蛋白質(zhì)與酶工程緒論演示文稿

蛋白質(zhì)與酶工程緒論演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五優(yōu)選蛋白質(zhì)與酶工程緒論現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五本講綱要1相關(guān)概念2蛋白質(zhì)工程概述3酶工程概述現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五1相關(guān)概念1-1科學(xué)、技術(shù)或工程

科學(xué)技術(shù)工程之間的關(guān)系？現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五1相關(guān)概念1-1科學(xué)、技術(shù)或工程科學(xué)與技術(shù)是兩個(gè)不同的概念，它們之間既有明確的區(qū)別，又有緊密的聯(lián)系通常合稱為“科學(xué)技術(shù)”

科學(xué)：探討“是什么”，即認(rèn)識(shí)自然、發(fā)現(xiàn)自然規(guī)律技術(shù)：解決“如何做”，有目的，有發(fā)明一切能夠在市場(chǎng)上有競(jìng)爭(zhēng)力，獲得市場(chǎng)承認(rèn)，推動(dòng)市場(chǎng)發(fā)展的知識(shí)都可以稱為技術(shù)。

現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五1相關(guān)概念1-1科學(xué)、技術(shù)或工程工程：以某組設(shè)想的目標(biāo)為依據(jù)，應(yīng)用有關(guān)的科學(xué)知識(shí)和技術(shù)手段，通過一群人的有組織活動(dòng)將某個(gè)（或某些）現(xiàn)有實(shí)體（自然的或人造的）轉(zhuǎn)化為具有預(yù)期使用價(jià)值的人造產(chǎn)品過程。它的成功有賴于多種科學(xué)技術(shù)的綜合集成和科學(xué)的管理。南水北調(diào)工程調(diào)水源頭現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五①科學(xué)的本質(zhì)是發(fā)現(xiàn),②技術(shù)的靈魂是發(fā)明,③工程的核心是建造研究對(duì)象概念各類知識(shí)的基本形式各類活動(dòng)的基本方式研究規(guī)則主要研究人員科學(xué)對(duì)自然界客觀規(guī)律的探索科學(xué)概念、科學(xué)假說和科學(xué)定律典型形式為基礎(chǔ)科學(xué)研究，包括科學(xué)實(shí)驗(yàn)和理論研究普遍性、公有性、無私性、創(chuàng)造性和有條理的懷疑主義科學(xué)家技術(shù)改造世界的手段和方法技術(shù)原理和操作方法技術(shù)開發(fā)，包括發(fā)明、創(chuàng)新、轉(zhuǎn)移以獲取經(jīng)濟(jì)和物質(zhì)利益為目的；保密和專利

發(fā)明家工程實(shí)際的改造世界的物質(zhì)實(shí)踐活動(dòng)和建造實(shí)施過程工程原理、設(shè)計(jì)和施工方案等計(jì)劃、預(yù)算、執(zhí)行、管理、評(píng)估等團(tuán)結(jié)、協(xié)作，團(tuán)隊(duì)精神工程師科學(xué)、技術(shù)與工程的不同現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五

工程學(xué)家—未來的你們要具有科學(xué)家的知識(shí)要具有藝術(shù)家的眼光要有哲學(xué)家的思維要有經(jīng)濟(jì)學(xué)家的頭腦把原材料“雕塑”成有市場(chǎng)價(jià)值的工藝品科學(xué)家探索已存在的世界工程師創(chuàng)造美麗新世界現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五1相關(guān)概念

1-2生物工程(Bioengineering,Biologicengineering)

以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體系和工程原理生產(chǎn)生物制品和創(chuàng)造新物種的綜合性科學(xué)技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)工程技術(shù)的總稱，主要包括：

遺傳工程（基因工程）蛋白質(zhì)工程

細(xì)胞工程微生物工程(發(fā)酵工程)

酶工程(生化工程)現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五不同的生物工程現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五生物學(xué)化學(xué)工程工程學(xué)化學(xué)生物工程生物化學(xué)生物技術(shù)新興、前沿學(xué)科往往在學(xué)科交叉中產(chǎn)生現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五2-1定義：以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)通過理化和DNA重組等方法對(duì)基因和蛋白質(zhì)進(jìn)行有目的地設(shè)計(jì)、修飾和改造最終獲得滿足人類生產(chǎn)和生活需求的新型蛋白質(zhì)（天然蛋白質(zhì)的改造，或是純新蛋白質(zhì)）這樣的理論和實(shí)踐活動(dòng)即蛋白質(zhì)工程。2蛋白質(zhì)工程

