：氧化磷酸化課件

第三節(jié)氧化磷酸化一、概念二、氧化磷酸化偶聯(lián)部位及P/O比三、氧化磷酸化機理四、氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和抑制劑五、線粒體穿梭系統(tǒng)六、氧化磷酸化的調(diào)控

一、概念生物體內(nèi)高能磷酸化合物ATP的生成主要由三種方式：

氧化磷酸化底物水平磷酸化光合磷酸化

底物水平磷酸化指ATP的形成直接與一個代謝中間物（PEP）上的磷酸基團轉(zhuǎn)移相偶聯(lián)的作用。

1、底物水平磷酸化特點：ATP的形成直接與中間代謝物進行的反應(yīng)相偶聯(lián)；在有

O2或無O2條件下均可發(fā)生底物水平的磷酸化。1、P/O比：

1940年，SOchoa測定了在呼吸鏈中O2的消耗與ATP生成的關(guān)系，為此提出P/O比的概念。（同位素實驗）當(dāng)一對電子經(jīng)呼吸鏈傳給O2的過程中所產(chǎn)生的ATP分子數(shù)。實質(zhì)是伴隨ADP磷酸化所消耗的無機磷酸的分子數(shù)與消耗分子氧的氧原子數(shù)之比,稱為P/O比。線粒體NADH+H+經(jīng)呼吸鏈氧化P/O比為2.5（3），F(xiàn)ADH2經(jīng)呼吸鏈氧化P/O比為1.5（2）。二、氧化磷酸化偶聯(lián)部位及P/O比

2、形成ATP的部位（氧化與磷酸化偶聯(lián)部位）電子傳遞鏈將NADH和FADH2上的電子傳遞給氧的過程中釋放自由能，供給ATP的合成。其中釋放大量自由能的部位有3處，即復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ，這3個部位就是ATP合成的部位，稱為偶聯(lián)部位。

關(guān)于論證ATP形成部位的實驗證據(jù)：（1）ΔG0’=-nFΔE0’（2）

琥珀酸氧化P/O=2，蘋果酸氧化P/O=3

表明在NADH——CoQ有一次磷酸化作用

（3）A.Lehninger用抗壞血酸使電子從細(xì)胞色素C進入呼吸鏈，測得P/O=1，說明由cytaa3——O2有一次磷酸化（4）使用專一性電子傳遞鏈抑制劑亦可測出ATP的形成部位（舉例）1、有關(guān)氧化磷酸化機理的幾種假說化學(xué)偶聯(lián)假說構(gòu)象偶聯(lián)假說化學(xué)滲透假說三、氧化磷酸化作用的機理（1）化學(xué)偶聯(lián)假說（1953年）（掌握要點）

chemicalcouplinghypothesis

認(rèn)為電子傳遞反應(yīng)釋放的能量通過一系列連續(xù)的化學(xué)反應(yīng)形成高能共價中間物，最后將其能量轉(zhuǎn)移到ADP中形成ATP。AH2+B+I-OHAI+BH2+OH-AI+X-H+OH-

X

I+A+H2O

XI+P-OHXP+I-OH

XP+ADPATP+X-HAH2+B+ADP+P-OHA+BH2+ATP+H2O

（2）構(gòu)象偶聯(lián)假說（1964）

conformationalcouplinghypothesis

認(rèn)為電子沿電子傳遞鏈傳遞使線粒體內(nèi)膜的蛋白質(zhì)組分發(fā)生了構(gòu)象變化，形成一種高能構(gòu)象，這種高能形式通過ATP的合成而恢復(fù)其原來的構(gòu)象。迄今未能分離出這種高能蛋白質(zhì)。但在電子傳遞過程中蛋白質(zhì)組分的構(gòu)象變化還是存在的。

NADH呼吸鏈中的三個復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ起著質(zhì)子泵的作用，將H+

從線粒體基質(zhì)跨過內(nèi)膜進入膜間隙。H+不斷從內(nèi)膜內(nèi)側(cè)泵至內(nèi)膜外側(cè)，而又不能自由返回內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，從而在內(nèi)膜兩側(cè)建立起質(zhì)子濃度梯度和電位梯度即電化學(xué)梯度，也稱為質(zhì)子動力。當(dāng)存在足夠的跨膜電化學(xué)梯度時，強大的質(zhì)子流通過嵌在線粒體內(nèi)膜的F0F1-ATP合酶返回基質(zhì)，質(zhì)子電化學(xué)梯度蘊藏的自由能釋放，推動ATP的合成?；瘜W(xué)滲透假說示意圖獲得1978年的諾貝爾化學(xué)獎支持化學(xué)滲透假說的實驗證據(jù)：氧化磷酸化作用的進行需要封閉的線粒體內(nèi)膜存在。線粒體內(nèi)膜對H+OH-K+

