沉淀分離技術(shù)課件

沉淀分離技術(shù)沉淀（precipitation）：在溶液中加入沉淀劑使溶質(zhì)的溶解度降低，形成固相從溶液中析出，從而達(dá)到分離的一種技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：過程簡單、成本低、原料易得、便于小規(guī)模生產(chǎn)缺點(diǎn)：過濾困難、產(chǎn)品質(zhì)量較低、需重新精制鹽析有機(jī)溶劑沉析等電點(diǎn)沉析有機(jī)聚合物沉析其他沉析技術(shù)一、鹽析原理

溶液加入高濃度中性鹽后，鹽離子與生物分子表面的帶相反電荷的離子基團(tuán)結(jié)合，中和了生物分子表面的電荷，降低了生物分子與水分子之間的相互作用，生物分子表面水化膜逐漸被破壞，當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定的限度時，生物分子之間的排斥力降到很小，此時生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，從而形成沉淀從溶液中析出。產(chǎn)生鹽析的另一個原因是大量鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度，使生物分子脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域的相互作用，使其沉淀析出。

影響鹽析的因素（p95-96）（一）鹽離子濃度在低鹽濃度時，鹽離子能增加生物分子表面電荷，使生物分子水合作用增強(qiáng)，具有促進(jìn)溶解的作用，稱鹽溶現(xiàn)象。當(dāng)鹽濃度達(dá)一定值后,鹽濃度升高，生物分子溶解度不斷降低,產(chǎn)生了鹽析作用,不同的生物分子，“鹽溶”與“鹽析”的分界值不同。（二）生物分子種類生物分子的分子結(jié)構(gòu)不同，其分子表面親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)不相同，不同生物分子產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象所需中性鹽的濃度（離子強(qiáng)度）亦不同。（三）生物分子濃度溶液中生物分子的濃度對鹽析的效果有很大的影響，要得到理想的沉析效果，必須將生物分子的濃度控制在一定的范圍內(nèi)。一般對于蛋白質(zhì)溶液，其濃度為2%～3%比較合適。鹽析的操作與應(yīng)用（一）鹽析的操作1、鹽的處理硫酸銨使用時要求純度較高，生產(chǎn)時為降低成本，一般選用化學(xué)純的硫酸銨，在使用前應(yīng)進(jìn)行預(yù)處理，可通過化學(xué)法將重金屬除去（如通入H2S后過濾），再將硫酸銨重結(jié)晶備用。2、加鹽的方法（1）直接加入固體硫酸銨法（2）加入飽和硫酸銨溶液法3、鹽析操作注意事項(xiàng)（1）鹽析反應(yīng)完全需要一定時間，一般硫酸銨全部加完后，應(yīng)放置30min以上才可進(jìn)行固-液分離。（2）經(jīng)過一次分級得到的鹽析沉淀，能否進(jìn)行第二次鹽析要靠試驗(yàn)確定。（3）鹽析操作時加入鹽的純度、加量、加入方法、攪拌的速度、溫度及pH等參數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制。

（4）鹽析時生物分子濃度要合適，應(yīng)充分考慮共沉及稀釋后收率、鹽量和固-液分離等問題。一般低濃度硫酸銨可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法，因?yàn)楦邼舛攘蛩徜@密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來需要較高的離心速率和較長的離心時間。

