免疫組織化學(xué)的原理及應(yīng)用級(jí)

免疫組織化學(xué)的原理及應(yīng)用級(jí)第1頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)、組織化學(xué)、生物化學(xué)、免疫組織化學(xué)組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)與組織化學(xué)區(qū)別：

1、組織、細(xì)胞學(xué)是研究形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

2、組織化學(xué)是研究組織細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分及其含量或酶的存在及其活性

第2頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三組織化學(xué)概念:=細(xì)胞化學(xué)是運(yùn)用物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等原理，對(duì)組織與細(xì)胞化學(xué)成分或酶活性進(jìn)行定性、定位和定量的研究的科學(xué)。傳統(tǒng)組織化學(xué)概念：是運(yùn)用物理、化學(xué)免疫學(xué)、電鏡技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展免疫組織化學(xué)、免疫電鏡組織化學(xué)、原位雜交技術(shù)等第3頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三廣義組織化學(xué)包括：傳統(tǒng)組織化學(xué)、

免疫組織化學(xué)、電鏡組織化學(xué)、免疫電鏡組織化學(xué)、原位雜交組織化學(xué)等第4頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三生物化學(xué)與組織化學(xué)區(qū)別：生物化學(xué)：

1、運(yùn)用化學(xué)原理分析細(xì)胞的組成成分以及這些成分在生命過程中的化學(xué)反應(yīng)。

2、生物化學(xué)將組織細(xì)胞制成勻漿研究（結(jié)構(gòu)被破壞）

3、生物化學(xué)的化學(xué)反應(yīng)在試管內(nèi)或容器內(nèi)

4、生物化學(xué)的化學(xué)反應(yīng)結(jié)果觀察不用顯微鏡

5、產(chǎn)物需要分離、提純、鑒定。組織化學(xué)：運(yùn)用化學(xué)反應(yīng)原理在組織細(xì)胞內(nèi)對(duì)組織細(xì)胞化學(xué)成分進(jìn)行定性、定位和定量的研究。產(chǎn)物多需要顯色劑顯示。如：利用酶的特性第5頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三一、免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理：免疫組織化學(xué)技術(shù)是利用抗原與抗體能特異性結(jié)合的基本特點(diǎn)，通過顯示劑的顯示,確定某些抗原或抗體的有無或其存在的位置，來研究某事物的特性。第6頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三二、組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)技術(shù)的區(qū)別

組織化學(xué)技術(shù)：（HE特殊染色）通過應(yīng)用某些能與組織、細(xì)胞化學(xué)成分特異性結(jié)合的顯色試劑，定位的顯示組織、細(xì)胞的特殊化學(xué)成分的一門技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：既保存原有的形態(tài)改變又顯示特殊化學(xué)成分達(dá)到形態(tài)、功能與代謝相結(jié)合。

（不敏感、特異性差）第7頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三二、組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)技術(shù)的區(qū)別

免疫組織化學(xué)技術(shù)：

將抗原、抗體反應(yīng)的特異性與組織化學(xué)反應(yīng)的可見性結(jié)合在一起，形成了免疫組織化學(xué)技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：

1、形態(tài)、功能與代謝相結(jié)合（微量）

2、檢測(cè)的成分更加廣泛、敏感、特異性更強(qiáng)第8頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三三、免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展免疫熒光技術(shù)→抗體酶標(biāo)法→多克隆抗體技術(shù)→單克隆抗體技術(shù)→

ABC法、S-P法等→原位雜交及原位PCR等免疫組化法。第9頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三四、免疫組織化學(xué)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1、特異性強(qiáng)2、敏感性高3、定位準(zhǔn)確4、形態(tài)、功能與代謝相結(jié)合第10頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

五、免疫組織化學(xué)方法免疫組織化學(xué)ImmunohistochemistryImmunocytochemistry1、特異性的抗原和特異性的抗體（結(jié)合）2、顯色系統(tǒng)顯示劑：酶,金屬原子,熒光分子同位素分子酶底物：DAB(3,3-二胺基聯(lián)苯胺)AEC(3-氨基-9-乙基卡巴唑)

堅(jiān)牢藍(lán)，堅(jiān)牢紅.第11頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（一）直接法:酶標(biāo)法（一步法）將酶（HRP）標(biāo)記在特異抗體上，方法簡捷,需要標(biāo)記所有抗體

AgAb-HRP.底物-顯色劑顯色第12頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第13頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（一）直接法:酶標(biāo)法（一步法）將酶（HRP）標(biāo)記在特異抗體上，方法簡捷,需要標(biāo)記所有抗體..Ag←Ab-HRP第14頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（一）直接法:酶標(biāo)法（一步法）將酶（HRP）標(biāo)記在特異抗體上，方法簡捷,需要標(biāo)記所有抗體..Ag←Ab-HRP↓

Ag—Ab-HRP第15頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（一）直接法:酶標(biāo)法（一步法）將酶（HRP）標(biāo)記在特異抗體上，方法簡捷,需要標(biāo)記所有抗體..Ag←Ab-HRP←底物-顯色劑顯色↓

Ag—Ab-HRP第16頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（一）直接法:酶標(biāo)法（一步法）將酶（HRP）標(biāo)記在特異抗體上，方法簡捷,需要標(biāo)記所有抗體..Ag←Ab-HRP←底物-顯色劑顯色↓

Ag—Ab-HRP—底物-顯色劑顯色

需要標(biāo)記所有抗體第17頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第18頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（二）間接法:二步法將酶（HRP）標(biāo)記在第二抗體上，.Ag

Ab1

Ab2-HRP

底物-顯色劑顯色二步法,應(yīng)用范圍廣;不需標(biāo)記一抗,只需標(biāo)記幾個(gè)種屬的二抗即可第19頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第20頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（二）間接法:二步法將酶（HRP）標(biāo)記在第二抗體上，.Ag←Ab1

