小容量注射劑藥液微生物污染水平測試及工藝時間限確定

小容量注射劑藥液微生物污染水平測試及工藝時間限確定第1頁/共67頁小容量注射劑藥液微生物污染水平測試及工藝時間限度確定

第2頁/共67頁一、概述二、試驗?zāi)康娜?、試驗方案四、試驗結(jié)果及討論五、污染菌鑒定六、注意事項第3頁/共67頁一、概述在無菌藥品的生產(chǎn)中，防止微生物污染一直是生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注重點。無菌是注射劑的主要質(zhì)量要求和安全性指標(biāo)之一。按照藥典進(jìn)行無菌檢查是存在局限性的：污染率越低，同樣的取樣量誤將產(chǎn)品判為合格的概率越高；在同一個污染率下，取樣量越大，以無菌實驗結(jié)果判斷批產(chǎn)品無菌的可信度就越高。第4頁/共67頁一、概述但是，對于污染率極低（如1%）的批產(chǎn)品，即使加大取樣數(shù)，提高的可信度也是微不足道的。同時，過多的取樣量也增加了實驗過程的污染概率，對無菌實驗結(jié)果的判斷同樣造成影響。從無菌藥品生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)分析存在微生物污染的因素，有利于進(jìn)行微生物污染控制，從而保證藥品的無菌水平。第5頁/共67頁一、概述藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）無菌藥品附錄第五十七條

應(yīng)當(dāng)盡可能縮短藥液從開始配制到滅菌（或除菌過濾）的間隔時間。應(yīng)當(dāng)根據(jù)產(chǎn)品的特性及貯存條件建立相應(yīng)的間隔時間控制標(biāo)準(zhǔn)。第6頁/共67頁二、試驗?zāi)康脑谝欢ǖ臈l件下，微生物將根據(jù)時間成幾何級數(shù)的增長，因此“微生物污染水平監(jiān)測”實質(zhì)也是一種時間間隔管理的實施方法。我們通過檢測藥液稀配后至滅菌前生產(chǎn)過程不同時段藥液的微生物數(shù)量，建立微生物隨時間的變化趨勢關(guān)系，找到達(dá)到污染控制限度的時間點，預(yù)留一定的安全時間作為內(nèi)部控制時限要求。第7頁/共67頁二、試驗?zāi)康臒o菌藥品滅菌與滅菌前產(chǎn)品的微生物污染程度有關(guān)，對滅菌前微生物污染狀況進(jìn)行檢控是對產(chǎn)品作無菌評價的先決條件。本次試驗?zāi)M生產(chǎn)品種：XX注射液，規(guī)格：5ml，生產(chǎn)批量：12萬支，灌裝時間：8h，滅菌：6柜次。第8頁/共67頁二、試驗?zāi)康某宋⑸锵嚓P(guān)要求外，必須指出，部分產(chǎn)品在溶液或其他狀態(tài)下存在不穩(wěn)定性，極易降解，產(chǎn)生新的雜質(zhì)，因此基于藥品化學(xué)穩(wěn)定性的時間管理，也是確定存放時限的制定依據(jù)。第9頁/共67頁三、試驗方案（一）成立試驗小組，明確職責(zé)1、小組成員：組長：質(zhì)量負(fù)責(zé)人成員：QA、QC、針劑車間2、職責(zé)2.1組長負(fù)責(zé)審批。第10頁/共67頁三、試驗方案2.2QA負(fù)責(zé)起草試驗方案和報告試驗過程取樣和環(huán)境監(jiān)測（生產(chǎn)全過程沉降菌和生產(chǎn)前中后塵埃粒子、風(fēng)速、溫濕度）。負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)工作，以保證按規(guī)定項目順利實施。負(fù)責(zé)現(xiàn)場監(jiān)督。負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)及結(jié)果的審核。第11頁/共67頁三、試驗方案2.3QC微生物檢驗實驗的準(zhǔn)備及測試工作。負(fù)責(zé)根據(jù)檢驗結(jié)果出具檢驗報告單。2.4針劑車間負(fù)責(zé)指定操作人員和清潔人員。負(fù)責(zé)按照生產(chǎn)工藝規(guī)程和操作SOP進(jìn)行操作。