（5）鹽析后溶液應(yīng)進(jìn)行脫鹽，常用的辦法有透析、凝膠過濾及超濾等。

二、有機(jī)溶劑沉析原理（一）親水性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，使溶質(zhì)分子周圍的水化層變薄，導(dǎo)致脫水而相互聚集析出，也就是降低了溶質(zhì)的溶解度。（二）有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，加入有機(jī)溶劑后，整個溶液的介電常數(shù)降低，帶電的溶質(zhì)分子之間庫侖引力增強(qiáng)，使溶質(zhì)分子相互吸引而聚集。影響有機(jī)溶劑沉析的因素（一）溫度大多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此有機(jī)溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，一般在0℃以下，操作時要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑必須緩慢，并不斷攪拌以免局部濃度過濃。溫度越低，得到的生物活性物質(zhì)越多，而且可以減少有機(jī)溶劑的揮發(fā)。（二）生物樣品的濃度與鹽析相似，樣品濃度低時增加有機(jī)溶劑投入量和損耗，降低了溶質(zhì)回收率，易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉的作用小，有利于提高分離效果。反之，對于高濃度的生物樣品，節(jié)省了有機(jī)溶劑，減少了變性的危險，但共沉作用大，分離效果下降。一般認(rèn)為，對于蛋白質(zhì)溶液0.5%～2%起始濃度較合適,對于粘多糖以1%～2%為起始濃度為宜。（四）離子強(qiáng)度在有機(jī)溶劑和水的混合液中，當(dāng)離子強(qiáng)度很小，物質(zhì)不能沉析時，補(bǔ)加少量電解質(zhì)即可解決。鹽的濃度太大(0.1～0.2mol／L以上)，就需大量的有機(jī)溶劑來沉析，并可能使部分鹽在加入有機(jī)溶劑后析出。同時鹽的離子強(qiáng)度達(dá)一定程度時，還會增加蛋白質(zhì)或酶在有機(jī)溶劑中的溶解度。所以一般離子強(qiáng)度在0.05或稍低為好，既能使沉析迅速形成，又能對蛋白質(zhì)或酶起一定的保護(hù)作用，防止變性。（五）金屬離子在用有機(jī)溶劑沉析生物高分子時還應(yīng)注意到某些金屬離子的助沉作用，一些金屬離子如Zn2+、Ca2+等可與某些呈陰離子狀態(tài)的生物高分子形成復(fù)合物。這種復(fù)合物的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉析形成，并降低有機(jī)溶劑的耗量，0.005～0.02mol／L的Zn2+可使有機(jī)溶劑用量減少l／3至1／2,使用時要避免會與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子(如磷酸根)的存在。

有機(jī)溶劑沉析的應(yīng)用（一）有機(jī)溶劑沉析的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：分辨能力比鹽析高,即一種生物分子或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉析；沉析不用脫鹽，過濾比較容易。缺點(diǎn)：是某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。

三、等電點(diǎn)沉析

等電點(diǎn)沉析原理調(diào)節(jié)兩性生化物質(zhì)溶液的pH值，以達(dá)到某一生化物質(zhì)的等電點(diǎn)，使其從溶液中沉淀析出而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)稱為等電點(diǎn)沉析技術(shù)。等電點(diǎn)(pI)是兩性物質(zhì)在其質(zhì)點(diǎn)的凈電荷為零時介質(zhì)的pH值,溶質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，沉淀析出，此時溶質(zhì)的溶解度最低等電點(diǎn)沉析的注意事項(xiàng)（一）等電點(diǎn)的改變（二）目的物的穩(wěn)定性（三）鹽溶作用（四）pH的調(diào)節(jié)

等電點(diǎn)沉析的應(yīng)用（一）在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點(diǎn)的特性來進(jìn)行產(chǎn)品的分離純化。（二）等電點(diǎn)沉析只適用于水化程度不大，在等電點(diǎn)時溶解度很低的物質(zhì)，如四環(huán)素等在等電點(diǎn)(pH=5.4)附近,難溶于水，能產(chǎn)生沉析。（三）等電點(diǎn)沉析對很多蛋白質(zhì)不適合：目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度低只靠調(diào)節(jié)ph難以沉淀，同時在等電點(diǎn)時不穩(wěn)定易變性。所以常與其他沉淀方法聯(lián)用。如鹽析

有機(jī)聚合物沉析優(yōu)點(diǎn)：工藝簡單、所需高聚物的濃度低、不會對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生影響、一般沒有變性作用缺點(diǎn)：高聚物成本高、難于回收。主要用于實(shí)驗(yàn)室和處理價值高的蛋白質(zhì)分離

有機(jī)聚合物沉析的應(yīng)用非離子型聚合物最早在20世紀(jì)60年代時被用來沉析分離血纖維蛋白原、免疫球蛋白，和