藥品質(zhì)量管理+儀器分析課件

藥品質(zhì)量檢測技術(shù)儀器分析

教學(xué)目標(biāo)1.掌握紫外分光光度法及可見分光光度法的基本原理2.掌握色譜法基本理論

3.了解分光光度法和色譜法在工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究中的應(yīng)用

知識要點(diǎn)1.吸收光譜與物質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系和光吸收基本定律

2.色譜法基本理論

技能要點(diǎn)1.紫外-可見分光光度計的應(yīng)用2.GC、HPLC、TLC的基本應(yīng)用

學(xué)習(xí)目標(biāo)一、概述分光光度法：測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)對光的吸收度，對物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的方法稱為分光光度法。主要包括:紫外分光光度（電子光譜）法：吸收光波長范圍200～400nm，可用于物質(zhì)的定性和定量分析?？梢姺止夤舛龋娮庸庾V）法：吸收光波長范圍400～760nm，主要用于有色物質(zhì)的定性和定量分析。二者合稱為紫外-可見分光光度法即UV-ViS紅外分光光度法（IR，分子振-轉(zhuǎn)光譜）：利用紅外吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行分析的方法，吸收光波長范圍2.5—1000m，主要用于已知結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物鑒別（定性）二、紫外-可見分光光度法光的基本特性物質(zhì)對光的選擇性吸收吸收定律紫外吸收光譜的應(yīng)用紫外-可見分光光度計

單色光：單波長的光（由具有相同能量的光子組成）白光（太陽光）：由各種單色光組成的復(fù)合光如果把適當(dāng)顏色的兩種光按一定強(qiáng)度比例混合，也可成為白光，這兩種顏色的光稱為互補(bǔ)色光。白光綠500-580橙600-650黃580-600紅650-780紫400-450藍(lán)450-480青藍(lán)480-490青490-500光的互補(bǔ)色示意圖物質(zhì)對光的選擇性吸收物質(zhì)的顏色是基于物質(zhì)對光有選擇性吸收的結(jié)果而物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色則是被物質(zhì)吸收光的互補(bǔ)色。-胡羅卜素咖啡因阿斯匹林丙酮幾種有機(jī)化合物的分子吸收光譜圖吸收定律吸光度：單色光通過溶液時被吸收的程度，用A表示。朗伯（Lambert）和比耳（beer）分別于1760年和1852年研究了光的吸收與有色溶液按液層的厚度及溶液濃度的定量關(guān)系，奠定了分光光度分析法的理論基礎(chǔ)。如果同時考慮溶液的濃度和液層的厚度都變化，都影響物質(zhì)對光的吸收，則上述兩個定律可合并為朗伯-比耳定律，得到：A=Kbc此式為光吸收定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式。

式中A稱為吸光度；K是比例常數(shù)，與入射光的波長、物質(zhì)的性質(zhì)和溶液的溫度等因素有關(guān)。質(zhì)量吸收系數(shù)a當(dāng)c的單位為g/L，b的單位為cm時，K用a表示，稱為質(zhì)量吸收系數(shù)這時朗伯-比耳定律為：

A＝abc。在藥品檢驗(yàn)中經(jīng)常使用的是百分吸收系數(shù)，用（E1%1cm）表示。物理意義:當(dāng)吸光物質(zhì)溶液濃度為1%(1g/100mL)，液層厚度為1cm時，在一定條件下的吸收度。

摩爾吸收系數(shù)ε

當(dāng)式中濃度c的單位為mol/L，液層厚度的單位為cm時，則用另一符號ε表示，稱為摩爾吸收系數(shù)，它表示物質(zhì)的濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時，溶液的吸光度。其單位為L/mol·cm。這時朗伯-比耳定律就變?yōu)椋?/p>

A＝εbc紫外吸收光譜的應(yīng)用鑒別：同一物質(zhì)在相同條件下，測得的紫外-可見吸收光譜應(yīng)具有完全相同的特征。對比吸收光譜特征參數(shù)比較吸收度比值的一致性對比吸收光譜的一致性雜質(zhì)檢查：藥物與雜質(zhì)的吸收光譜有明顯差別含量測定：朗伯-比耳定律對照品比較法吸收系數(shù)法計算分光光度法光源

