電泳技術(shù)-方王楷課件

電泳（electrophoresis）電泳的基本原理帶電的膠?；虼蠓肿釉谕饧与妶鲋校驇喾措姾傻碾姌O作定向移動的現(xiàn)象稱為電泳。生物分子都帶電荷，其電荷的多少取決于分子性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH及其組成。由于混合物中各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量以及分子量的不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異。因此，在一定時間內(nèi)各組分移動的距離不同，從而達(dá)到分離鑒定各組分的目的。在電場中，推動帶電質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動的力（F）等于質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷量（Q）與電場強(qiáng)度（X）的乘積。F＝QX

質(zhì)點(diǎn)的前移同樣要受到阻力（f

）的影響，對于一個球形質(zhì)點(diǎn)，服從Stoke定律，即：f＝6πrην（r為質(zhì)點(diǎn)半徑，η為介質(zhì)粘滯系數(shù)，ν為質(zhì)點(diǎn)移動速度）在具體實(shí)驗(yàn)中，移動速度V為單位時間t（單位為s）內(nèi)移動的距離d（單位為cm），即V＝d/t。電場強(qiáng)度X為單位距離L（單位為cm）內(nèi)電勢差E（單位為伏特），即X＝E/L。將這兩個公式代入上述公式，得到U=v/X=dL/Etd=u*Et/L由此可以得到兩種物質(zhì)移動距離的差為△

d=(dA-dB)=(uA-uB)Et/L從這個公式可以看出物質(zhì)能否進(jìn)行分離決定于二者的遷移率。

影響因素1.

待分離大分子的性質(zhì)：所帶的電荷、分子大小和形狀，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快2.緩沖液pH和離子強(qiáng)度：pH值距離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大；但是pH過高或過低引起蛋白變性，緩沖液通常要保持一定的離子強(qiáng)度；強(qiáng)度過低，則緩沖能力差，不易維持PH恒定，離子強(qiáng)度過高，在待分離分子周圍形成較強(qiáng)的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離子氛），降低了蛋白質(zhì)的帶電量，使電泳速度減慢。一般所用離子強(qiáng)度為0.02-0.2之間。3.電場強(qiáng)度：過高，產(chǎn)熱，樣品和Buffer擴(kuò)散增加，條帶增寬；蛋白變性。過低，電泳時間增加，擴(kuò)散。當(dāng)需要增大電場強(qiáng)度以縮短電泳時間時，需附有冷卻裝置4.電滲：在電場中液體對固體支持物的相對移動；當(dāng)電滲方向與電泳方向一致時，會加快顆粒泳動速度，反之，當(dāng)兩者方向相反時，會減慢顆粒泳動速度。5.支持介質(zhì)的篩孔：篩孔越小，則顆粒在移動的過程中所受到的阻力也就越大

聚丙烯酰胺電泳（PAGE）血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳目的：1.掌握醋酸纖維膜電泳的基本原理及其臨床意義2.熟悉電泳儀器的使用和操作原理：

血清蛋白在pH8.6的巴比妥緩沖液中以負(fù)離子形式存在，分子大小、形狀各有差異。在電場作用下，可在醋酸纖維膜上分離成。A、α1、α2、β、γ五條區(qū)帶。電泳結(jié)束后，將醋酸纖維膜置于染色液。使蛋白固定并染色，再脫色（洗去多余染料）。將染色后的區(qū)帶分別剪開，將其溶與堿液，進(jìn)行比色測定，計算各區(qū)帶的百分?jǐn)?shù)。4、定量

1）取6支試管并編號，分別加入0.4N氫氧化鈉4ml。

2）剪下各條蛋白帶和在膜空白部位剪一條帶（空白帶的寬度以最窄的條帶為準(zhǔn)，why？），將各條帶浸入試管，不時搖動，洗脫藍(lán)色。

3）光光度計比色，波長為650nm，以空白薄膜條洗出液為空白對照，讀取其它5管的光密度值。

5、計算總吸光度

光密度總和T＝A＋α1＋α2＋β＋γ

各部分蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)：

蛋白質(zhì)％＝A/T×100％

+白蛋白(A)α1α2

βγ等電聚焦電泳不同物質(zhì)由于帶電性質(zhì)不同，因而在一定的電場強(qiáng)度下移動的方向和速度不同,可以進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)具有許多可解離的酸性基團(tuán)（－COOH）和堿性基團(tuán)（－NH2）及其它基團(tuán),在一定溶液的pH條件下可解離成帶正電荷或負(fù)電荷的基團(tuán)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，成為兼性離子，凈電位為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

NH3++OH－NH3++OH－NH2

PPPCOOH＋H＋COO－＋H＋COO－蛋白質(zhì)的陽離子蛋白質(zhì)的兼性離子蛋白質(zhì)的陰離子

操作步驟及注意要點(diǎn)

凝膠配制：

a取10×0.5cm內(nèi)徑的玻璃管，從一端量出7cm作好標(biāo)記，用橡皮片封底（用兩條橡皮圈扎緊），垂直放置。b按實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)page17配制凝膠液（按順序，每加一種試劑后都要輕輕充分搖勻，TEMED最后才加入，加入搖勻后要立即灌膠），用長滴管吸取配好的凝膠液，沿玻璃管注入至7ml標(biāo)記平面，緩緩注入，避免產(chǎn)生氣泡。c立即用5ml注射器配針頭注入約0.5cm高的蒸餾水，垂直放置（將長滴管及時清洗）

注意：丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。

電泳將已聚合的凝膠去除水層，垂直插入電泳槽的橡皮管中，注意不要漏液。上槽注入5%H3PO4，下槽注入2%NaOH，檢查凝膠管上下口內(nèi)有無氣泡，如有必須排除。上槽接正極，下槽接負(fù)極，50V預(yù)電泳3