（ProteinEngineering）現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五2-2誕生和崛起1）誕生于基因工程問世10周年之際現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五2）蛋白質(zhì)工程迅速崛起.why?（1）基因工程生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)

**長(zhǎng)期進(jìn)化而來，其結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種的需要

**卻未必完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要

例：工業(yè)生產(chǎn)中常有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、有機(jī)溶劑存在，因此需要穩(wěn)定性非常好的酶；天然酶中很少能滿足此需要（2）結(jié)構(gòu)生物學(xué)能夠分析蛋白質(zhì)分子的精確立體結(jié)構(gòu)及其與生物功能的關(guān)系，從而為設(shè)計(jì)和改造天然蛋白質(zhì)提供藍(lán)圖（3）以定點(diǎn)突變?yōu)橹行牡幕虿僮骷夹g(shù)為蛋白質(zhì)工程提供手段現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五提高干擾素效應(yīng)趙廣榮等采用組合突變策略，對(duì)人干擾素α2b（rh-INFα2b）的第52-53-55、103-107和121-125位氨基酸殘基定向突變;獲得了新型重組基因序列。將突變基因連接于原核表達(dá)載體pET28a上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá);所獲得的新型rh-IFNα2b的進(jìn)行抗病毒活性效價(jià)檢測(cè)，其活性達(dá)9.3×107IU/mg，比野生型rh-IFNα2b高93倍（1×106IU/mg）?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五2-3蛋白質(zhì)工程原理

中心法則的逆推

現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五2-4蛋白質(zhì)工程與基因工程的關(guān)系1）都以中心法則為理論基礎(chǔ)2）蛋白質(zhì)工程是基因工程的發(fā)展

----第二代基因工程

第一代：經(jīng)典基因工程—自然界已有蛋白或多肽基因的高效表達(dá)第二代：蛋白質(zhì)工程,基因定向突變→有新功能的蛋白質(zhì)

在有限的時(shí)空條件下快速實(shí)現(xiàn)的、自然界需要跨越巨大時(shí)空的進(jìn)化和選擇?，F(xiàn)在是18頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五2-5蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容（1）1.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)信息，建立結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，為闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

三維空間結(jié)構(gòu)的測(cè)定是驗(yàn)證蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)（即新結(jié)構(gòu)是否產(chǎn)生了新功能）是必需手段。

晶體學(xué)技術(shù)在確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面有了很大發(fā)展，但是其最明顯的不足是其需要分離出一定量（數(shù)mg-數(shù)十mg）的純蛋白才能制備出單晶體，再進(jìn)行繁雜的數(shù)據(jù)收集和計(jì)算、分析現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五Thestructureof

S.pneumoniae

GHIP.

X-raydiffractionpatternoftheSP0987crystalfromS.pneumoniaeTIGR4recordedusingaMAR345imageplate.

現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五2-5蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容（2）2.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)一段氨基酸序列的空間結(jié)構(gòu)和功能；反之，也可根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。**通過基因重組等實(shí)驗(yàn)可直接分析分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系**也可通過分子動(dòng)力學(xué)、分子熱力學(xué)等，分析計(jì)算蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)和生物功能

這方面的工作尚在起步階段目標(biāo)：建立一套關(guān)于結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的完整理論，用以設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五Identifyitsglycosylhydrolaseactivity

現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五HomologymodelingandanalysisofYycGHATPase_cdomainofS.pneumoniae.(A)ThesolidribbonrepresentationofthestructuremodeloftheYycGHATPase_cdomain.(B)StructuresuperpositionofthemodeledstructureofYycGHATPase_cdomainofS.pneumoniae(blue)withtheX-raydiffractionstructureofthehomologousdomainofThermotogamaritimainEscherichiacoli(yellow).ThemodelofADPdockedintotheATP-bindingpocketoftheYycGHATPase_cdomaininS.pneumoniae.現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五2-5蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容（3）3.蛋白質(zhì)的改造和創(chuàng)造*理化法：變性/復(fù)性、修飾其側(cè)鏈官能團(tuán)、分割肽鏈、改變表面電荷分布促進(jìn)蛋白質(zhì)形成一定的立體構(gòu)象等*生化方法：用蛋白酶選擇性酶切蛋白質(zhì)用糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學(xué)基團(tuán)等