鎢燈或鹵鎢燈——可見光源，325～2500nm氫燈或氘燈——紫外光源，185～375nm單色器（分光系統(tǒng)）包括狹縫、透鏡系統(tǒng)（準(zhǔn)直鏡）和色散元件

吸收池（比色皿）玻璃—能吸收紫外光，僅適用于可見光區(qū)；石英—不能吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)；要求：匹配性（對光的吸收和反射應(yīng)一致）

為了消除誤差提高測量的準(zhǔn)確度，兩只比色皿應(yīng)配套使用檢測器（又叫接受器、光電轉(zhuǎn)化器）光電池光電管光電倍增管（檢測弱光常用）二極管陣列檢測器紫外-可見分光光度計的類型

單光束分光光度計:常用的有751G型、752型、721型、722型。雙光束分光光度計：常用的有710型、730型、UV-210型等。雙波長分光光度計：與單波長分光光度計的主要區(qū)別在于采用雙單色器。T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計

紅外光譜產(chǎn)生的條件

紅外光的能量應(yīng)恰好能滿足振動能級躍遷所需要的能量，當(dāng)紅外光的頻率與分子中某基團(tuán)的振動頻率相同時，紅外光的能量才能被吸收。紅外光與物質(zhì)之間有耦合作用。分子必須有偶極矩的變化?！铩锛t外光譜法的應(yīng)用

定性分析研究分子結(jié)構(gòu)：如確定分子的空間構(gòu)型，求化學(xué)鍵的力常數(shù)、鍵長和鍵角及未知化合物的結(jié)構(gòu)鑒定等。

定性分析官能團(tuán)的定性分析、已知化合物的鑒定①官能團(tuán)的定性分析★肯定法：根據(jù)紅外光譜的特征吸收峰，確認(rèn)某基團(tuán)的存在。如某化合物的IR譜，在官能團(tuán)區(qū)1740cm-1有吸收→C=O，在指紋區(qū)1300cm-1~1150cm-1范圍內(nèi)有兩個強(qiáng)吸收峰→C－O，根據(jù)官能團(tuán)區(qū)及指紋區(qū)的這三個相關(guān)峰：否定法：基于某個波數(shù)區(qū)間內(nèi)的吸收峰對某個基團(tuán)是特征的，在譜圖中若無此吸收峰出現(xiàn)，則說明此基團(tuán)在分子中不存在。②已知化合物的鑒定

用標(biāo)準(zhǔn)試樣對照將試樣的譜圖與標(biāo)準(zhǔn)樣品的譜圖進(jìn)行對照。與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照在沒有純凈的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時，可用標(biāo)準(zhǔn)譜圖比較?！镂粗锝Y(jié)構(gòu)分析未知物結(jié)構(gòu)分析的一般步驟如下：①了解與試樣性質(zhì)有關(guān)的其他資料了解來源元素分析的結(jié)果相對分子質(zhì)量熔點(diǎn)、沸點(diǎn)等物理性質(zhì)和有關(guān)的化學(xué)性質(zhì)由元素分析結(jié)果和相對分子質(zhì)量推算出分子式計算不飽和度：n1－1價原子數(shù)目n3－3價原子數(shù)目n4－4價原子數(shù)目★☆★規(guī)定：雙鍵(C=C、C=O)、飽和環(huán)狀結(jié)構(gòu)：Ω=1；叁鍵(C≡C)：Ω=2；苯環(huán)：Ω=4。分子結(jié)構(gòu)式中達(dá)到飽和時所缺一價元素的對數(shù)，每缺兩個一價元素時，不飽和度為一個單位②試樣的制備和紅外光譜的制作被分析的試樣應(yīng)該是純物質(zhì)

純物質(zhì)可以通過對試祥進(jìn)行分離和精制的方法(如分餾、萃取、重結(jié)晶、層析等)得到

根據(jù)試樣的性質(zhì)，按照試驗(yàn)條件制作紅外光譜圖③譜圖的解析首先觀察官能團(tuán)區(qū)，解析第一強(qiáng)吸收峰屬于何種基團(tuán)的特征吸收峰。如，羰基(C=O)在1820cm-1~1600cm-1有強(qiáng)吸收峰，其中：1820cm-1~1750cm-11750cm-1~1725cm-11740cm-1~1720cm-11740cm-1~1720cm-1