↓

Ag-Ab1第21頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（二）間接法:二步法將酶（HRP）標(biāo)記在第二抗體上，.Ag←Ab1←Ab2-HRP

↓

Ag-Ab1-Ab2-HRP

第22頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（二）間接法:二步法將酶（HRP）標(biāo)記在第二抗體上，.Ag←Ab1←Ab2-HRP←底物-顯色劑顯色↓

Ag-Ab1-Ab2-HRP-底物-顯色劑顯色二步法,應(yīng)用范圍廣;不需標(biāo)記一抗,只需標(biāo)記幾個(gè)種屬的二抗即可第23頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第24頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第25頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

EnvisionSystem

是將二抗和HRP通過一個(gè)多聚葡聚糖骨架連接成一個(gè)多聚體，多聚體中沒有生物素參與，所以它不受內(nèi)源性生物素的影響，使背景染色降低。特點(diǎn)：敏感、省時(shí)、方便、背景低第26頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第27頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（三）三步法:將酶（HRP）標(biāo)記在復(fù)合物上

1、PAP法

第28頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第29頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（三）三步法:將酶（HRP）標(biāo)記在復(fù)合物上

1、PAP法

2、ABC法

第30頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第31頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（三）三步法:將酶（HRP）標(biāo)記在復(fù)合物上

1、PAP法

2、ABC法

3、S-P法第32頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三鏈霉菌抗生物素蛋白第33頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三抗原一抗二抗生物素酶組織組織生物素生物素卵白素卵白素鏈霉菌抗生物素蛋白第34頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三4、四步法、五步法5、多重標(biāo)記:

在同一組織或細(xì)胞上顯示兩種以上抗原。

SP法>ABC法

4~8倍

SP法>

PAP法

25~50倍

第35頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三組織標(biāo)本的取材固定一、取材：二、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、

撈片、烤片、脫蠟、水化三、玻片處理：防脫片膠

APESPoly-L-Lysin第36頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三三、防脫片處理步驟（一）載玻片和蓋玻片的處理將載玻片或培養(yǎng)用的小蓋片浸泡在重鉻酸鉀濃硫酸清潔液中24小時(shí)，然后流水充分沖洗，再用蒸餾水沖洗3遍以上，而后置95%乙醇中12小時(shí)。取出擦干或烤干，貯放于玻片盒內(nèi)備用。蓋玻片很薄，以上處理程序必須縮短時(shí)間，清潔液浸泡只需2小時(shí)，流水沖洗注意勿損傷玻片。第37頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（二）黏附劑的使用1、多聚左旋賴氮酸（poly-l-lysine）首先配制0.1%多聚左旋賴氮酸濃縮液（配方見附錄一），室溫下（18—26℃）可保存1年。使用時(shí)，將試劑10倍稀釋成工作液，濃度為0.01%，2—8℃冰箱保存，有效期3個(gè)月。使用方法是將充分洗凈和預(yù)先干燥的玻片浸泡于稀釋后的多聚左旋賴氨酸深液數(shù)十秒或提拉十次，瀝干，于室溫下晾干12—24小時(shí)或在45℃以下烤箱內(nèi)烘干。處理后的玻片避光干燥可長期保存。第38頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三2、3-氨丙基-乙氧基甲硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane,APES）

APES必須現(xiàn)用現(xiàn)配。用此方法黏合的玻片應(yīng)垂直烤片而不能水平烤片，否則，組織片中易出現(xiàn)氣泡。

APES的使用方法：用丙酮50倍稀釋（APES1份、丙酮49份混合），將洗凈的玻片放入稀釋好的APES中，停留20—30秒，取出稍停，再入純丙酮或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。注意用APES防脫片處理的載玻片撈片時(shí)組織應(yīng)一步到位，并盡量減少氣泡存在，以免影響染色結(jié)果。注意不要將APES與其他防脫片劑混合使用。第39頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

多聚左旋賴氨酸為目前免疫組織化學(xué)染色中最常用的防脫片劑，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如效果不佳，可用雙重處理（APES和poly-l-lysine）的切片。在以上兩種方法均無效的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前放在APES1：50丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干后即可進(jìn)行下一步驟。對(duì)HE染色的切片，可在載玻片上涂抹薄層蛋白甘油。第40頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三組織標(biāo)本的取材固定一、取材：二、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、

撈片、烤片、脫蠟、水化三、玻片處理：防脫片膠

APESPoly-L-Lysin四、抗原修復(fù)化學(xué)法：胰蛋白酶、胃胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶、尿素等物理法：單純加熱、高壓加熱、微波加熱

10分鐘90~120秒10分鐘第41頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三組織Ab固定液PH值3.05.07.08.010抗原修復(fù)液PH值6.0皮膚AE1/AE3-----胃粘膜EMA+++++子宮肌瘤SMA+++++乳腺癌ER+++++7.0皮膚AE1/AE3-----胃粘膜EMA+++++子宮肌瘤SMA++++++++++乳腺癌ER++++++++++8.0皮膚AE1/AE3+++++胃粘膜EMA+++++子宮肌瘤SMA++++++++++乳腺癌ER++++++++++EDTA8.0皮膚AE1/AE3+++++胃粘膜EMA++++++++++子宮肌瘤SMA+++++++++++++++乳腺癌ER+++++++++++++++第42頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

免疫組化染色步驟：（一）S-P法染色步驟:1、石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（PH=7.4)

沖洗三次,每次三分鐘（3Ｘ3'）。2、根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。3、每張切片滴加一滴或50μl3%H2O2

（試劑A），室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。4、PBS沖洗（3Ｘ3'）第43頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三5、甩取PBS液，每張切片滴加一滴或50μl