但是，該法對(duì)相同或相似的基團(tuán)或化學(xué)鍵都能夠發(fā)生作用，不只對(duì)某個(gè)特定部分，作用無特異性*基因重組或人工合成DNA：既可改造蛋白質(zhì)也可從頭合成全新蛋白質(zhì)現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五1）從頭合成理論上：可設(shè)計(jì)合成滿足人類需要的各種蛋白質(zhì)實(shí)際上：要生產(chǎn)這樣的全新蛋白并不容易技術(shù)不成熟，目前只能合成一些短肽2）局部修飾或改造：常用，目前的研究主要集中在該領(lǐng)域：

**基因水平的改造：增減一些編碼序列；其前提是知道改變哪些序列可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)性狀的改變；相對(duì)容易

**蛋白質(zhì)水平的改造：對(duì)生產(chǎn)出的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、加工（磷酸化，糖基化等）?；瘜W(xué)修飾的條件劇烈，且無特異性，且對(duì)每批蛋白都要進(jìn)行操作，故繁瑣現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五具體方法隨機(jī)突變定位突變現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五1、隨機(jī)突變：方法：（1）易錯(cuò)PCR

（2）基因改組（DNAshuffling）和基因家族改組（DNAfamilyshuffling)

優(yōu)點(diǎn)：在體外模擬自然進(jìn)化的過程現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（1）易錯(cuò)PCR（錯(cuò)誤傾向PCR誘變，error-pronePCR)通過調(diào)整反應(yīng)條件來使PCR擴(kuò)增過程中復(fù)制錯(cuò)配率增加，在目的基因中隨機(jī)引入突變，繼而獲得蛋白質(zhì)分子的隨機(jī)突變體

*提高鎂離子濃度或加入錳離子*降低體系中一種的dNTP濃度（至少5-10%）*運(yùn)用低保真度DNA聚合酶*增加DNA聚合酶的濃度

屬于無性進(jìn)化：?jiǎn)我换騼?nèi)進(jìn)行遺傳突變，費(fèi)力、耗時(shí)，多用于小片段（800bp以下）現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五關(guān)鍵:合適的突變頻率**突變頻率太高：會(huì)導(dǎo)致絕大多數(shù)突變?yōu)橛泻ν蛔儯y以篩選到有益突變**突變頻率太低：則會(huì)導(dǎo)致文庫(kù)中幾乎全是野生型群體**連續(xù)易錯(cuò)

PCR策略---即將一次擴(kuò)增得到的有益突變基因作為下一次擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變，使每一次擴(kuò)增得到的正向突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。

現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（2）DNAshufflingandDNAfamilyshufflingDNAshuffling（改組）：將已獲得的存在于不同基因中的正向突變匯聚在一起，形成新的突變基因庫(kù)；目的是創(chuàng)造讓親本基因群中的突變基因組合的機(jī)會(huì)，以致更大的變異，獲得最佳突變組合的蛋白質(zhì)（又稱有性PCR,有性進(jìn)化）現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五表1部分DNA改組技術(shù)的研究成果現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五DNAfamilyshuffling：采用進(jìn)化上相關(guān)的一系列基因，即來自不同種屬的同源基因，進(jìn)行DNAshuffling，可獲得更高的有益突變率。例如：Stemmer等對(duì)4個(gè)來源于不同種屬的頭孢菌素酶基因進(jìn)行了改組研究，4個(gè)基因同時(shí)改組后的效果增加了270,540倍，而單個(gè)基因改組后的效果僅為改組前的8倍?，F(xiàn)在是32頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五

2、定位突變?cè)谝阎狣NA序列中替換、插入或刪除一定長(zhǎng)度的核苷酸片段優(yōu)點(diǎn)：突變率高，簡(jiǎn)單易行和重復(fù)性好方法：（1）寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變?nèi)绾惺酵蛔?cassettemutagenesis)又稱片段取代法(DNAfragmentreplacement)