第12頁/共67頁三、試驗方案（二）確定風(fēng)險點無菌檢查并不能保證最終滅菌產(chǎn)品的無菌狀態(tài)。應(yīng)當(dāng)把成品的無菌檢查看做確保無菌的一系列控制措施中的最后一項措施。因此，滅菌前產(chǎn)品的微生物控制應(yīng)當(dāng)作為生產(chǎn)中最重要的質(zhì)量保證措施和正常生產(chǎn)的先決條件。第13頁/共67頁三、試驗方案我公司XX小容量注射劑為最終滅菌制劑，5ml生產(chǎn)線關(guān)鍵生產(chǎn)工藝流程為：稱量、濃配、超濾、稀配定容、過濾（微生物負(fù)載濾器）、除菌過濾、灌裝、滅菌檢漏。第14頁/共67頁三、試驗方案第15頁/共67頁三、試驗方案經(jīng)過分析，對成品無菌可能產(chǎn)生影響的關(guān)鍵點為稀配液微生物污染水平，包括稀配結(jié)束時的稀配液、灌裝完成過程的稀配液、灌裝即將結(jié)束時的稀配液；灌裝液微生物污染水平，包括灌裝開始時的灌裝藥液、灌裝過程的灌裝藥液、灌裝即將完成時的灌裝藥液；滅菌前藥液微生物污染水平。第16頁/共67頁三、試驗方案（三）制定取樣計劃本次試驗計劃模擬灌裝的時間為8小時，根據(jù)灌裝機(jī)的灌裝能力，確定生產(chǎn)批量為12萬支，滅菌6柜次，按照xx注射液工藝規(guī)程組織生產(chǎn)。對生產(chǎn)當(dāng)天的注射用水進(jìn)行微生物限度檢查，生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測：溫度、濕度、塵埃粒子（生產(chǎn)前、生產(chǎn)過程、生產(chǎn)結(jié)束）、風(fēng)速（生產(chǎn)前、生產(chǎn)結(jié)束）沉降菌（生產(chǎn)全過程），人員5指手套，接觸碟表面微生物（生產(chǎn)結(jié)束）第17頁/共67頁三、試驗方案1、取樣點及取樣頻次樣品1：稀配罐內(nèi)的稀配液，自稀配定容結(jié)束后至生產(chǎn)結(jié)束，每隔1小時取樣檢測一次微生物量樣品2：除菌過濾之前的藥液，即自微生物負(fù)載濾器過濾后的藥液，自灌裝開始至灌裝結(jié)束，每隔1小時取樣檢測一次微生物量第18頁/共67頁三、試驗方案樣品3：灌裝后的藥品，即除菌過濾后的藥液，自灌裝開始至灌裝結(jié)束，每隔1小時取樣檢測一次微生物量樣品4：滅菌前藥液，即滅菌前放置時間最長的藥液，取第一鍋和最后一鍋分別檢測微生物量樣品5：待滅菌藥液放置1小時后，取第一鍋和最后一鍋待滅菌時間最長的藥液，滅菌程序啟動后再放置一小時后檢測微生物量第19頁/共67頁三、試驗方案第20頁/共67頁三、試驗方案第21頁/共67頁三、試驗方案2、樣品標(biāo)簽第22頁/共67頁三、試驗方案3、依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文件《藥品GMP指南》無菌藥品《藥品生產(chǎn)驗證指南》2003年版《中華人民共和國藥典》2010年版《XX注射液工藝規(guī)程》第23頁/共67頁三、試驗方案《現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)微生物實驗室質(zhì)量管理與驗證技術(shù)》4、取樣器具取樣瓶為250ml無菌玻璃磨口瓶。第24頁/共67頁三、試驗方案（四）檢驗方法采用薄膜過濾法進(jìn)行藥液的微生物限度檢查。取濾膜孔徑

0.45μm，直徑為75mm的一次性全封閉薄膜過濾器（北京牛牛基因技術(shù)有限公司，濾器類型：NS01-75D1），將過濾器逐一插放在濾液槽座上，將其塑膠軟管裝入集菌儀的蠕動泵的管槽內(nèi)，注意定位準(zhǔn)確，軟管走勢順暢。第25頁/共67頁三、試驗方案其進(jìn)液軟管的雙芯針頭插入供試液容器的塞上，開啟集菌儀，將供試液容器倒置，使藥液均勻通過濾器，濾凈。打開過濾器菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基制備一張濾膜。