的非免疫動(dòng)物血清（試劑B），室溫下孵育10分鐘。6、甩取血清，每張切片滴加一滴或50μl第一抗體，室溫下孵育60分鐘或4oC過夜。7、PBS沖洗（3Ｘ5'）8、甩取PBS液，每張切片滴加一滴或50μl

的第二抗體（試劑C），室溫下孵育、

10分鐘9、PBS沖洗（3Ｘ3'）第44頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三10、甩取PBS液，每張切片滴加一滴50μl

的鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液（試劑D），室溫下孵育10分鐘。11、PBS沖洗（3Ｘ3'）12、甩取PBS液，每張切片滴加2滴100μl

的DAB或AEC顯色液，顯微鏡下觀察

3-10分鐘，陽性顯色為棕色或紅色。13、自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%HCL

分化0.1%氨水或PBS沖洗返藍(lán)。

14、如果用DAB顯色，則切片通過梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固；第45頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三如果用AEC顯色，則切片不能用酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。如果組織內(nèi)源性生物素含量高或由于熱修復(fù)造成內(nèi)源性生物暴露，可在加3%H2O2之前，用內(nèi)源性生物素阻斷劑加以阻斷之后繼續(xù)免疫組化染色。第46頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（二）Envision法染色步驟:1、石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（PH=7.4)

沖洗三次,每次三分鐘（3Ｘ3'）。2、根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。3、每張切片滴加一滴或50μl3%H2O2

室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。4、PBS沖洗（3Ｘ3'）第47頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三5、甩取PBS液，每張切片滴加一滴或50μl

第一抗體，室溫下孵育60分鐘或4oC過夜。6、PBS沖洗（3Ｘ5'）7、甩取PBS液，每張切片滴加一滴或50μl聚合物增強(qiáng)劑（試劑A），室溫下孵育20分鐘。8、

PBS沖洗（3Ｘ3'）9、甩取PBS液，每張切片滴加一滴或50μl酶標(biāo)抗鼠\兔聚合物，（試劑B）室溫下孵育30分鐘。10、PBS沖洗（3Ｘ3'）第48頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三11、甩取PBS液，每張切片滴加2滴100μl

的DAB或AEC色液，顯微鏡下觀察

3-10分鐘陽性顯色為棕色或紅色。12、自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%HCL

分化0.1%氨水或PBS沖洗返藍(lán)。

13、如果用DAB顯色，則切片通過梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能用酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。

第49頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

免疫組化在腫瘤研究中的應(yīng)用

1、提高病理診斷的準(zhǔn)確性，確定腫瘤來源及類型。通過檢測(cè)細(xì)胞骨架抗原（如CK,Vimetin,Desmin,GFAP等）;細(xì)胞功能產(chǎn)物抗原（如激素，免疫球蛋白，NSE,CgA等）;細(xì)胞表型標(biāo)記物，屬細(xì)胞膜抗原（如LCA,EMA)及各種淋巴細(xì)胞表型）和胚胎期抗原（如CEA,AFP).確定腫瘤來源

第50頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三胰腺:腺泡細(xì)胞癌：CK8+++、CK18+++導(dǎo)管分化癌：CK7++、CK19++第51頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三肝臟腫瘤Hep-par-1AFPCK8CK18CK7CK19CK高CK低CA19-9CK20HCC++/_++++++——-/++++—-/+ICC——++++++++++++-/+++++/++-/+MAC胃腸道轉(zhuǎn)移性腺癌+/_—+++++++++++++第52頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三甲狀腺及濾泡旁細(xì)胞甲狀腺濾泡上皮發(fā)生癌髓樣癌

1、Tg+—2、TTF-1++3、Syn—+4、Cg-A—+5、Calcitonin—+6、CEA少+多+第53頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

乳頭狀癌正常

CK高+++—

Galectin-3/HBME-1+—CK19++++Vimitin+—S-100+—P53+—

MC+—CD56—+++甲狀旁腺

PTH+（甲狀旁腺激素）

Syn+、Cg-A+、CK8+、CK18+、CK19+Ki-67＞5﹪注意復(fù)查第54頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

類癌、不典型類癌、小細(xì)胞癌TTF-1—+/-+++Ki-6740~5060＞80CD57+++++++CD56+++++++SYN+++CgA+++NSE+++

第55頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三男性生殖系統(tǒng)前列腺疾病一、前列腺的標(biāo)記物

1、前列腺特異性抗原（PSA）（漿+）正常：在雄激素的調(diào)節(jié)下腺泡上皮、導(dǎo)管上皮分泌是前列腺來源的腫瘤的敏感、特異的標(biāo)記物，但不能區(qū)分良惡性（1）前列腺腺泡上皮、導(dǎo)管上皮：頂端胞質(zhì)+（2）良性增生上皮：頂端胞質(zhì)+

（3）前列腺癌（除外分化最差的）均陽性分化越高，陽性越強(qiáng)（4）偶爾前列腺以以外組織局灶弱+（多為尿路的腺上皮及其癌；唾液腺、乳腺癌等）尿路上皮—第56頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三2、高分子量角蛋白34β12（漿+）

CK5/6（漿+）

P63（核+）

能區(qū)分良惡性:增生→良性→PIN：基底細(xì)胞（漿+）癌：—能幫助區(qū)分良惡性

α-甲基?；o酶消旋酶（P504s）（漿+）癌：敏感性、特異性表達(dá)約80~100﹪正常（偶爾腔面+）→萎縮型腺體→結(jié)節(jié)性增生（12%+）→非典型性腺瘤性增生（AAH）（17%+）→高級(jí)別PIN（90%+）前列腺間質(zhì)的平滑肌、尿路上皮癌、腎細(xì)胞癌、及結(jié)腸癌也可+