利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列（2）PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五盒式突變利用一段人工合成的含有突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列，從而達(dá)到定點(diǎn)突變的目的實(shí)施時(shí)，要求靶DNA插入點(diǎn)兩側(cè)有合適的限制酶單一切點(diǎn)

現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五PCR重疊延伸的插入誘變（InsertionMutagenesisbyPCROverlapExtension）

設(shè)計(jì)并合成兩套用于PCR擴(kuò)增的引物，分別用于目的基因兩側(cè)半序列的擴(kuò)增，但在這兩套引物的5'-端均添加了欲插入的互補(bǔ)序列；經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，通過此互補(bǔ)序列進(jìn)行重疊延伸，生成完整的雙鏈DNA，即可將新的序列引入目的基因中現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五PCR融合的缺失誘變

（DeletionMutagenesisbyPCRFusion）

使用兩套引物分別擴(kuò)增欲缺失片段兩側(cè)的序列（此兩套引物的5‘-端序列互補(bǔ)）；利用兩套擴(kuò)增產(chǎn)物5'-端的互補(bǔ)序列進(jìn)行退火重疊并進(jìn)行第二輪PCR延伸，獲得完整的突變體現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五例子：S.pn的ply146aa缺失的突變序列構(gòu)建

S.Pn的ply為一細(xì)胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大減弱。構(gòu)建突變體作為疫苗：首先設(shè)計(jì)4個(gè)引物：（M1和M2完全重疊）P1:5’-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3’BamHIP2:5’-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3’XhoIM1:5’-GGTCAATAATGTCCCA---AGAATGCAGTATG-3’M2:5’-CATACTGCATTCT---TGGGACATTATTGACC-3’現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五突變位點(diǎn)M2M1P2P15’5’5’3’3’5’為酶切位點(diǎn)序列以基因組DNA為模板，以P1和M1為引物擴(kuò)增出ply上游片斷，以P2和M2為引物擴(kuò)增出ply下游片斷，以上下游片斷為模板，以P1和P2為引物，擴(kuò)出全長(zhǎng)，酶切后克隆到質(zhì)粒，測(cè)序鑒定?，F(xiàn)在是38頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五溶血活性檢測(cè)突變蛋白的表達(dá)純化圖1.獲得目的突變蛋白，純度在85%以上圖2.△Ply為突變蛋白，其不具有溶血活性?，F(xiàn)在是39頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五2-6蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用舉例1）定點(diǎn)突變與蛋白質(zhì)藥物工程：如胰島素2）以融合蛋白形式提高活性3）定點(diǎn)突變提高酶的穩(wěn)定性4）抗體工程：嵌合抗體和生產(chǎn)人源化的抗體等現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五1）人胰島素改造人胰島素結(jié)構(gòu)：

A鏈有21個(gè)氨基酸（11種）

B鏈有30個(gè)氨基酸（15種）共16種51個(gè)氨基酸組成A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個(gè)半胱氨酸中的巰基形成兩個(gè)二硫鍵，連接A、B兩鏈A鏈中，A6(Cys)與A11(Cys)之間存在一個(gè)二硫鍵

現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五20世紀(jì)90年代中后期利用基因重組技術(shù)，通過對(duì)“天然人胰島素”的氨基酸序列進(jìn)行局部修飾，研發(fā)出一類新的降糖激素——“人胰島素類似物”非胰島素，但可與胰島素受體相結(jié)合，降糖效力堪與人胰島素媲美，且其藥代動(dòng)力學(xué)的某些特點(diǎn)比目前臨床使用的胰島素更加符合生理需求其面世，大大改進(jìn)了糖尿病的胰島素治療效果現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（1）速效人胰島素類似物aspart（諾和銳）諾和銳是中國(guó)上市的第一個(gè)速效胰島素類似物分子的聚合減少，從而迅速地解離為單體，吸收更快。藥代動(dòng)力上的改變：皮下注射后10～20分鐘起效，可有效降低餐后血糖。使其更快、更強(qiáng)、更方便。lispro（賴脯胰島素）：將原來胰島素b鏈上28位的脯氨酸與29位的賴氨酸

位置互換?，F(xiàn)在是43頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（2）長(zhǎng)效人胰島素類似物（1）來得時(shí)（lantus，甘精胰島素）特點(diǎn)：等電點(diǎn)由5.4到7.0，藥物吸收緩慢穩(wěn)定，作用持久。（3）高效胰島素