細(xì)菌培養(yǎng)3天，霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)，必要時，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間至7天進(jìn)行菌落計數(shù)并報告。第26頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論（一）微生物污染水平檢測結(jié)果見下表第27頁/共67頁第28頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論樣品1：稀配罐內(nèi)的稀配液，稀配定容后至生產(chǎn)結(jié)束，每隔1小時取樣檢測一次微生物量，微生物量隨時間變化的趨勢圖如下：第29頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論第30頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論討論：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小時在稀配罐分別取樣進(jìn)行微生物限度檢查，在第5小時后開始檢出微生物，數(shù)量為8cfu/100ml，隨時間增長微生物數(shù)量呈上升趨勢。在生產(chǎn)即將結(jié)束時檢測藥液的微生物數(shù)為369cfu/100ml。第31頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論根據(jù)頗爾的除菌過濾器的過濾效果的驗證，理論上定容后的藥液的載菌量為：6.0×1010cfu，（除菌過濾器至少能達(dá)到107/cm2過濾面積濃度的缺陷假單胞菌，過濾面積為0.6m2）在除菌過濾器的除菌能力范圍內(nèi)。我公司工藝驗證規(guī)定微生物限度檢查結(jié)果應(yīng)小于10cfu/ml。第32頁/共67頁我們通過檢測稀配罐藥液在生產(chǎn)過程不同時段藥液的微生物數(shù)量，8小時可以作為稀配液污染控制限度的時間點。第33頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論樣品2：除菌過濾之前的藥液，即自微生物負(fù)載濾器過濾后的藥液，自灌裝開始至灌裝結(jié)束，每隔1小時取樣檢測一次微生物量，微生物量隨時間變化的趨勢圖如下：第34頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論第35頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論討論：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小時對0.22μm微生物負(fù)載過濾器過濾后的藥液分別取樣進(jìn)行微生物限度檢查，在第6小時后開始檢出微生物，并隨時間增長呈上升趨勢。在生產(chǎn)即將結(jié)束時檢測藥液的微生物量為7cfu/100ml，符合除菌過濾前藥液小于10cfu/100ml微生物負(fù)荷要求。第36頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論我們通過檢測除菌過濾前的藥液在生產(chǎn)過程不同時段的微生物數(shù)量，8小時可以作為除菌過濾前藥液污染控制限度的時間點，可以將7小時作為預(yù)留的安全時間作為內(nèi)部控制時限要求。第37頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論樣品3：灌裝后的藥品，即除菌過濾后的藥液，自灌裝開始至灌裝結(jié)束，每隔1小時取樣檢測一次微生物量，微生物量隨時間變化的趨勢圖如下：第38頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論第39頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論討論：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小時灌裝藥液分別取樣進(jìn)行微生物限度檢查，在第7小時后開始檢出微生物，并隨時間增長呈上升趨勢。