第57頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三IGCNU精原細(xì)胞瘤胚胎性癌卵黃囊瘤混合型生殖細(xì)胞腫瘤間質(zhì)細(xì)胞瘤支持細(xì)胞瘤PLAP++++++彌+++——AFP——++++彌+βHCG—+++HPL—可++inhibin——合體++++彌+++彌CD117++++++彌———CD99Vimentin+++++++++CD30—+++彌

—MelanA神經(jīng)內(nèi)分泌++++++CK廣+8++18++高—廣+++彌19+++彌++/_++EMACEA—/合體+——/合體+——/合體+——/合體+——/合體+—

—

—第58頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三3、子宮內(nèi)膜間質(zhì)腫瘤平滑肌腫瘤

SMA++SMSA++Desmin-+H-caldesmin-+特異

CD10+-4、平滑肌瘤平滑肌肉瘤ER/PR+++Bcl-2+++P53+++~+++MIB-1+++~+++第59頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三1、胎盤結(jié)節(jié)、滋養(yǎng)葉細(xì)胞腫瘤

Ki-67-/少量+14%+/-7%2、蛻膜組織、滋養(yǎng)葉細(xì)胞MEL-CAM-中間滋養(yǎng)+PLAP-中間滋養(yǎng)+CK-+VIM+-HCG-+CD10+-第60頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三3、女生結(jié)腸肝細(xì)胞癌肺小細(xì)胞癌腎癌CK7+----CK20-+---4、間皮MC+CR+CK5/6+

第61頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（三）胃腸間質(zhì)瘤(GIST)起源于Cajal細(xì)胞的前驅(qū)細(xì)胞，表達(dá)KIT酪氨酸激酶受體（CD117）,似平滑肌樣腫瘤的胃腸道間葉性腫瘤。形態(tài)多樣：平滑肌分化：梭形細(xì)胞，膠原豐富，核旁空泡-似平滑肌瘤；神經(jīng)分化：核灶性柵欄狀排列-似神經(jīng)鞘瘤；細(xì)胞增大，多角形，上皮樣-似上皮樣平滑肌瘤或肉瘤。非平滑肌和神經(jīng)免疫組化：CD117膜、胞質(zhì)或核旁陽性，DOG-1+，CD34陽性（70-80%），SMA陽性（30-40%）,Desmin陽性,S-100陽性,NF可陽性,第62頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三胃腸道間質(zhì)瘤A潰瘍位于病變的上端B切面顯示向管壁擴(kuò)展。第63頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

間質(zhì)瘤A柵欄狀核似神經(jīng)鞘瘤B梭形細(xì)胞有明顯細(xì)胞漿空泡C上皮樣型第64頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三惡性胃腸道間質(zhì)瘤A腫瘤細(xì)胞圍繞血管形成血管旁細(xì)胞套，外周為壞死B可見數(shù)個(gè)核分裂。第65頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三胃腸間質(zhì)瘤A瘤細(xì)胞間見嗜伊紅色膠原纖維團(tuán)塊BCD34強(qiáng)陽性第66頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三胃腸間質(zhì)瘤A上皮樣型BVimentin陽性第67頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三一、GIST是一組異質(zhì)性腫瘤多數(shù)情況下，激酶基因突變是主要的致癌事件1,2－KIT：80％-85%1－PDGFRA：7％2－野生型（無法檢測(cè)到的突變）：10-15%1SDH-deficientGIST

突變導(dǎo)致激活的酪氨酸激酶受體持續(xù)的異常表達(dá)(KIT或PDGFRA)3GainoffunctionmutationPDGFRA，血小板源性生長因子受體；PDGFRA，血小板源性生長因子受體基因1.CorlessCLetal.JClinOncol.2004;22:3813-3825.2.HeinrichMCetal.Science.2003;299:708-710.3.TrentJCetal.CurrOpinOncol.2006;18:386-395.第68頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三MolecularClassificationofGISTsKITExon11MostcommonsiteofmutationExon92ndmostcommonsiteofmutationExons13&17RarePDGFRAExons12&14RareExon183rdcommonsiteofmutation“Wild-type”MolecularetiologyunclearFamilialGISTGermlineKITorPDGFRAmutationCarney-StratakisGermlinemutationsinSDH（A,B,C,D)PediatricKIT&PDGFRAmutationsarerareCarney’striadNoKITorPDGFRAmutationsNF-1-relatedNoKITorPDGFRAmutations第69頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三胃腸道間葉來源的腫瘤CD117免疫組化檢測(cè)GIST是desmin檢測(cè)陽性平滑肌瘤是否S-100檢測(cè)陽性神經(jīng)鞘瘤是DOG1檢測(cè)GIST是否野生型GIST其他腫瘤KIT基因檢測(cè)GISTPDGFR基因檢測(cè)否GIST是是是否GIST診斷流程--GSIT中國共識(shí)中國GIST診斷治療專家共識(shí)2008第70頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三2、胃腸道間質(zhì)瘤

CD117+（重要）、DOG-1（重要）、CD34+Desmin+/—、SMA/MSA+/—S-100+/—、NF+/—P63+++、P53+++、Ki-67+++預(yù)后差3、Barrett食管第71頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三SDH-deficientGIST占GIST的5%~7.5%臨床上常以綜合征的形式表現(xiàn)（如Carney三聯(lián)征或Carney-Stratakis綜合征）好發(fā)于胃，上皮樣GIST，多結(jié)節(jié)性淋巴管瘤栓，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移免疫組化:可表達(dá)CD117和DOG1，不表達(dá)SDHBc-kit或PDGFRA基因突變檢測(cè)顯示為野生型核分裂象不能評(píng)估危險(xiǎn)度，發(fā)生轉(zhuǎn)移的間隙期較長，故需長期隨訪第72頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三CD34+in70%GISTs:47%insmallintestine;96%inrectum;100%inesophogusCD34isnotspecificforGISTsCD34+:孤立性纖維性腫瘤（>90%）,炎癥性纖維性息肉、去分化脂肪肉瘤、皮膚隆突性纖維肉瘤（>90%）、某些神經(jīng)腫瘤、卡波西肉瘤、多數(shù)血管肉瘤、許多上皮樣肉瘤第73頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

