0550.0980.0700.1070.109ABC/RC2.8743.0543.1053.2493.8153.3543.6364.0763.1903.1862.9663.223TR0/RC2.2482.2302.3152.4412.3842.4622.5682.7992.3032.2162.1852.200ET0/RC0.7440.6710.3980.4940.3790.5080.2910.2250.3120.2220.3180.264DI0/RC0.6270.8240.7900.8071.4310.8921.0681.2770.8870.9700.7800.823OJIP分析可以靈敏、準(zhǔn)確的分析光化學(xué)系統(tǒng)的功能和活性。結(jié)合生物膜流動理論，快速葉綠素的數(shù)據(jù)分析和處理方法OJIP（熒光誘導(dǎo)曲線），建立了——JIPtest。通過JIPtest獲得的結(jié)果可以準(zhǔn)確反映樣品中光合PSII的實際生理狀態(tài)，因此JIPtest被廣泛用于許多植物脅迫生理研究中。此處也采用這個方法得到結(jié)果反應(yīng)光合作用PSII的實際生理狀況。F0起始熒光FjJ點的熒光Fm最大熒光ABC/RC天線色素吸收的能量TR0/RC反應(yīng)中心捕獲的能量ET0/RC用于電子傳遞的能量DI0/RC用于熱耗散的能量原初光化學(xué)反應(yīng)的最大光化學(xué)效率φp0=[1-(F0/Fm)]電子傳遞的量子產(chǎn)額φE0=[1-(F0/Fm)]*(1-Vj)=Phi_Eo,吸收光量子通量中電子傳遞光量子通量比率，或稱電子傳遞光量子產(chǎn)量電子傳遞的效率φ0=1-VjPsi_o＝ψo＝ETo/TRo＝1-Vj單位面積被激活的反應(yīng)中心數(shù)量（RC/CS）RC/CS=Fm*φp0*Vj/M0在J期的相對可變熒光Vj=（F2ms-F0）/(Fm-F0)M0=4*（F2ms-F0）/(Fm-F0)根據(jù)上述公式計算得出

中花11Os930突變體平均起始熒光86078066平均最大熒光3928237862平均天線色素吸收的能量3.3953.149平均反應(yīng)中心捕獲的能量2.4312.226平均用于電子傳遞的能能量0.4640.279平均用于熱耗散的能量0.9650.865平均最大光化學(xué)效率72.0%71.9%平均電子傳遞的量子產(chǎn)額0.1430.096平均電子傳遞的效率19.5%13.3%平均單位面積被激活的反應(yīng)中心數(shù)量98995153快速熒光動力學(xué)曲線橫坐標(biāo)為時間（ms），縱坐標(biāo)代表葉綠素?zé)晒庵翟撉€表示在1秒的時間內(nèi)測量記錄約500個原始測量數(shù)據(jù)，在J相之前的0.6秒的時間內(nèi)記錄60個原始數(shù)據(jù)，做到準(zhǔn)確，高通量方便快捷的測量。

NPQ1中花11Os930突變體123456789101112F0403129582373445424053998356742263738344643242893Fm15670112811173617198669714890129391368714434109561580012126Fm_L115150109561128116743650214532124511310214207106961567011834Fo：暗適應(yīng)后的最小熒光Fm：暗適應(yīng)后的最大熒光NPQ也是非光化學(xué)淬滅。NPQ反映了天線中的色素吸收光能之后以散熱形式釋放的部分能量。散熱在抵御光造成的損壞方面起著重要作用。NPQ1=（Fm-Fm_L1）/Fm_L1可以算出每個植株的NPQ1分別為中花組：0.034，0.030，0.040，0.027，0.030，0.025，0.039，0.045Os930突變體：0.016，0.024，0.008，0.025中花組平均NPQ1=0.030Os903組平均NPQ1=0.018NPQ1代表PSII過剩激發(fā)能的熱耗散能力,NPQ的增加與PSII接受到的光保護有密切的同步現(xiàn)象,即NPQ1的能力也表示PSII受到的光保護程度.通過NPQ1值的比較,中花具有較高的NPQ能力.

4結(jié)論與展望4.1結(jié)論綠色植物通過葉綠體的內(nèi)囊體中分布的眾多色素進行光合作用，起主要作用的是葉綠素，有著吸收轉(zhuǎn)化，傳遞的作用，葉綠素?zé)晒鈪?shù)直接表示葉綠素分子的活性，通過比較葉綠素?zé)晒鈪?shù)的值也可以得出在相同脅迫條件下不同植株的光合作用效率，上述實驗結(jié)果表明兩種植株在高光照的脅迫下的QY（量子產(chǎn)量）值幾乎相同，因為這個值不受生物品種和生長環(huán)境的影響，也可以說明實驗的誤差幾乎可以忽略，通過JIPtest的分析法可以得知中花11的起始熒光，天線色素吸收的能量，反應(yīng)中心捕獲的能力，電子傳遞的效率等均高于水稻os930突變體，中花11植株的NPQ1數(shù)字也高于os930突變體，NPQ1代表著反應(yīng)中心在高光照的條件下受到的光保護程度。由此看來在高光照脅迫下中花11比水稻os930突變體更有優(yōu)勢。4.2展望葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)實現(xiàn)了能在現(xiàn)場或者野外自然條件下，以植株或者植株幼苗含有葉綠素的部分為原始材料，測定該樣本的光合作用動態(tài)變化，以及可以研究脅迫條件下對植株光合作用的影響。并且這項技術(shù)還具備眾多優(yōu)點，比如快捷靈敏，操作簡單，檢測不損壞樣本。這也使得該項技術(shù)能夠在水稻的脅迫和病理研究中取得廣泛應(yīng)用。環(huán)境脅迫會使水稻葉綠體中Fm，F(xiàn)v，ФPSII，qP，NPQ等眾多參數(shù)發(fā)生改變，有相關(guān)實驗證明有一定的相關(guān)關(guān)系，可以作為水稻的某種指標(biāo)。以后也可以加強對下面幾方面的研究，第一結(jié)合遙感技術(shù)，研究出可以實時檢測水稻生長的狀況。第二，提高儀器的準(zhǔn)確度和可靠性，改進相對于軟件的用戶上手度以及軟件數(shù)據(jù)統(tǒng)計頁面的條理性和可操作性。第三，分析不同的熒光分別來自光合系統(tǒng)的那個部位和各種熒光參數(shù)直間的具體關(guān)系和機理。參考文獻(xiàn)PAGE19參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)[1]賈朝凱.兩個水稻葉突變體的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)研究[D].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),2020.[2]張超,鄭恩楠,鄧聰.控制灌溉水稻熒光參數(shù)變化、根系特征及產(chǎn)量效應(yīng)分析[J].吉林水利,2020(11):1-7.[3]周春艷.植物葉片葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)成像探測方法與應(yīng)用研究[D].西安理工大學(xué),2019.[4]王蘭蘭,李琦,宋曉卉,楊笛,劉靜華,高嘉,欒思慧.環(huán)境條件對植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響研究進展[J].沈陽師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2019,37(04):362-367.[5]王秋瑩,李雪,杜林方.水稻STN7激酶突變體的光合生理特性分析[J].四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2019,56(03):558-562.[6]孫亞莉.水稻種子萌發(fā)與幼苗期對鎘脅迫的響應(yīng)差異研究[D].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2