分析化學22 (2)課件

分析化學第22章

毛細管電泳法

CapillaryElectrophoresis,CE毛細管電泳是帶電粒子在電場力的驅動下，在毛細管中按其淌度或和分配系數(shù)不同進行高效、快速分離的電泳新技術，也稱為高效毛細管電泳。

20世紀30－40年代蒂塞利烏斯(A.W.K.Tiselius）建立了移動界面電泳，將電泳發(fā)展成分離技術獲得1948年諾貝爾化學獎

1981年J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs實驗上和理論上為毛細管電泳的發(fā)展奠定了基礎。上一世紀后二十多年分析化學領域中發(fā)展最迅速的分離分析方法。

第22章

毛細管電泳

22－1毛細管電泳的原理

1裝置

毛細管數(shù)據(jù)處理電極檢測器電極試樣緩沖液緩沖液

高壓電源

（可高至30KV）

第22章毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

2電泳和電滲

電泳是指在電場作用下，溶液中的帶電粒子作定向移動的現(xiàn)象。電滲是指在電場作用下，毛細管或固相多孔物質內液體沿固體表面移動的現(xiàn)象。第22章

毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

2電泳和電滲

電泳行為與特性使用淌度描述

即單位場強(E)下離子的平均電泳速度υ

μep=υ/E實驗中，只發(fā)生電泳時有效淌度μef=υef﹒

(L/V)=(

l/tm)﹒(L/V)

毛細管有效長度遷移時間毛細管總長度電壓固液兩相間的總電勢-熱力學電勢-φ0Zeta電勢-ζ

第22章毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

2電泳和電滲

電滲流的流型特點電滲流HPLC塞流層流

第22章毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

2電泳和電滲

電滲流的表示電滲流的大小可用淌度(μeo)或電滲流系數(shù)表示

μeo=υeo/E=l/(teo﹒E)電滲流速度毛細管有效長度

電滲流流出時間

電場強度第22章毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

2電泳和電滲

改變電滲流的方法改變外加徑向電場改變緩沖液成分和濃度Zeta電勢改變緩沖液pH加入添加劑改變溫度

粘度

鹽-離子強度表面活性劑μeo正比于Zeta電勢和介質的介電常數(shù)反比于介質的黏度Zeta電勢正比于雙電層厚度和界面有效電荷密度反比于介質的介電常數(shù)表觀電泳淌度

μap

μap=υap/E

υap為離子的表觀遷移速度

υap=υef+υeo

μap=μef+μeo第22章毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

2電泳和電滲

第22章毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

3分離效率和分離度

分離效率柱效可以用理論塔板數(shù)n表示

n=(μep+μeo)Vl/(2DL)

毛細管電泳分離的柱效方程

理論塔板高

H=L/n

n=5.54(χ/W?)2實驗上可按上式求出理論塔板數(shù)χ為電泳圖上從起點至電泳峰最大值之間的距離W?為電泳峰的半高峰寬

分離度計算式Rs=2(tm2-tm1)/(W1+W2)tm1、tm2分別為兩個組份的遷移時間W

為峰底的寬度

第22章毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

3分離效率和分離度

第22章毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

區(qū)帶寬度

Ws=（Wt﹒l/tm）-Wd

時間寬度檢測器的窗口寬度空間寬度第22章毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

區(qū)帶寬度展寬因素

焦耳熱進樣電泳擴散毛細管壁對組分的吸附

進樣

試樣導入毛細管柱時，總有一定的試樣區(qū)帶長度。細內徑的毛細管柱時，進樣操作的要求更為嚴格。一般進樣區(qū)帶控制在柱長的1%電泳擴散

試樣區(qū)帶中的緩沖溶液濃度或電阻率與毛細管其它地方的濃度或電阻率不相等時，因兩個區(qū)域電場強度的差異，而引起區(qū)帶電分散。μs---μb

峰前展或拖尾？第22章毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

毛細管壁對組分的吸附

電泳峰拖尾或變形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：●使用極端pH條件●加入中性鹽或兩性離子化合物●對毛細管內壁進行涂層處理

需要注意：方法也會抑制或改變電滲流

第22章毛細管電泳22－1毛細管電泳的原理

4區(qū)帶寬度及其展寬因素

第22章毛細管電泳

22－2分離模式

1毛細管區(qū)帶電泳2膠束電動色譜3毛細管凝膠電泳4毛細管等速電泳5毛細管等電聚焦6毛細管電色譜第22章毛細管電泳22－2分離模式

2膠束電動色譜電動色譜:是以電滲流驅動的一種色譜技術膠束電動色譜MEKC:是以膠束為假固定相的一種電動色譜，是電泳技術和色譜技術的結合加入高于膠束臨界濃度的表面活性劑膠束電動色譜的應用特點:使毛細管電泳不僅能分離離子化合物，而且還能分離中性化合物.比高效液相色譜更為高效.

