分子生物學(xué)轉(zhuǎn)錄前的基因活化

分子生物學(xué)轉(zhuǎn)錄前的基因活化第1頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因表達(dá)調(diào)控的層次

基因表達(dá)受發(fā)育階段及環(huán)境因素的影響。生物體對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控有許多的層次，如轉(zhuǎn)錄前的基因活化、轉(zhuǎn)錄過(guò)程、轉(zhuǎn)錄后的RNA加工成熟過(guò)程、翻譯過(guò)程、翻譯后的多肽加工過(guò)程。這些過(guò)程對(duì)于生物生長(zhǎng)發(fā)育是非常重要的。第2頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DNA

水平的調(diào)控

某些原生動(dòng)物、線蟲和甲殼類動(dòng)物在個(gè)體發(fā)育中，體細(xì)胞會(huì)發(fā)生染色體丟失現(xiàn)象，只有將來(lái)分化形成生殖細(xì)胞的那些細(xì)胞才保持完整的基因組。目前在高等真核生物（包括動(dòng)、植物）中尚未發(fā)現(xiàn)類似的基因丟失現(xiàn)象。

基因丟失第3頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因丟失

馬蛔蟲受精卵里只有一對(duì)染色體（2n=2），當(dāng)個(gè)體發(fā)育到一定階段后，在將分化為體細(xì)胞的那些細(xì)胞中，這對(duì)染色體破碎成許多小染色體。有的小染色體具有著絲粒，在細(xì)胞分裂中得到保留，不具有著絲粒的小染色體因?yàn)樵谝院蟮募?xì)胞分裂中不能分配到下一代細(xì)胞中而丟失，在將形成生殖細(xì)胞的那些細(xì)胞里卻沒(méi)有染色體破碎和丟失現(xiàn)象。這些基因的丟失決定了細(xì)胞的命運(yùn)。第4頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因丟失（續(xù)）

許多原生動(dòng)物細(xì)胞中（纖毛蟲綱的草履蟲、鐘蟲等）含有兩種類型的核，小核和大核。通常在它們的生殖細(xì)胞中只具有一個(gè)小核，當(dāng)細(xì)胞分化時(shí)，小核經(jīng)歷各種變化，最終結(jié)果是產(chǎn)生擁有一個(gè)大核和一個(gè)小核的雙核細(xì)胞。小核中含有無(wú)活性的DNA，僅僅為將來(lái)產(chǎn)生生殖細(xì)胞貯藏遺傳信息；大核中的DNA則是具有轉(zhuǎn)錄活性的模板。第5頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因丟失（續(xù)）

在對(duì)原生動(dòng)物Oxytrichia的大核形成過(guò)程的研究中發(fā)現(xiàn)，處于生殖細(xì)胞中的小核DNA，在分化過(guò)程中被切割成長(zhǎng)度為500～20000bp的線性片段，而且大部分DNA在形成上述線性片段的過(guò)程中被徹底降解。通過(guò)一種目前還不清楚的方式，剩下的片段能夠不斷復(fù)制，直到每個(gè)細(xì)胞中含有17000種不同片段的1000個(gè)拷貝為止。這些片段進(jìn)一步建成大核。在這個(gè)過(guò)程中，大核所含的DNA是小核DNA的幾百倍，但是丟失了一半以上的小核DNA序列。第6頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DNA水平的調(diào)控

基因擴(kuò)增

基因擴(kuò)增是指細(xì)胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專一性地大量增加的現(xiàn)象，它是通過(guò)改變基因的數(shù)量而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種調(diào)控方式。當(dāng)發(fā)育分化或環(huán)境條件改變，使對(duì)某種基因產(chǎn)物的需要量劇增，單靠調(diào)節(jié)表達(dá)活性不足以滿足需要時(shí)，依靠基因擴(kuò)增可迅速增加基因表達(dá)產(chǎn)物的量。