在生產(chǎn)即將結(jié)束時檢測藥液的微生物數(shù)為50cfu/100ml，藥品的載菌量為2cfu/支。符合100cfu/100ml的滅菌前藥液的微生物數(shù)量。第40頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論我們通過檢測灌裝藥液在生產(chǎn)過程不同時段的微生物數(shù)量，8小時可以作為灌裝藥液污染控制限度的時間點，可以將6小時作為預(yù)留的安全時間作為內(nèi)部控制時限要求。第41頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論樣品4：滅菌前藥液，即滅菌前放置時間最長的藥液，第一鍋滅菌前藥液微生物數(shù)量為0，第六鍋滅菌前藥液微生物數(shù)量為37cfu/100ml，符合100cfu/100ml的滅菌前藥液的微生物數(shù)量。第42頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論樣品5：待滅菌藥液放置1小時后，取第一鍋和最后一鍋待滅菌時間最長的藥液，滅菌程序啟動后再放置一小時后檢測微生物量，第一鍋待滅菌放置1小時后微生物數(shù)量為3cfu/100ml，第六鍋待滅菌放置1小時后微生物數(shù)量為118cfu/100ml，已經(jīng)超過100cfu/100ml的滅菌前藥液的微生物數(shù)量。第43頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論我們通過檢測滅菌前藥液和待滅菌藥液放置1小時后的藥液的微生物數(shù)量，9小時可以作為稀配至滅菌污染控制限度的時間點，可以將7小時作為預(yù)留的安全時間作為內(nèi)部控制時限要求。第44頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論污染控制限度的時間點和內(nèi)部控制時限匯總表第45頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論確定微生物污染內(nèi)部控制內(nèi)部時限：稀配定容至灌裝結(jié)束時限為6小時，灌裝開始至滅菌結(jié)束時限為7小時，每次最長待滅菌時限為3小時。第46頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論（二）其他檢測結(jié)果生產(chǎn)當(dāng)天的注射用水微生物限度檢查結(jié)果0，標(biāo)準(zhǔn)10cfu/100ml，符合規(guī)定。灌裝間生產(chǎn)環(huán)境：溫度、濕度、塵埃粒子（生產(chǎn)前、生產(chǎn)過程、生產(chǎn)結(jié)束）、風(fēng)速（生產(chǎn)前、生產(chǎn)結(jié)束）沉降菌（生產(chǎn)全過程），人員5指手套，接觸碟表面微生物（生產(chǎn)結(jié)束）結(jié)果均符合規(guī)定。第47頁/共67頁四、試驗結(jié)果及討論（三）最終成品檢驗情況成品按照滅菌柜次檢驗無菌和熱原，結(jié)果均符合規(guī)定。第48頁/共67頁五、污染菌鑒定微生物鑒定程序（參見《現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)微生物實驗室質(zhì)量管理與驗證技術(shù)》P205）（一）原則微生物鑒別應(yīng)遵循逐步縮小范圍的原則，用細(xì)菌分類學(xué)的知識和操作步驟，一步一步的將未知微生物逐步落實到科、屬，然后選擇相應(yīng)的數(shù)碼鑒定系統(tǒng)將未知微生物鑒定到種。第49頁/共67頁五、污染菌鑒定鑒定包括以下幾個環(huán)節(jié)：1、菌株采集；2、菌株純化；3、菌落形態(tài)學(xué)觀察如形狀、大小、色澤；4、細(xì)胞形態(tài)觀察如球狀、桿狀、螺旋狀、弧狀、絲狀及其排列方式；5、革蘭染色反應(yīng)，陽性或陰性；6、氧化與發(fā)酵試驗；7、接觸酶與氧化酶試驗；8、鞭毛與動力等等。