Cl-都是不通透的。破壞H+

濃度梯度的形成（用解偶聯(lián)劑或離子載體抑制劑）必然破壞氧化磷酸化作用的進行。線粒體的電子傳遞所形成的電子流能夠?qū)+

從線粒體內(nèi)膜逐出到線粒體膜間隙。大量直接或間接的實驗證明膜表面能夠滯留大量質(zhì)子，并且在一定條件下質(zhì)子能夠沿膜表面迅速轉(zhuǎn)移。迄今未能在電子傳遞過程中分離出一個與ATP形成有關(guān)的高能中間化合物，亦未能分離出電子傳遞體的高能存在形式。

H+如何通過電子傳遞鏈“泵”出的？關(guān)于H+通過電子傳遞鏈“泵”出的兩種假設(shè)

（一般了解）氧化-還原回路機制(Mitchell提出）：線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的各個氧-還中心即FMNCoQCytC以及Fe-S中心的排列可能即執(zhí)行電子轉(zhuǎn)移又能轉(zhuǎn)移基質(zhì)的質(zhì)子。但是在電子傳遞鏈中，（H+e-）載體只有兩個即FMNCoQ，則三個ATP合成部位中還缺少一個（H+e-）載體，假設(shè)CoQ發(fā)揮兩次作用。（Q循環(huán)）質(zhì)子泵機制：電子傳遞導(dǎo)致復(fù)合體的構(gòu)象變化，而造成AA側(cè)鏈pK的變化，發(fā)揮質(zhì)子泵作用的側(cè)鏈暴露在內(nèi)膜內(nèi)側(cè)或外側(cè)（交替變化），從而使質(zhì)子發(fā)生移位。亞線粒體結(jié)構(gòu)證明FOF1-ATP合酶中FOF1的功能1960年，E.Racker的氧化磷酸化的重組實驗：超聲波胰蛋白酶或尿素重組亞線粒體囊泡有電子傳遞能力但不能使ADP磷酸化具備氧化磷酸化能力根據(jù)當(dāng)前最新測定,H+經(jīng)NADH-Q還原酶、細(xì)胞色素bc1復(fù)合體（Ⅲ）、細(xì)胞色素氧化酶（復(fù)合體Ⅳ）從基質(zhì)泵到膜外時，一對電子泵出的質(zhì)子數(shù)依次為4、2、4，而合成一個ATP分子是由3個H+通過ATP合酶所驅(qū)動。所以電子從NADH傳至O2，共產(chǎn)生的ATP分子數(shù)是2.5個若從琥珀酸傳遞至O2，只有兩個偶聯(lián)部位，產(chǎn)生1.5個ATP。Fe-SFADH2琥珀酸-Q還原酶（復(fù)合體Ⅱ）化學(xué)解偶聯(lián)劑：2、4-二硝基苯酚

（2、4-dinitrophenol,DNP）

DNP在pH=7的環(huán)境中以解離形式存在，是脂不溶的，不能過膜。在酸性環(huán)境中接受H+,成為不解離形式，是脂溶性的，很容易過膜，同時將H+帶入膜內(nèi)，起消除質(zhì)子濃度梯度的作用。亦稱質(zhì)子載體。起同樣作用的有三氟甲氧基苯腙羰基氰化物（FCCP）。中性環(huán)境酸性環(huán)境離子載體（離子載體抑制劑）是一類脂溶性物質(zhì)，能與H+以外的其他一價陽離子結(jié)合，并作為他們的載體使他們能過穿過膜，消除跨膜的電位梯度。纈氨霉素（K+）短桿菌肽（K+Na+）解偶聯(lián)蛋白（產(chǎn)熱素）是存在于某些生物細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上的蛋白質(zhì)，為天然解偶聯(lián)劑。它們能形成質(zhì)子通道，讓膜外的H+通過通道返回膜內(nèi)，消除跨膜質(zhì)子濃度梯度。如：動物的褐色脂肪組織，其產(chǎn)熱機制是線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)的結(jié)果。