HPLC分離柱效為5000－25000理論板數(shù)/mMEKC可達到50000－500000理論板數(shù)/m比高效液相色譜更為高速.MEKC分離時間通常小于30min，但達到相仿效率的毛細管LC，需要更長的時間。

第22章毛細管電泳22－2分離模式

2膠束電動色譜第22章毛細管電泳22－2分離模式

4毛細管等速電泳分離是建立在試樣中各組分的電泳淌度不同，等速電泳中被分析試樣進樣前后分別使用前導電解質溶液和終結電解質溶液，分離后的各組分區(qū)帶以相同的電泳遷移速度通過檢測窗口。

第22章毛細管電泳22－2分離模式

4毛細管等速電泳注意:前導電解質的電泳淌度應高于試樣中各組分的電泳淌度，而終結電解質的電泳淌度則反之。電泳過程中被分離各組分的濃度都將接近前導電解質濃度，對痕量組分在柱上濃縮可達幾個數(shù)量級，成為重要的柱上濃縮技術之一。第22章毛細管電泳22－2分離模式

4毛細管等速電泳第22章毛細管電泳22－2分離模式

5毛細管等電聚焦CIEF:建立在不同蛋白質或多肽之間等電點（pI值）差異基礎上的分離方法。蛋白質的等電點(pI):指蛋白質分子的表觀電荷數(shù)為零時的pH值。

方法:

進樣－等電聚焦－檢測先將脫鹽的試樣（蛋白質）以≥1％的濃度與兩性電解質溶液混合，用壓力進樣充入毛細管柱(陽極端)，置于陽極電解質溶液如H3PO4中，檢測端為陰極端，置于陰極電解質如NaOH中。施加電壓，進行電泳實驗。兩性電解質離子形成pH的位置梯度，而蛋白質在遷移時會在其等電點的pH區(qū)域內停止移動。這樣pI不同的蛋白質各組分會在毛細管內很窄的不同pH區(qū)域內聚焦.在陽、陰極電解液中加入鹽如NaCI或NaOH,破壞pH梯度，使各組分蛋白質重新帶電，在電場力作用下發(fā)生遷移、檢測，使不同組分的蛋白質得到分離。第22章毛細管電泳22－2分離模式

5毛細管等電聚焦特點:等電聚焦實際上也是一個試樣濃縮過程，這一過程可用于濃縮試樣組分。具有極高的分辯率，可以分離等電點相差0.01pH的兩種蛋白質.注意:電滲流的存在會破壞聚焦區(qū)帶的穩(wěn)定

第22章毛細管電泳22－2分離模式

5毛細管等電聚焦第22章毛細管電泳22－2分離模式

6毛細管電色譜CEC:以電滲流驅動流動相，開管和填充兩種比高效液相色譜具有更高的柱效

第22章

毛細管電泳

22－3進樣與檢測1進樣方法電動進樣

也稱電遷移進樣.

方法:將毛細管的進樣端插入裝有試樣溶液的試樣管中，試樣管中插入電極，與檢測端的緩沖液間施加進樣電壓，并維持一定時間，試樣溶液在電泳和電滲流作用下進入毛細管，然后再將試樣溶液換成載體緩沖液，電泳即可進行。

第22章毛細管電泳22－3進樣與檢測

1進樣方法

流體動力學進樣也稱為虹吸進樣、重力進樣、壓差進樣方法:毛細管進樣端插入試樣溶液容器，通過進樣端加壓，或檢測端出口減壓，或調節(jié)進樣端試樣溶液液面大于出口端緩沖液液面高度，利用虹吸現(xiàn)象，使進樣口端與出口端形成正壓差，并維持一定時間，試樣在壓差作用下進入毛細管進樣端，再把進樣端放回緩沖液液槽中，進行電泳

第22章毛細管電泳22－3進樣與檢測

2檢測方法

紫外吸收檢測器第二十二章毛細管電泳22－3進樣與檢測

2檢測方法

檢測器檢出限（mol/L）特

點UV－可見吸收10-5－10-6近似通用，常規(guī)應用熒光非相干光誘導