HisB10Asp,活力是天然胰島素的11.7倍?，F(xiàn)在是44頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五

2）融合蛋白形成提高活性腦啡肽N端5肽線形結(jié)構(gòu)是與δ型受體結(jié)合的功能域干擾素（IFN）是廣譜抗病毒、抗腫瘤的細(xì)胞因子黎孟楓：化學(xué)合成該5肽的編碼區(qū)，通過一“連接3肽”的編碼區(qū)與人α1-IFN基因連接成重組DNA分子，以大腸桿菌為生物反應(yīng)器，表達(dá)這一融合蛋白結(jié)果：明顯提高其抑瘤活性（人結(jié)腸腺癌細(xì)胞和多形膠質(zhì)瘤細(xì)胞為模型）現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五圖5.DnaJ-?Ply和?Ply-DnaJ蛋白抗原性的WesternBlot分析?Ply-DnaJ融合蛋白提高抗原的免疫原性1、是否具有抗原性分析M：蛋白marker1：?Ply-DnaJ2：DnaJ-?PlyDnaJ-?Ply和?Ply-DnaJ蛋白都可以被DnaJ和Ply的抗血清識(shí)別M1212DnaJPly現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五血清中抗DnaJ特異性IgG效價(jià)唾液中抗DnaJ特異性sIgA效價(jià)2、抗原性是否提高的分析現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五3、對(duì)S.pn鼻咽部及肺部定植的保護(hù)效果分析S.pnCMCC(B)31693(serotype19F)1×108CFUi.n.粘膜免疫DnaJ-?Ply能夠顯著降低S.pnCMCC(B)31693(serotype19F)的鼻咽部及肺部定植，與DnaJ組相比*P<0.05，***P<0.001現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五

3）提高酶蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

葡萄糖異構(gòu)酶（GI）

在工業(yè)上廣泛應(yīng)用于高果糖漿的生產(chǎn)。將其體外定點(diǎn)誘變：138位的Gly變

Pro含突變體的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)結(jié)果：突變型GI比野生型的熱半衰期長(zhǎng)一倍最適反應(yīng)溫度提高10～12℃酶比活相同現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五T4溶菌酶：

第3位異亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，與97位形成二硫鍵，熱穩(wěn)定性顯著提高?，F(xiàn)在是50頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（1）嵌合抗體4）抗體工程如：用于治療直腸結(jié)腸腺癌的Mab17-1A是第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)用于癌癥治療的嵌合單抗現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（2）人源化抗體盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但是有時(shí)仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng).CDR：Ig可變區(qū),

與抗原識(shí)別直接相關(guān)，是Ig的抗原結(jié)合部位，故稱為互補(bǔ)決定區(qū).“CDR移植技術(shù)”把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)，產(chǎn)物被稱為CDR移植抗體或改型抗體，也即人源化抗體.該移植術(shù)可進(jìn)一步降低鼠源成分，從而進(jìn)一步減少免疫反應(yīng)現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五第一個(gè)臨床上應(yīng)用的人源化抗體CAMPATH－1H,用于治療淋巴肉芽腫病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，盡管療效顯著，但仍有半數(shù)以上的患者有免疫反應(yīng)ANTI－CD33被用于治療脊髓性白血病，其免疫反應(yīng)較少?，F(xiàn)在是53頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)工程小結(jié)蛋白質(zhì)工程匯集了當(dāng)代分子生物學(xué)等多學(xué)科的一些前沿領(lǐng)域的最新成就。它把核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與生物功能結(jié)合起來研究，開創(chuàng)了按照人類意愿改造、創(chuàng)造符合人類需要的蛋白質(zhì)的新時(shí)期。

它將蛋白質(zhì)與酶的研究推進(jìn)到嶄新的時(shí)代，為蛋白質(zhì)和酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥方面的應(yīng)用開拓了誘人的前景?，F(xiàn)在是54頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五3酶工程（EnzymeEngineering）3-1酶工程及其相關(guān)概念3-2酶工程發(fā)展簡(jiǎn)史3-3國(guó)內(nèi)外酶制劑工業(yè)的現(xiàn)狀3-4酶工程的熱點(diǎn)和展望3-5常見的酶在生產(chǎn)和生活中的應(yīng)用現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五