人、新生無毛的哺乳動物以及冬眠的哺乳動物。NADH呼吸鏈中的三個復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ起著質(zhì)子泵的作用，將H+

從線粒體基質(zhì)跨過內(nèi)膜進入膜間隙。H+不斷從內(nèi)膜內(nèi)側(cè)泵至內(nèi)膜外側(cè)，而又不能自由返回內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，從而在內(nèi)膜兩側(cè)建立起質(zhì)子濃度梯度和電位梯度即電化學(xué)梯度，也稱為質(zhì)子動力。當(dāng)存在足夠的跨膜電化學(xué)梯度時，強大的質(zhì)子流通過嵌在線粒體內(nèi)膜的F0F1-ATP合酶返回基質(zhì)，質(zhì)子電化學(xué)梯度蘊藏的自由能釋放，推動ATP的合成。化學(xué)滲透假說示意圖獲得1978年的諾貝爾化學(xué)獎1、解偶聯(lián)劑（uncouplers）某些化合物能消除跨膜的質(zhì)子濃度梯度或電位梯度，使ATP不能合成，這種作用稱為解偶聯(lián)作用，這類化合物成為解偶聯(lián)劑。解偶聯(lián)劑不抑制電子傳遞。不抑制底物水平的磷酸化。解偶聯(lián)劑主要有三種類型：化學(xué)解偶聯(lián)劑：2、4-二硝基苯酚離子載體：解偶聯(lián)蛋白：不同的化學(xué)因素對氧化磷酸化作用的影響方式不同，據(jù)此將它們分成三大類：四、氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和抑制劑寡霉素對氧消耗的抑制以及DNP解除寡霉素的抑制作用：真核細(xì)胞細(xì)胞液中產(chǎn)生的NADH必須進入線粒體才能經(jīng)呼吸鏈氧化并生成ATP.

磷酸甘油穿梭蘋果酸-天冬氨酸穿梭五、線粒體穿梭系統(tǒng)1、磷酸甘油穿梭（P/O=2或1.5）NAD+NADH+H+P-甘油P-二羥丙酮P-甘油P-二羥丙酮3-P甘油脫氫酶（胞液）FAD

FADH23-P甘油脫氫酶（內(nèi)膜）CoQFe-SFP1cytb胞液外膜膜間空間內(nèi)膜昆蟲飛行肌細(xì)胞溶膠NADH利用此穿梭2、蘋果酸-天冬氨酸穿梭（P/O=3或2.5）蘋果酸草酰乙酸NAD+NADH+H+蘋果酸草酰乙酸NAD+NADH+H+天冬氨酸谷氨酸α-酮戊二酸天冬氨酸谷氨酸α-酮戊二酸ⅠⅡ1243胞液膜間空間外膜內(nèi)膜基質(zhì)1、胞液的蘋果酸脫氫酶2、線粒體基質(zhì)的蘋果酸脫氫酶3、胞液的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶4、線粒體基質(zhì)的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶Ⅰ、蘋果酸-α酮戊二酸反向交換載體

Ⅱ天冬氨酸-谷氨酸反向交換載體1動物心臟及肝臟胞質(zhì)溶膠內(nèi)NADH利用此穿梭3、外NADH脫氫酶（真菌和高等植物）

NADH脫氫酶（復(fù)合物Ⅰ）內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，朝向基質(zhì)

催化線粒體內(nèi)部的NADH脫氫交給其輔基FMN

將氫傳遞給CoQ

外NADH脫氫酶內(nèi)膜外側(cè)，朝向膜間空間是一種以FAD為輔基的黃素蛋白，催化細(xì)胞液的NADH脫氫交給其輔基FAD將氫傳遞給CoQ，不經(jīng)過復(fù)合物Ⅰ，P/O比為2或1.5外膜內(nèi)膜膜間空間胞液基質(zhì)NADH+H+NADH+H+NAD+NAD+FPextFPintFe-SCoQcytbNADH+H+NAD+真菌和高等植物的胞液NADH進入呼吸鏈氧化的途徑（P/O=2或1.5）FADFMN葡萄糖徹底氧化的能量計算：原核生物真核生物：不同組織EMP的能量計算也需考慮部位。六、氧化磷酸化的調(diào)控ADP是關(guān)鍵物質(zhì)。ADP作為關(guān)鍵物質(zhì)對于氧化磷酸化作用的調(diào)節(jié)稱為呼吸控制（respiratorycontrol）

當(dāng)細(xì)胞利用ATP做功時，ADP含量上升