免疫組化在腫瘤研究中的應(yīng)用

1、提高病理診斷的準(zhǔn)確性，確定腫瘤來源及類型。通過檢測(cè)細(xì)胞骨架抗原（如CK,Vimetin,Desmin,GFAP等）;細(xì)胞功能產(chǎn)物抗原（如激素，免疫球蛋白，NSE,CgA等）;細(xì)胞表型標(biāo)記物，屬細(xì)胞膜抗原（如LCA,EMA)及各種淋巴細(xì)胞表型）和胚胎期抗原（如CEA,AFP).確定腫瘤來源

2、某些激素受體及生長因子的檢測(cè)可判斷預(yù)后。如：PR、ER、

第74頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

免疫組化在腫瘤研究中的應(yīng)用

3、癌基因蛋白的研究，研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，如各種癌基因、抑癌基因及其相關(guān)因素。

P53:惡變

Bcl-2：淋巴結(jié)生發(fā)中心反應(yīng)性和淋巴瘤的區(qū)別

Cer-b-B-2：乳腺導(dǎo)管內(nèi)上皮的重度非典型增生和乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌的區(qū)別第75頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

4、評(píng)價(jià)腫瘤增殖活性，對(duì)腫瘤分化、復(fù)發(fā)提供參考。如ki-67,PCNA等。

5、檢測(cè)腫瘤組織的轉(zhuǎn)移潛能，如nm23-H,CD44V6,MMP等。6、協(xié)助判定腫瘤的分期

LN和Ⅵ型可顯示有無浸潤7、提高微小癌灶的發(fā)現(xiàn)率8、指導(dǎo)腫瘤的治療

PR、ER、Cer-b-B-2和許多耐藥基因的檢測(cè)9、免疫性疾病的輔助診斷10、病原生物的檢查如：HPV、EB、HP等第76頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

免疫組化染色的注意事項(xiàng)：（一）抗體的保存和配制1、保存：濃縮抗體：-20~-40oC約1~2年即用型抗體；4oC約1年2、抗體的配制：濃縮抗體必須找抗體的最佳稀釋度即用型抗體直接使用（二）正確設(shè)計(jì)對(duì)照第77頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

陰性對(duì)照（PBS或非免疫血清）、陽性對(duì)照（購置的或自己收集的）、自身對(duì)照、抑制對(duì)照和吸收對(duì)照。抑制對(duì)照和吸收對(duì)照一般不用。（三）出現(xiàn)假陽性的幾種常見原因1、抗體稀釋度不夠，濃度太高。2、抗體與多種抗原有交叉反應(yīng)。3、抗體與組織中某些成分非特異性結(jié)合，出現(xiàn)異常表達(dá)，如：S-100在鱗狀上皮表達(dá)。4、內(nèi)源性酶的顯色第78頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三5、腫瘤與病變組織中有其他組織殘留（尤其是腫瘤中有正常組織殘留）6、抗原的彌散或被瘤細(xì)胞吞噬而使抗原在不該出現(xiàn)的部位出現(xiàn)。7、異位抗原的表達(dá)，（有人認(rèn)為是交叉免疫反應(yīng)）8、內(nèi)源性生物素的影響。第79頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三表2：生物素在正常組織中的分布情況組織生物素組織生物素組織生物素舌鱗狀上皮-喉黏膜腺管++/1卵巢間質(zhì)-舌橫紋肌-支氣管上皮+/3卵巢顆粒細(xì)胞++/2食道鱗狀上皮-支氣管腺體+/2乳腺小葉、導(dǎo)管++/3胃上皮-肺泡-乳頭鱗狀上皮-胃腺體+++/3腎臟近曲管+++/3腦膠質(zhì)-十二指腸平滑肌-腎臟遠(yuǎn)曲管++/3神經(jīng)元++/312指腸上皮腺體+/3腎小球-神經(jīng)纖維-小腸上皮+/2腎集合管++/3甲狀腺腺泡+/2小腸上皮、腺體+/2腎盂移行上皮+/3甲狀腺C細(xì)胞+++/3闌尾上皮、腺體+/3膀胱+/2甲旁腺嗜酸細(xì)胞+++/3結(jié)腸上皮、腺體++/3前列腺+/3腎上腺皮質(zhì)+++/3直腸上皮、腺體++/3尿道上皮+/3腎上腺髓質(zhì)-肛門鱗狀上皮-睪丸曲細(xì)精管+/3胃內(nèi)分泌細(xì)胞+++/3腮腺導(dǎo)管+++/3附睪支持細(xì)胞++/2睪丸間質(zhì)細(xì)胞+++/3腮腺腺泡-輸精管上皮+/2胰島-頜下腺導(dǎo)管++/3宮頸鱗狀上皮-淋巴結(jié)-頜下腺腺泡-宮頸柱狀上皮-扁桃體-胰腺腺泡-宮頸腺上皮+/2脾-胰腺導(dǎo)管+++/3增殖期內(nèi)膜腺體++/2漿細(xì)胞+/3肝細(xì)胞+++/3分泌期內(nèi)膜腺體+/3皮膚鱗狀上皮底層+/3膽管++/2蛻膜腺體+++/2皮脂腺+++/3膽囊+/3蛻膜細(xì)胞+/3脂肪細(xì)胞+/3鼻黏膜上皮+/2胎盤絨毛+/2平滑肌-鼻黏膜腺體++/2臍帶-橫紋肌-會(huì)厭黏膜-輸卵管+/1心肌++/3