3-1酶工程及其相關(guān)概念

1）酶及酶工程的定義（1）酶（enzyme)

生物催化劑（biocatalyst）

由活細(xì)胞產(chǎn)生

在細(xì)胞內(nèi)、外對(duì)其特異底物起高效催化作用

本質(zhì)是蛋白質(zhì)和RNA

現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五**優(yōu)點(diǎn)：常溫、常壓下發(fā)揮作用許多反應(yīng)如無酶催化時(shí)，則需要在高溫、高壓、極端的pH條件下才能進(jìn)行而以酶為催化劑則可在常溫、常壓及中等的pH條件下進(jìn)行生物催化（Biocatalysis）：利用酶或有機(jī)體（細(xì)胞或細(xì)胞器等）作為催化劑實(shí)現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化的過程?，F(xiàn)在是57頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五

（2）酶工程定義

1）“酶工程”一詞1971年問世

是由酶學(xué)理論與化學(xué)工程技術(shù)、基因工程技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新的技術(shù)學(xué)科，是現(xiàn)代生物技術(shù)的主要組成部分之一；

它從應(yīng)用的角度，研究酶的生產(chǎn)及其在各方面的應(yīng)用，即是酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的技術(shù)過程。

現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五

酶工程=酶制劑的生產(chǎn)+酶制劑的應(yīng)用酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用的大致過程：現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五

2）酶工程分類

(1)化學(xué)酶工程（初級(jí)酶工程）酶學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物主要研究?jī)?nèi)容：自然酶的開發(fā)酶的化學(xué)修飾酶的固定化酶反應(yīng)器和酶的應(yīng)用

(2)生物酶工程（高級(jí)酶工程）在化學(xué)酶工程基礎(chǔ)上發(fā)展的、酶學(xué)與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物其研究包括：酶基因的克隆表達(dá)酶的遺傳修飾酶的遺傳設(shè)計(jì)

現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五

3-2酶工程發(fā)展簡(jiǎn)史

現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五1）酶的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)研究（1）1684年，比利時(shí)醫(yī)生Helment提出“酵素”概念,指引起釀酒過程中物質(zhì)變化的因素（2）1777年，意大利科學(xué)家Spallanzani的山鷹實(shí)驗(yàn)（3）1822年，美外科醫(yī)生Beaumont研究食物在胃里的消化（4）1836年，德國(guó)科學(xué)家施旺獲得胃蛋白酶（5）1878年，德國(guó)科學(xué)家?guī)炷幔↘?hne）提出

“enzyme”—希臘文的“inyeast”（6）1897年，德國(guó)巴克納（Buchner）證明發(fā)酵是酶作用的化學(xué)本質(zhì)以及酶的細(xì)胞外作用現(xiàn)象，奠定了酶的商品化生產(chǎn)的基礎(chǔ)現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五1822年18歲的加拿大人圣馬丁因槍支走火不幸將肚子打了個(gè)小孔，經(jīng)外科醫(yī)生博蒙特（WilliamBeaumont）給他包扎冶療，在胃部和體表之間遺留下一個(gè)永久性的瘺管。博蒙特突發(fā)奇想，何不用圣馬丁的胃當(dāng)實(shí)驗(yàn)室，觀察食物的消化情況？征得圣馬丁的同意，他讓圣馬丁住在家中，通過胃瘺吸取胃液做試驗(yàn)。經(jīng)過11年的觀察，博蒙特公布了他的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：“胃液是一種最普通的天然溶劑，它能溶解各種食物，即使是堅(jiān)硬的骨頭也經(jīng)不住溶解；并且，胃液對(duì)食物的作用純粹是一個(gè)化學(xué)過程。隨后，人們又經(jīng)過一系列的化學(xué)實(shí)驗(yàn)，終于發(fā)現(xiàn)黃色胃液的化學(xué)成分中最精華的成分是胃蛋白酶（施旺，1836）。從此，生物體內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)——酶開始登上了歷史舞臺(tái)現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（7）1926年美國(guó)的薩姆那（Sumner）從刀豆中得到脲酶結(jié)晶，首次提出酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)（8）1963年測(cè)定第一個(gè)牛胰RNaseA序列（124aa）（9）1965年揭示卵清溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)（129aa）（10）1970美國(guó)Smith發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶

（11）核酶的發(fā)現(xiàn)，改變了有關(guān)酶的概念

**1982年，Cech等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲細(xì)胞的26SrRNA前體具有自我剪接功能，將這種具有催化活性的天然RNA稱為核酶—Ribozyme**1983年，Altman等人發(fā)現(xiàn)RNaseP的RNA組分具有加工tRNA前體的催化功能；而RNaseP中的蛋白組分則沒有催化功能，只起穩(wěn)定構(gòu)象的作用（美國(guó)T.Cech和Altman于1989年共獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（1）酶工程的雛形最原始的酶工程要追溯到游牧?xí)r代，是人們對(duì)酶的“無意識(shí)”應(yīng)用：通過happyaccident，發(fā)現(xiàn)并利用動(dòng)物的胃液來凝固牛乳（凝乳酶）制奶酪，以便于貯存人類在4000多年前就已掌握的釀酒和制醬技術(shù)，也是酶作用的結(jié)果春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期已知用麴(曲)治療消化不良2）酶工程及酶工業(yè)的發(fā)展現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（1）1894年日本的高峰讓吉從米曲霉中制備得到淀粉酶，用作消化劑，開創(chuàng)了近代酶的生產(chǎn)和應(yīng)用先例。在開發(fā)使用酶的早期，商品酶制劑主要以動(dòng)植物為原料來提取，包括：

從豬的胰臟中取得胰蛋白酶來軟化皮革

從木瓜的汁液中取得木瓜蛋白酶來防止啤酒混濁

用大麥麥芽的多種酶來釀造啤酒

從牛胃中提取凝乳酶

從血液中提取凝血酶

從植物材料中提取淀粉酶等

由于受到原料來源和分離純化技術(shù)的限制，難于進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)（2）酶工程的形成現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（2）自1945年，隨著微生物培養(yǎng)技術(shù)、發(fā)酵工業(yè)和設(shè)備的漸漸完善，利用微生物來獲得商品化酶制劑已形成規(guī)?；a(chǎn)業(yè)，所能夠制備的酶制劑品種愈來愈多，并開辟了廣闊的市場(chǎng)迄今，以微生物為酶制劑來源仍占據(jù)酶工程的半壁江山。（3）1960年，法國(guó)的雅各（Jacob）和莫諾德（Monod）提出操縱子學(xué)說，闡明了酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，為酶的生物合成調(diào)節(jié)提供了理論依據(jù)，推動(dòng)了酶發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)?，F(xiàn)在是67頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（4）20世紀(jì)50年代后，由于酶制劑生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，酶的應(yīng)用也越來越廣泛，包括:食品加工制革工業(yè)紡織工業(yè)醫(yī)療衛(wèi)生能源開發(fā)環(huán)境工程氨基酸、有機(jī)酸和半合成抗生素的合成工業(yè)現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五優(yōu)點(diǎn)：1、不溶于水，易于與產(chǎn)物分離2、可反復(fù)使用3、可連續(xù)化生產(chǎn)4、穩(wěn)定性好缺點(diǎn)：

1、固定化過程中酶易失活

2、需要純化的酶5）1969：日本固定化氨基?；?，第一次將固定化酶成功地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)——酶工程誕生現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（6）20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展的動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，也為酶的生產(chǎn)提供了一條新途徑---將其在人工控制的生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，通過細(xì)胞的生命活動(dòng)，得到人們所需的各種產(chǎn)物，包括各種酶

通過植物細(xì)胞培養(yǎng)獲得SOD,木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、過氧化物酶、糖化酶、糖苷酶等

通過動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)得到血纖溶酶原激活劑、膠原酶等

α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖異構(gòu)酶、果膠酶、凝乳酶、乳糖酶、脂肪酶、各種蛋白酶等，已經(jīng)商品化現(xiàn)在是70頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五生物酶潤(rùn)澤面膜：含有木瓜蛋白酶膠囊，具有卓越清除老廢角質(zhì)、污垢和護(hù)膚功效。