找出該基團(tuán)的全部或主要相關(guān)蜂，包括該基團(tuán)在指紋區(qū)的吸收峰，進(jìn)一步確認(rèn)該基團(tuán)的存在。然后解析第二強(qiáng)峰及其相關(guān)峰。確定分子中各個基團(tuán)或化學(xué)鍵所連接的原子或原子團(tuán)，以及與其他基團(tuán)的結(jié)合方式，并結(jié)合相對分子質(zhì)量、不飽和度以及其他儀器分析結(jié)果等有關(guān)資料，推測分子的結(jié)構(gòu)。④與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對照

在相同的實(shí)驗(yàn)條件下操作，將得到的紅外光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比較，若兩張譜圖吸收峰的位置和形狀完全相同，峰的相對強(qiáng)度一樣，可以認(rèn)為樣品與該種已知物是同一物質(zhì)。例某未知物分子式為C8H8O，其IR譜如圖所示，試推測未知物的分子結(jié)構(gòu)。解：(1)根據(jù)分子式計算不飽和度：Ω＝1+8+(0-8)/2＝5苯環(huán)及CH3的C—H伸縮振動苯環(huán)的骨架振動單取代苯C=O的伸縮振動。因分子式中只有一個氧原子，不可能是酸或酯，只可能是酮，而且分子中有苯環(huán)，很可能是芳香酮。CH3的C—H對稱彎曲振動δs(CH)CH3的C—H反對稱彎曲振動δas(CH)(2)圖譜解析綜上所述，該化合物中有一個單取代的苯環(huán)、一個羰基(估計是芳香酮羰基)、一個甲基，根據(jù)分子式，推測未知物的結(jié)構(gòu)式可能是:總結(jié)：3000cm-1、1600cm-1~1500cm-1苯環(huán)的骨架振動、指紋區(qū)760cm-1，692cm-1單取代苯1681cm-1強(qiáng)峰為C=O的伸縮振動1363cm-1CH3的C—H1430cm-1CH3的C—H定量分析紅外光譜定量分析是通過對特征吸收譜帶強(qiáng)度的測量來求出組份含量。其理論依據(jù)是朗伯-比耳定律。由于紅外光譜的譜帶較多，選擇的余地大，所以能方便地對單一組份和多組份進(jìn)行定量分析。此外，該法不受樣品狀態(tài)的限制，能定量測定氣體、液體和固體樣品。因此，紅外光譜定量分析應(yīng)用廣泛。但紅外光譜法定量靈敏度較低，尚不適用于微量組份的測定。紅外光譜儀色散型IR譜儀：利用單色器作為色散元件傅立葉IR譜儀：利用光的干涉作用進(jìn)行測定，沒有色散元件第二節(jié)色譜法一、色譜法概述二、薄層色譜法三、氣相色譜法四、高效液相色譜法一、色譜法概述

色譜法的來源色譜法(chromatography)早在1903年由俄國植物學(xué)家茨維特最先發(fā)明并定義，他在研究植物葉的色素成分時，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。他稱之為色譜。這種方法因此得名為色譜法，又稱層析法。以后此法逐漸應(yīng)用于無色物質(zhì)的分離色譜分離過程

色譜分離的原理

當(dāng)流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當(dāng)?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測。兩相及兩相的相對運(yùn)動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)

色譜法分類二、薄層色譜法(TLC)(thinlayerchromatography)

TLC的概念、分類、特點(diǎn)概念：

TLC法系將供試品溶液點(diǎn)于薄層板上，在展開容器內(nèi)用展開劑展開，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的對照物按同法所得的色譜圖對比，并可用薄層掃描儀進(jìn)行掃描，用于鑒別、檢查或含量測定。