血管-注：-陰性；+/1弱陽性點(diǎn)狀分布；++/2中度陽性片狀分布；+++/3強(qiáng)陽性彌漫分布。第80頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三HE未修復(fù)修復(fù)修復(fù)+封閉修復(fù)+DAB標(biāo)準(zhǔn)CK第81頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三生物素生物素標(biāo)準(zhǔn)CK生物素+CK第82頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三胃內(nèi)分泌細(xì)胞第83頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三皮脂腺第84頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三垂體腺瘤第85頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三腺淋巴瘤第86頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三大鼠腎臟第87頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三大鼠肝臟第88頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三大鼠胰腺第89頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三研究顯示

（1）冰凍組織中存在內(nèi)源性生物素。（2）經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物素被封閉。（3）加熱抗原修復(fù)可造成內(nèi)源性生物素暴露。（4）內(nèi)源性生物素暴露的強(qiáng)度各不相同，從弱陽性（+）到強(qiáng)陽性（+++）。（5）內(nèi)源性生物素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在于胞漿中。（6）內(nèi)源性生物素廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織。（7）內(nèi)源性生物素不僅存在人體組織，也存在大鼠組織。（8）內(nèi)源性生物素暴露的強(qiáng)弱與修復(fù)液有關(guān)，其強(qiáng)度增加依次為：檸檬酸、EDTA、EGTA。（9）熱抗原修復(fù)暴露的內(nèi)源性生物素可被雞蛋清封閉。第90頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三建議

為了避免免疫組化中內(nèi)源性生物素的干擾，凡采用冰凍切片或石蠟切片加熱抗原修復(fù)用非生物素檢測(cè)系統(tǒng)：1、進(jìn)行內(nèi)源性生物素封閉，并成為常規(guī)?？刹捎玫扒寤蚵寻姿刈鳛榉忾]劑。2、或采用非生物素檢測(cè)系統(tǒng)，如EnVision等。3、應(yīng)堅(jiān)持使用陰性對(duì)照。第91頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（四）出現(xiàn)假陰性的幾常見種原因1、抗體和檢測(cè)試劑盒配對(duì)不合理（現(xiàn)在一般用通用型可避免試劑盒配對(duì)不合理）2、抗體的濃度太低3、孵育的時(shí)間太短（根據(jù)要求做）4、固定和溫度有的抗體不適合用于福爾馬林固定的組織，僅適合用于冰凍切片；固定、包埋的溫度過高，抗原丟失（≦62oC）5、染色步驟不正確6、染色過程中切片過分干燥第92頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（五）出現(xiàn)背景著色的幾種常見原因1、內(nèi)源性的過氧化物酶沒有阻斷2、正常動(dòng)物血清使用不合理（如二抗為羊抗鼠的IgG,因該用羊的血清)。3、脫蠟不夠徹底4、組織粘貼劑使用不當(dāng)或太濃5、PBS沖洗不夠6、抗體稀釋不合理，濃度太高。7、底物顯色時(shí)間太長第93頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（六）顯示劑的合理使用和增強(qiáng)方法1、顯示劑：目前最常用的

DAB和AEC僅用于HRP系統(tǒng)

AP-Red和Fast-Blue僅用于AP系統(tǒng)2、增強(qiáng)劑：主要是在DAB顯色加一些金屬離子。如：鎳、銅、鈷等（七）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)1、陽性細(xì)胞定位是否明確（膜、漿、核）2、間質(zhì)是否清晰3、有無背景著色第94頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三4、根據(jù)不同的情況判定陽性的標(biāo)準(zhǔn)（有的陽性細(xì)胞數(shù)在5%以上才定為陽性）5、注意抗原的聯(lián)合表達(dá)如：分化差的癌可表達(dá)間葉的成分第95頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（七）免疫組織化學(xué)染色中常見脫片原因1、組織固定、脫水、透明不充分。2、組織切片過厚。3、組織切片有折疊。4、過度的熱抗原修復(fù)（高壓、微波、水煮）處理或抗原修復(fù)液的pH偏高。5、操作過程中，沖洗方法不正確等。第96頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三G.結(jié)果判斷背景干凈,位置正確

第97頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第98頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第99頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第100頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第101頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第102頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第103頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第104頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第105頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三Dako,c-kit,malignantmesothelioma第106頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三Dako,c-kit,malignantmesothelioma第107頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三Dako,c-kit,malignantmesothelioma第108頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三Dako,c-kit,malignantmesothelioma第109頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第110頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三Dako,c-kit,GIST第111頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第112頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第113頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第114頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第115頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第116頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第117頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第118頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第119頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三P16,anorectalSCC第120頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三P16,anorectalSCC第121頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三P16,anorectalSCC第122頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三Breastlobularcarcinomainthyroidgland,TG第123頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三一.免疫組化報(bào)告取材封片觀察（共10分）

第124頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

一塊已知的食管鱗狀細(xì)胞癌組織，周圍帶有少量的正常的食管組織，讓你用免疫組化Envision法、用第一抗體為鼠抗人的單克隆抗體

CKAE1/AE3以檢測(cè)該食管鱗狀細(xì)胞癌的組織情況,你如何做出一張合格的免疫組化切片?

第125頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

要求：1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、實(shí)驗(yàn)方法：3、使用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和藥品：4、實(shí)驗(yàn)步驟：5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：二、免疫組織化學(xué)染色切片（10分）第126頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

謝謝第127頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第128頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三免疫組織化學(xué)試題第129頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三一.免疫組化報(bào)告取材封片觀察（共15分）

第130頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

一塊已知的肺鱗狀細(xì)胞癌組織，周圍帶有少量的正常的肺組織，讓你用免疫組化Envision法、用第一抗體為鼠抗人的單克隆抗體

CKAE1/AE3以檢測(cè)該肺鱗狀細(xì)胞癌的組織情況,你如何做出一張合格的免疫組化切片?