1990年推出的SOD系列化妝品，是中國(guó)首家從植物中提取超氧化物歧化酶（SOD）當(dāng)作化妝品原料生產(chǎn)的護(hù)膚品，具有養(yǎng)顏、防曬、增白的雙重功效。酶的用途舉例1-護(hù)膚品現(xiàn)在是71頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五酶制劑已成為現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)必不可少的一種重要原料。占全球抗生素產(chǎn)品銷售額70％的β內(nèi)酰胺類抗生素（青霉素與頭孢菌素類）其原料生產(chǎn)就離不開酶，其中包括青霉素?；?、青霉素裂解酶以及可將６-APA擴(kuò)環(huán)成為７-ADCA（半合成頭孢菌素的主要原料）的特種酶等等。葡萄糖異構(gòu)酶：用于生產(chǎn)高果糖漿，是目前世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。酶的用途舉例2-醫(yī)用酶現(xiàn)在是72頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五

（7）酶改性天然酶除了具有高效、專一的優(yōu)點(diǎn)之外，同時(shí)也存在著一些不足--酶活力不足、穩(wěn)定性較差--本質(zhì)是蛋白質(zhì)，遇到高溫、強(qiáng)酸/堿時(shí)其活性就會(huì)降低，甚至完全失活；非極性原料溶解度差，難以獲得非極性產(chǎn)物等。手段：酶分子修飾、酶的非水相催化和酶的定向進(jìn)化等現(xiàn)在是73頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（8）新一代酶工程

通過基因重組來改造酶的特性及生產(chǎn)酶的微生物特性，以建立優(yōu)良的生產(chǎn)體系，是最新一代的酶工程。它可以：**改善原有酶的各種性能

如：提高酶產(chǎn)量、增加酶的穩(wěn)定性、更易提取和應(yīng)用等**可將有害的、未獲批準(zhǔn)的微生物產(chǎn)生的酶基因或生長(zhǎng)緩慢的動(dòng)植物的酶基因克隆到安全的、迅速生長(zhǎng)的產(chǎn)量很高的微生物體內(nèi)，以提高酶產(chǎn)量和改善酶品質(zhì)。現(xiàn)在是74頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五

世界上最大的工業(yè)酶制劑生產(chǎn)廠商丹麥的諾和諾德公司(NovoNordisk)生產(chǎn)酶制劑的菌種中約80%是

基因工程菌。例如：尿激酶是治療腦血栓的特效藥以前：從人尿中提取，繁瑣，產(chǎn)量也非常有限現(xiàn)在：從人腎細(xì)胞中分離出尿激酶基因，通過DNA重組和重組分子對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，便可讓該工程菌來生產(chǎn)人尿激酶；生產(chǎn)效率大大提高現(xiàn)在是75頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五

再如：通過基因重組改造并獲得產(chǎn)酶性能優(yōu)秀的菌種，最典型例子是α-淀粉酶的生產(chǎn)：最初從豬胰提取隨著酶工程進(jìn)展，用芽孢桿菌來生產(chǎn)：

1m3菌液中的酶量=幾千頭豬的胰臟的酶量后來，酶工程學(xué)家將這種芽孢桿菌的α-淀粉酶基因與枯草桿菌的DNA重組，獲得的菌“繁殖更快、產(chǎn)生的α-淀粉酶性能更好”，產(chǎn)量提高數(shù)千倍。所以，有人說“基因工程是生物工程的靈魂”

現(xiàn)在是76頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（9）酶的分離純化技術(shù)的進(jìn)展將生產(chǎn)出來的酶進(jìn)行分離純化，以提高酶純度的技術(shù)。

經(jīng)過各國(guó)科學(xué)家的不懈努力，這些技術(shù)得到逐步改進(jìn)，酶的生產(chǎn)水平不斷提高，為酶的應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?，F(xiàn)在是77頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五（10）人工酶（synzymes)的研究近年，酶工程的一個(gè)新的熱門課題是人工合成新酶，也就是人工酶，即人工合成的具有類似酶活性的高聚物，其必需具有2個(gè)特殊部位：一是底物結(jié)合位點(diǎn)（容易），一是催化位點(diǎn)（難！?。┖铣扇斯っ傅碾y度很大，它要求人們弄清楚：*酶是如何進(jìn)行催化的？*催化作用的關(guān)鍵部位？*這些關(guān)鍵部位有什么特點(diǎn)？

……

最后，對(duì)人工酶還有另一層要求，那就是簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)現(xiàn)在是78頁(yè)\一共有84頁(yè)\編輯于星期五基因工程蛋白質(zhì)工程發(fā)酵工程