分類：

吸附薄層色譜：固定相為吸附劑，適于異構(gòu)體的分離

原理：產(chǎn)生差速遷移而得到分離

分配薄層色譜：固定相為液體，適于同系物的分離

原理：利用樣品中各組分在固定相與流動相之間的分配系數(shù)差別而實(shí)現(xiàn)分離

膠束薄層色譜：以表面活性劑膠束溶液為展開劑的薄層色譜

原理：被分離組分在水、膠束和固定相三者之間形成分配平衡特點(diǎn)

方法簡便易行，容易掌握；不需考慮雜質(zhì)的污染問題，對樣品凈化程度的要求低；在一塊薄層板上可以同時展開多個樣品，分析時間短；展開后的薄層可以用不同的掃描條件反復(fù)掃描比較，只要所測的斑點(diǎn)穩(wěn)定，還可存放到需要時再測定；可選用各種不同顯色劑噴霧顯色，有助于定性鑒別。載板：

具有一定機(jī)械強(qiáng)度、化學(xué)惰性、耐一定溫度、表面平整、厚度均勻，價格合理，常用為玻璃板。

玻璃板的常用規(guī)格：5×20cm、10×20cm、20×20cm，要求光滑、平整、洗凈后不附水珠、干燥。TLC的基本材料

固定相或載體：

硅膠：常用極性吸附劑，具表面活性中心，略帶酸性氧化鋁：常用極性吸附劑，具表面活性中心，略帶堿性硅藻土：中性吸附劑纖維素：液-液分配色譜擔(dān)體（水為固定液），具一定粘性聚酰胺：特殊有機(jī)薄層材料硅膠G(含粘合劑煅石膏)，GF254(含254nm熒光劑)，硅膠H(不含粘合劑)，硅膠HF254點(diǎn)樣器：

常用微升毛細(xì)管或手動、半自動、全自動點(diǎn)樣器。

展開容器：上行展開可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽展開缸，展開時須能密閉；水平展開用專用的水平展開缸。

顯色裝置：

噴霧顯色用玻璃噴霧瓶或?qū)Ｓ脟婌F器；浸漬顯色用專用玻璃器械或用適宜的展開缸代用；蒸氣熏蒸顯色用雙槽展開缸或適宜大小的干燥器代替。

檢視裝置：

為裝有可見光、254nm及365nm紫外光源及相應(yīng)的濾光片的暗箱，可附加攝像設(shè)備供拍攝圖像用。TLC的基本操作除另有規(guī)定外，將1份固定相和3份水（或加有黏合劑的水溶液）在研缽中按同一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地移動涂布器進(jìn)行涂布（厚度為0.2~0.3mm），取下涂好薄層的玻板，置水平臺上于室溫下晾干后，在110℃烘30分鐘，即置有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度，在反射光及透視光下檢視，表面應(yīng)均勻、平整、光滑、無麻點(diǎn)、無氣泡、無破損及污染。制備

點(diǎn)樣：

一般為圓點(diǎn)狀或窄細(xì)的條帶狀，點(diǎn)樣基線距底邊10~15mm，圓點(diǎn)狀直徑一般不大于3mm，條帶狀寬度一般為5~10mm；點(diǎn)間距一般不少于8mm。

展開：

準(zhǔn)備：在展開缸中加入適量的展開劑，密閉保持15~30分鐘。

展開方式：上行、下行、近水平、雙向展開等，多采用上行展開。

（b）直立式展開1－色譜缸2－薄層板3－展開劑4－展開劑蒸氣（a）傾斜上行法展開1－色譜缸2－薄層板3－展開展開：將點(diǎn)好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑的深度為距原點(diǎn)5mm為宜，密閉。一般展開8~15cm。溶劑前沿達(dá)到規(guī)定展距，取出薄層板，晾干，待檢測。顯色與檢視：

對有色物質(zhì)，展開后可直接檢視；對無色物質(zhì)可在紫外燈(254nm或365nm)下，觀察有無暗斑或熒光斑點(diǎn)，記錄其顏色、位置及強(qiáng)弱。適用于有熒光的物質(zhì)或少數(shù)有紫外吸收的物質(zhì)；