第131頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

要求：1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、實(shí)驗(yàn)方法：3、使用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和藥品：4、實(shí)驗(yàn)步驟：5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：二、免疫組織化學(xué)染色切片（10分）第132頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第133頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第二章組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)染色的樣品制備

取材→固定→脫水→透明→浸蠟→包埋修塊→切片→防脫片處理→撈片→烤片→進(jìn)行各種染色→脫水→透明→封片→鏡下觀察

第134頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)取材一、組織標(biāo)本取材：1、要求：⑴盡可能保持生活狀態(tài)下形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性（材料盡可能新鮮）⑵盡量保持化學(xué)成分和酶的活性⑶保持組織細(xì)胞的抗原不受損2、注意事項(xiàng)⑴材料及時(shí)送檢（及時(shí)固定,5~10倍的固定液），盡快取材（及時(shí)固定或及時(shí)冷凍切片或-80℃保持備用）（盡可能新鮮）第135頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三⑵防止人為因素影響。如：避免擠壓，刀刃要鋒利，不可反復(fù)切拉組織⑶組織塊大小適中：過大過厚→固定不良一般：1.5×1.5×0.2~0.3cm3

最大:2.5×2.5×0.2~0.3cm3免疫組化:1×1×0.2cm3

電鏡:0.3×0.3×0.5cm3⑷注意切面:目標(biāo)組織細(xì)胞一定在目標(biāo)切面上⑸注意特殊情況：縫線、鈣化、血液、粘液、糞便等需要先處理第136頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三⑹取材部位:

主要病變、交接區(qū)、遠(yuǎn)離病變區(qū)≈正常⑺動(dòng)物的取材：麻醉→處死→取材①乙醚吸入麻醉法：大白鼠、豚鼠②戊巴比妥鈉和烏拉坦：3％戊巴比妥鈉或20％烏拉坦腹腔或靜脈注射1~2ml③空氣栓塞法盡快切斷主動(dòng)脈放血后在取材第137頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三二、細(xì)胞標(biāo)本取材：（一）培養(yǎng)的細(xì)胞

1、貼壁生長的細(xì)胞在接種細(xì)胞前，把涂有黏附劑的小蓋玻片放入培養(yǎng)板中，接種后細(xì)胞的自然爬到小蓋玻片上生長，取材時(shí)，將小蓋玻片用預(yù)熱的PBS液輕輕沖洗，瀝干后即可放入固定液內(nèi)。第138頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三2、懸浮生長的細(xì)胞制備濃度為2×105-6細(xì)胞/ml懸液，取50—100μl，加入離心涂片機(jī)內(nèi)，1000r/min離心2分鐘即可均勻分布于已涂黏附劑的載玻片上。第139頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三3、印片法主要應(yīng)用于活組織標(biāo)本檢查和剖檢標(biāo)本取材。將載玻片輕輕壓于病變區(qū)，脫落的細(xì)胞便黏附在玻片上，立即將載玻片浸入細(xì)胞固定液內(nèi)5—10分鐘，自然干燥，低溫保存?zhèn)溆?。?yōu)秀是簡便省時(shí)，細(xì)胞抗原保存較好；缺點(diǎn)是細(xì)胞分布不均勻，玻片上細(xì)胞有重疊。第140頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（二）涂片法

取含有細(xì)胞的液體（腹水、胸水和心包液）或氣管、宮頸等分泌物直接涂片，加入1—2mlHanks液（或細(xì)胞培養(yǎng)液）輕輕混勻，500r/min離心5—10分鐘，棄上清液，制成細(xì)胞懸液（2×106細(xì)胞/ml），使用細(xì)胞離心涂片機(jī)或吸一滴于載玻片上，輕涂，干燥后固定。第141頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)固定固定（fixation）的目的是用人為的方法盡可能使組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分保持生活狀態(tài)，防止組織細(xì)胞死后發(fā)生自溶和組織腐敗。固定還能增加組織塊硬度，使其更容易切片，使不同的結(jié)構(gòu)更容易染色。第142頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三一、組織和細(xì)胞的固定方法固定方法有物理固定和化學(xué)固定兩類，

物理固定可采用空氣干燥（血涂片）、驟冷（在液氮中迅速冷凍）或微波固定等；

化學(xué)固定有浸潤法（immersionmethod）和灌流法（perfusionmethod）。

第143頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

浸潤法是組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)最常用的方法，一次能處理大量的標(biāo)本，預(yù)先需估計(jì)固定液的用量,并在取材前配固定液，組織樣品分裝于小容器內(nèi)，在容器上標(biāo)記組別和取材時(shí)間。容器內(nèi)入記錄組織類型的紙條，以便包埋時(shí)辨認(rèn)。固定液的用量應(yīng)是樣品的5/10/20/40倍，以保證組織充分固定。固定時(shí)間可根據(jù)所選固定液和組織類型而定。若進(jìn)行酶組織化學(xué)染色，應(yīng)在4℃短時(shí)間固定，固定時(shí)間長會(huì)導(dǎo)致酶活性減弱，甚至消失。灌流法適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)缺氧敏感的器官，如神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸等取材。第144頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三二、常用固定劑和固定方法（一）組織常用固定劑和固定方法1、甲醛是常用的醛類固定劑，甲醛（formaldehyde）通過與蛋白多肽鏈氨基酸側(cè)鏈的功能基團(tuán)，如氨基、羥基、酰氨基等結(jié)合，使蛋白多肽分子間形成亞甲基橋（—CH2—），蛋白質(zhì)不再發(fā)生改變，保存原位，其特點(diǎn)是組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，穿透性強(qiáng)，組織收縮少。第145頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