第7頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因擴(kuò)增（續(xù)）

在兩棲類和昆蟲的卵母細(xì)胞中，為貯備大量核糖體以供胚胎早期發(fā)育的需要，通常專一性地?cái)U(kuò)增rRNA基因。非洲爪蟾體細(xì)胞rDNA拷貝數(shù)約500個(gè)，而卵母細(xì)胞中rDNA的拷貝數(shù)可達(dá)2百萬(wàn)個(gè)，以染色體外環(huán)狀DNA分子的形式存在，每個(gè)環(huán)狀DNA分子含2～4個(gè)甚至多達(dá)16個(gè)rRNA基因。這些rDNA約占整個(gè)卵母細(xì)胞DNA的75%。當(dāng)胚胎期開(kāi)始時(shí)，這些染色體外擴(kuò)增的環(huán)狀rDNA拷貝即失去功能并逐漸消失。第8頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因擴(kuò)增（續(xù)）

外界環(huán)境因素也可以造成基因擴(kuò)增。用二氫葉酸還原酶的抑制劑氨甲喋呤處理離體培養(yǎng)的細(xì)胞系，可以使這個(gè)酶的基因dhfr擴(kuò)增達(dá)到40～400個(gè)拷貝，從而產(chǎn)生更高的酶活性來(lái)增加對(duì)氨甲喋呤的抗性?；驍U(kuò)增了的細(xì)胞系可分為兩大類：一類是穩(wěn)定系（stablelines），無(wú)論是否除去氨甲喋呤，擴(kuò)增的dhfr基因都依然存在；另一類是不穩(wěn)定系（unstablelines），擴(kuò)增的dhfr基因在除去氨甲喋呤后逐漸消失。第9頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因擴(kuò)增（續(xù)）

穩(wěn)定系中擴(kuò)增的

dhfr

基因成簇串聯(lián)在一起，位于一條染色體原來(lái)的

dhfr

基因位置上，而其同源染色體的

dhfr

基因通常不擴(kuò)增。不穩(wěn)定系中擴(kuò)增的

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基因以雙小染色體（double-minutechromosomes）的形式存在，每個(gè)雙小染色體含有2～4個(gè)

dhfr

基因，雙小染色體可以自主復(fù)制，但無(wú)著絲點(diǎn)，在有絲分裂中不能均等地分配到子細(xì)胞中去，并常常因此而丟失。第10頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DNA

水平的調(diào)控基因重排

基因重排是改變基因組中有關(guān)基因序列結(jié)構(gòu)的一種基因表達(dá)調(diào)控方式。一個(gè)最典型的例子是人和哺乳動(dòng)物在B淋巴細(xì)胞分化期間發(fā)生基因組重建，從而產(chǎn)生抗體的多樣性，以識(shí)別和區(qū)分不同結(jié)構(gòu)的抗原。第11頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因重排

抗體分子中最主要的IgG是由兩條輕鏈和兩條重鏈組成。輕鏈和重鏈由3個(gè)獨(dú)立的多基因家族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈（κ和λ），一個(gè)編碼重鏈。第12頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因重排

小鼠的κ、λ和重鏈的基因家族分別位于第6、12和16號(hào)染色體上。決定輕鏈的基因族上分別由L、V、J、C四類基因片段，L代表前導(dǎo)片段（leadersegment），V代表可變片段（variablesegment），J代表連接片段（joiningsegment），C代表恒定片段（constantsegment）。決定重鏈的基因族上共有L、V、D、J、C五類基因片段，其中D代表多樣性片段（diversitysegment）。第13頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因重排

小鼠的重鏈和κ鏈基因族各有V片段約200個(gè)，λ鏈的V片段有5個(gè)；J片段有5個(gè)；D片段有12個(gè)。人的抗體基因族結(jié)構(gòu)大體相似，但分布在不同染色體上。當(dāng)淋巴細(xì)胞受到抗原刺激而分化為漿細(xì)胞時(shí)，胚原型DNA將發(fā)生基因重排而形成表達(dá)型DNA。重鏈取一個(gè)V、D、J與L、C重排成表達(dá)型DNA，而將其它的V、D、J切除；同樣輕鏈也取一個(gè)V、J與L、C重排。這樣每一種淋巴細(xì)胞能且僅能產(chǎn)生一種抗體。第14頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三鼠胚系Ig基因的構(gòu)成第15頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三人胚系Ig基因的構(gòu)成第16頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三小鼠Igμ重鏈的基因重排、轉(zhuǎn)錄與合成的順序第17頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三小鼠Igμ重鏈的基因重排、轉(zhuǎn)錄與合成的順序（續(xù)）第18頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三小鼠Igκ輕鏈的基因重排、轉(zhuǎn)錄與合成的順序第19頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三小鼠Igμ重鏈的基因重排、轉(zhuǎn)錄與合成的順序（續(xù)）第20頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三圖11－1真核生物染色體的組裝模式第21頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三常染色質(zhì)和異染色質(zhì)