第50頁/共67頁五、污染菌鑒定通過上述基礎(chǔ)實驗結(jié)果再結(jié)合細(xì)菌鑒定檢索表從而確定微生物所屬范圍，并選擇合適的數(shù)值分類鑒別試驗條（API試驗條）將微生物鑒定到種。第51頁/共67頁五、污染菌鑒定第52頁/共67頁五、污染菌鑒定細(xì)菌鑒定檢索表包含細(xì)菌鑒定時所涉及的基本定向生化鑒別試驗，根據(jù)這些定向生化試驗?zāi)転榇蟛糠治粗蔫b定選擇合適API試紙條。第53頁/共67頁五、污染菌鑒定如何根據(jù)這張鑒定表來選擇所使用方法的步驟：1、純化、分離待鑒定菌無菌操作用接種環(huán)挑取待鑒定菌落或少許含菌溶液到相應(yīng)的培養(yǎng)基上（如：TSA）劃線分離，以純化至單菌落。2、挑取純化后單菌落做革蘭染色、鏡檢，以確定待鑒定菌的革蘭屬性。第54頁/共67頁五、污染菌鑒定3、如鏡檢結(jié)果為革蘭陰性桿菌，則先進(jìn)行發(fā)酵實驗。如發(fā)酵實驗結(jié)果為陰性，則選用API20NE試劑條進(jìn)行鑒定；如發(fā)酵實驗結(jié)果為陽性，則在經(jīng)過細(xì)胞色素氧化酶實驗后選用API20E試劑條進(jìn)行鑒定。4、如鏡檢結(jié)果為革蘭陽性球菌，則先進(jìn)行過氧化氫酶實驗。如實驗結(jié)果為陰性則選用APIStrep試劑條進(jìn)行鑒定，如實驗結(jié)果為陽性則選用APIStaph試劑條進(jìn)行鑒定。第55頁/共67頁五、污染菌鑒定5、假如鏡檢結(jié)果為革蘭陽性桿菌并且有內(nèi)生芽胞，則選用API50CHB試劑條進(jìn)行鑒定；否則，根據(jù)運(yùn)動性實驗和過氧化氫酶實驗結(jié)果選用APICoryne或其他試劑條進(jìn)行鑒定。6、表中未列出的其他試劑條API20A試劑條可用于鑒定厭氧菌。API20CAUX試劑條可用于鑒定酵母菌。第56頁/共67頁五、污染菌鑒定7、選定正確的試劑條后，根據(jù)不同的API試劑條的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程準(zhǔn)備接種物，進(jìn)行接種、培養(yǎng)等操作并將結(jié)果形成數(shù)碼，用API鑒定軟件鑒定或查詢待檢菌的名稱均可。鑒定結(jié)果應(yīng)記錄，必要時，給出相應(yīng)解釋。第57頁/共67頁五、污染菌鑒定（三）革蘭染色試驗在細(xì)菌鑒定過程中，需要最先完成的一些實驗稱為基本定向生化試驗。介紹革蘭染色實驗的原理、操作步驟和試劑配制的內(nèi)容。第58頁/共67頁五、污染菌鑒定1、原理由于革蘭陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁較厚，細(xì)胞壁中的肽聚糖含量高且網(wǎng)格結(jié)構(gòu)緊密，含脂量又低，當(dāng)用結(jié)晶紫復(fù)合溶液染色細(xì)胞后用脫色劑脫色時，引起了細(xì)胞壁肽聚糖層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑縮小以致關(guān)閉，從而阻止了結(jié)晶紫-碘復(fù)合物的逸出，故而菌體呈現(xiàn)深紫色；第59頁/共67頁五、污染菌鑒定而革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，含脂量又高，當(dāng)用酒精脫色時，脂類物物質(zhì)被溶解，細(xì)胞壁通透性增大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被抽提出來，從而使菌體呈現(xiàn)復(fù)染液的紅色。第60頁/共67頁五、污染菌鑒定2、染色液的配制2.1結(jié)晶紫染液將A液（結(jié)晶紫2.0g溶于20ml95%乙醇中）與B液（草酸銨0.8g溶于80ml蒸餾水）混合，靜置48小時后過濾。第61頁/共67頁五、污染菌鑒定2.2盧戈碘液取碘化鉀2.0g溶于5m