但是，醛基與抗原蛋白氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇的空間構(gòu)象發(fā)生改變，分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可能部分和完全遮蓋抗原決定簇，使之不能完全暴露，因此，在免疫組織化學(xué)染色時(shí)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。如果固定后能夠充分水洗，可減少分子間交聯(lián)。在免疫組織化學(xué)染色之前切片通過抗原修復(fù)還可使抗原再現(xiàn)。為減少固定劑與抗原的交聯(lián)，在使用醛類固定劑時(shí)，應(yīng)縮短固定時(shí)間（8—24小時(shí)），降低固定溫度（4℃）。由于上述缺點(diǎn)可能通過一定處理加以糾正，因此甲醛是首選固定劑。第146頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三方法：（1）10%中性緩沖福爾馬林：商品試劑常為37%—40%甲醛水溶液，常按1：9比例使用，但甲醛的實(shí)際濃度為4%[配法：甲醛原液10ml,0.1mol/L磷酸緩沖液（PB，pH7.4）90ml混勻]。（2）4%多聚甲醛磷酸緩沖液（多聚甲醛40g,0.1mol/LPB500ml，兩者混合加熱至60℃，攪拌并滴加1NNaOH至清澈為止，冷卻后加PB至總量1000ml）。第147頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三2、丙酮為無色極易揮發(fā)和易燃的液體，丙酮（acetone）滲透力很強(qiáng)，能使蛋白質(zhì)沉淀凝固，但不影響蛋白質(zhì)的功能基團(tuán)而保存酶的活性，用于固定磷酸酶的氧化酶效果較好。缺點(diǎn)是固定快、滲透力強(qiáng)，易使組織細(xì)胞收縮，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠佳。一般4℃下30—60分鐘為宜。3、醇類性能與丙酮基本相同，有固定和脫水的雙重作用，穿透力快，組織塊收縮明顯，硬化力強(qiáng)。用冷液能較好地保存酶的抗原的免疫活性，但醇類對(duì)低分子蛋白質(zhì)、多肽及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，解決的辦法是與其他試劑混合使用。第148頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三4、混合固定劑（1）Bouin液：先將飽和苦味酸750ml過濾，加入40%甲醛250ml，混合后存于4℃冰箱備用，臨用前加入冰醋酸50ml。組織通常在4℃下固定6—8小時(shí)。此固定劑對(duì)腎臟組織保存不利。（2）Zamboni液：稱取多聚甲醛20g，加入飽和苦味酸150ml，加熱至60℃左右，持續(xù)攪拌，使之完全溶解，過濾、冷卻后加Karasson-Schwlt磷酸緩沖液（NaH2PO4·H2O3.3lg，Na2HPO4·7H2O33.77g，加雙蒸水至1000ml）。該固定液可用于光鏡、電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)觀察。固定時(shí)間以6—18小時(shí)為宜。第149頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（3）AAF液：為較常用的固定液（95%—100%乙醇85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10ml）。（4）Clarke改良固定劑（100%乙醇75ml，冰醋酸25ml），常用于冰凍切片的后固定。第150頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三（二）培養(yǎng)細(xì)胞常用固定和固定方法培養(yǎng)細(xì)胞常用固定劑有4%多聚甲醛磷酸緩沖液、丙酮、甲醇和95%乙醇。在固定之前需用37℃預(yù)熱的PBS輕洗細(xì)胞。1、4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定10—20分鐘，干燥。2、甲醇

—10℃甲醇固定5—20分鐘，自然干燥。3、丙酮

4℃冷丙酮固定組織穿透性和脫水性強(qiáng)，抗原保存好，很少用于組織切片，常用于培養(yǎng)細(xì)胞和組織涂片的固定，平時(shí)丙酮4℃低溫保存?zhèn)溆?，臨用時(shí)，將載玻片插入冷丙酮內(nèi)5—10分鐘，取出后自然干燥。第151頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三4、乙醇

95%乙醇脫水性強(qiáng)，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量，因而固定時(shí)間不宜過長（2小時(shí)內(nèi)）。乙醇使蛋白變性程度輕，固定后蛋白可再溶解，在染色中孵育時(shí)間長的情況下，抗原可流失，并減弱反應(yīng)強(qiáng)度。5、乙醚（或三氯甲烷）與乙醇等量混合對(duì)組織穿透性極強(qiáng)，即使涂片上含較多的黏液，固定效果仍較好，是理想的細(xì)胞固定液。培養(yǎng)細(xì)胞固定之后晾干可使細(xì)胞牢固地黏附在載玻片上。故對(duì)于容易脫落的細(xì)胞應(yīng)延長晾干時(shí)間。晾干之后PBS漂洗3次，然后進(jìn)行組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)染色。第152頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三

用于免疫組織化學(xué)的固定劑種類很多，不同的抗原和標(biāo)本均可首選醛類固定液，如效果不佳，再試用其他固定液。選擇最佳固定液的標(biāo)準(zhǔn)：一是能最好地保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)；二是最大限度地保存抗原免疫活性的被檢物不被丟失。一些含金屬固定液可用于組織化學(xué)標(biāo)本的固定，但在免疫組織化學(xué)染色中禁用。第153頁，共166頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)包埋和切片

組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)染色標(biāo)本常用石蠟切片和冰凍切片。一、石蠟包埋用于免疫組織化學(xué)染色的石蠟切片（paraffinsection）與常規(guī)HE染色的石蠟切片基本制片過程相同。石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)保存良好，結(jié)構(gòu)清晰，能連續(xù)切片，抗原定位準(zhǔn)確，更適合回顧性研究。第154頁，共166頁，2023