常染色質(zhì)是間期核內(nèi)凝縮程度相對(duì)較低的染色質(zhì)區(qū)，異染色質(zhì)是凝縮程度相對(duì)較高的染色質(zhì)區(qū)。按其功能來(lái)分，根據(jù)其是否轉(zhuǎn)錄區(qū)域，還可以將染色質(zhì)分為活性染色質(zhì)和非活性染色質(zhì)，異染色質(zhì)中都是非活性染色質(zhì)。常染色質(zhì)中一部分是活性染色質(zhì)，一部分是非活性染色質(zhì)。活性染色質(zhì)伸展成念珠狀，有些地方還與組蛋白分離。

第22頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

DNaseⅠ超敏感位點(diǎn)

用極低濃度的DNaseⅠ對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行切割，能夠被切割的位點(diǎn)稱為DNaseⅠ超敏感位點(diǎn)。DNaseⅠ超敏感位點(diǎn)位于活性染色質(zhì)區(qū)。在活性染色質(zhì)區(qū)，由于DNA裸露，易受DNaseⅠ切割。有些DNaseⅠ超敏感位點(diǎn)是一個(gè)短的區(qū)域，即30nm纖維為序列特異調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合所中斷的區(qū)域；有些DNaseⅠ超敏感位點(diǎn)是一些較長(zhǎng)的區(qū)域，即轉(zhuǎn)錄正在進(jìn)行的區(qū)域。異染色質(zhì)對(duì)DNaseⅠ不敏感。第23頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三常染色質(zhì)，示活性染色質(zhì)和非活性染色質(zhì)及DNaseⅠ超敏感位點(diǎn)非活性染色質(zhì)活性染色質(zhì)極低濃度DNaseⅠ能夠切割的位點(diǎn)稱為DNaseⅠ超敏感位點(diǎn)。成串的非甲基化的CpG序列稱為CpG島第24頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三H1組蛋白的修飾

H1組蛋白結(jié)合在核小體DNA進(jìn)出口處，并在形成二級(jí)結(jié)構(gòu)30nm螺線管時(shí)起重要作用。當(dāng)在H1組蛋白特異的氨基酸殘基上發(fā)生磷酸化時(shí)，染色質(zhì)凝縮，使該區(qū)域成為異染色質(zhì)。關(guān)閉該區(qū)段的基因表達(dá)。第25頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三核心組蛋白修飾

核心組蛋白修飾后會(huì)影響它們與DNA的結(jié)合，修飾作用包括乙?；⒘姿峄图谆?。其中核心組蛋白賴氨酸殘基被乙?；螅瑴p少了組蛋白的正電荷，降低了與DNA的結(jié)合力?；钚匀旧|(zhì)往往是高度乙酰化的。第26頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三非組蛋白修飾

非組蛋白中包括各種轉(zhuǎn)錄因子（反式作用因子），它們的活性也會(huì)受到修飾調(diào)節(jié)。在非組蛋白中有一類，由于其在電泳中的高遷移率，故稱為高遷移率蛋白（highmobilitygroup,HMG），它們常與活性染色質(zhì)結(jié)合，并與轉(zhuǎn)錄效率升高相聯(lián)系。第27頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

核基質(zhì)

染色質(zhì)可用鹽、中性去垢劑和Dnase等化學(xué)方法和電泳等物理方法來(lái)提取。提取后殘留的結(jié)構(gòu)，即為核基質(zhì)（nuclearmatrix），也稱核骨架（nuclearscaffold）。核基質(zhì)的主要成分是蛋白質(zhì)。間期染色質(zhì)提取后殘留的核基質(zhì)是一種有著不同密度的纖維狀網(wǎng)。第28頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

基質(zhì)附著區(qū)

真核生物的染色體是由周期性緊密結(jié)合在核基質(zhì)上的DNA環(huán)組成的。DNA上與核基質(zhì)結(jié)合的那段序列稱為基質(zhì)附著區(qū)（matrixattachmentregions，MARs），或稱為基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrixassociationregions，MARs）。MARs之間的環(huán)約為5~200kb左右。如果以間期染色質(zhì)平均85kb有一個(gè)環(huán)來(lái)計(jì)算，具有109核苷酸對(duì)的二倍體細(xì)胞應(yīng)有23,000個(gè)MARs。第29頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

基質(zhì)附著區(qū)（續(xù)）

現(xiàn)有的研究表明，MARs序列缺少保守性，它們通常含有約70%的A+T，除此之外缺少共有序列。不同來(lái)源的MARs之間不能相互雜交，但可以與不同來(lái)源的核基質(zhì)結(jié)合，說(shuō)明其序列同源性雖差，但在功能進(jìn)化上卻是保守的。第30頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三圖11－3MAR與核基質(zhì)的相互作用第31頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三圖11－4活體或離體兩種方法檢測(cè)MAR（1）與核基質(zhì)結(jié)合活體方法離體方法第32頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三圖11－4活體或離體兩種方法檢測(cè)MAR（2）

提取的DNA跑兩個(gè)泳道，用特異的DNA探針檢測(cè)其中一個(gè)泳道，看是否有特異的MAR片段活體方法離體方法第33頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

MARs在基因表達(dá)中的作用

MARs在基因表達(dá)中可能有4種作用：①邊界元件作用，它確定了獨(dú)立的基因調(diào)節(jié)區(qū)域。②染色質(zhì)調(diào)節(jié)作用，MARs作為刺激或阻遏基因表達(dá)的順式作用元件，可促進(jìn)調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合和作用。③作為DNA復(fù)制起點(diǎn)的組成起作用。④對(duì)于有絲分裂中期染色體的組裝并保持一定形狀是重要的。第34頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

圖11－7側(cè)向構(gòu)建有MAR的轉(zhuǎn)基因形成獨(dú)立活性結(jié)構(gòu)區(qū)MARs的邊界作用第35頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

圖11－6基質(zhì)附著區(qū)（MARs）功能分析1kbDNAβ－云扁豆蛋白基因增強(qiáng)子不能促進(jìn)表達(dá)增強(qiáng)子激活了表達(dá)MARs的邊界作用第36頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

MARs

的調(diào)節(jié)作用

當(dāng)用一個(gè)異源的酵母ARS1MAR作為側(cè)翼的GUS（β—葡糖苷酸酶）報(bào)告基因轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞，使報(bào)告基因的表達(dá)水平提高了12倍，最高達(dá)24倍。而改用來(lái)自煙草內(nèi)源的與核基質(zhì)結(jié)合較強(qiáng)的R67MAR替換上述與核基質(zhì)結(jié)合較弱的酵母ARS1MAR時(shí)，GUS的表達(dá)水平提高了60倍，最高達(dá)140倍。這說(shuō)明與核基質(zhì)結(jié)合力較強(qiáng)的MAR比結(jié)合力較弱的MAR對(duì)基因表達(dá)的影響較大。

第37頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

MARs

的調(diào)節(jié)作用（續(xù)）

在對(duì)番茄熱激蛋白基因表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，只有在3’MAR、5’MAR及內(nèi)含子均存在的情況下基因正常表達(dá)，缺少其中一個(gè)將大大降低基因表達(dá)。這說(shuō)明基因側(cè)翼的MARs和內(nèi)含子對(duì)于基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。第38頁(yè)，共43頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

DNA甲基化

在真核生物DNA中，甲基化發(fā)生在胞苷酸殘基胞嘧啶環(huán)的5位碳原子上。甲基化位點(diǎn)通常在CG序列上。對(duì)于植物來(lái)說(shuō)，甲基化還能在CNG序列的C上發(fā)生。

——CG————CNG——