熒光薄層板(如硅膠GF254板)檢測，在254nm紫外光燈下觀察熒光板上的熒光淬滅物質(zhì)形成的色譜；既無色，又無紫外吸收的物質(zhì)可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色，或加熱顯色，在日光下檢視。

定性鑒別：利用Rf值進(jìn)行定性鑒別定量分析TLC的應(yīng)用

原點(diǎn)到組分斑點(diǎn)質(zhì)量中心的距離Rf值=原點(diǎn)到溶劑前沿的距離三、氣相色譜法(GC)(gaschromatography)

GC的概念、分類、特點(diǎn)及應(yīng)用對象分類

氣相色譜

氣液分配色譜

填充柱氣相色譜

毛細(xì)管柱氣相色譜

概念

GC法系采用氣體為流動相（載氣）流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測定的色譜方法。特點(diǎn)

應(yīng)用范圍廣

應(yīng)用對象

具有揮發(fā)性或在一定溫度下能夠汽化的物質(zhì)

不揮發(fā)或熱不穩(wěn)定的物質(zhì)可衍生化后分析

某些大分子物質(zhì)和高聚物可用裂解色譜法分析

分離效率高，分析速度快

樣品用量少，靈敏度高選擇性好

氣相色譜儀國產(chǎn)氣相色譜儀氣相色譜儀的構(gòu)成

氣路系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)溫控系統(tǒng)氣路系統(tǒng)作用：獲得純凈、流速穩(wěn)定的載氣。包括氣源、壓力計、流量計及氣體凈化裝置等。

常用的載氣：H2、He、N2、Ar

載氣的要求：化學(xué)惰性，不與有關(guān)物質(zhì)反應(yīng)。載氣的選擇除了要求考慮對柱效的影響外，還要與分析對象和所用的檢測器相匹配。

載氣的來源：

氣體鋼瓶和減壓閥：壓力表多為兩級壓力指示氣體發(fā)生器：氮?dú)狻錃?、空氣及一體機(jī)

進(jìn)樣系統(tǒng)構(gòu)成：進(jìn)樣器、進(jìn)樣口、氣化室等

要求：

進(jìn)樣量或體積要適宜、準(zhǔn)確；采用常規(guī)色譜柱分離，進(jìn)樣體積幾至幾十微升；對毛細(xì)管柱分離，體積約為10-2~10-3μL；體積過大或進(jìn)樣過慢，將導(dǎo)致分離變差（拖尾）；進(jìn)樣針最大容量與進(jìn)樣量要匹配。

汽化室要求：體積小；熱容量大；對樣品無催化作用包括：填充柱和毛細(xì)管柱（或開管柱）

分離系統(tǒng)

填充柱：多為U形或螺旋形；內(nèi)徑2~6mm；長1~3m；內(nèi)填固定相。毛細(xì)管柱：分為涂壁、多孔層和涂載體開管柱，內(nèi)徑0.1~0.5mm，長達(dá)幾十至100m，通常彎成直徑10~30cm的螺旋狀；其特點(diǎn)為滲透性好、傳質(zhì)快，分離效率高（n可達(dá)106）、分析速度快、樣品量小。

作用對象：氣化室、柱箱、檢測器

控溫方式：恒溫和程序升溫

溫控系統(tǒng)

作用：將經(jīng)色譜柱分離后順序流出的化學(xué)組分的信息轉(zhuǎn)變?yōu)楸阌诩o(jì)錄的電信號，然后對被分離物質(zhì)的組成和含量進(jìn)行鑒定和測量。常用的檢測器：氫火焰離子化檢測器(Flameionizeddetector，F(xiàn)ID)熱導(dǎo)檢測器(Thermalconductivitydetector，TCD)電子捕獲檢測器(Electroncapturedetector

，ECD)質(zhì)譜檢測器(MSD)即氣相—質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測系統(tǒng)

主要用于可在H2-Air火焰中燃燒的有機(jī)化合物（如烴類物質(zhì)）的檢測。通用型檢測器主要對含有較大電負(fù)性原子的化合物響應(yīng)。它特別適合于環(huán)境樣品中鹵代農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯等微量污染物的分析。質(zhì)譜是唯一可以給出分子量,確定分子式的方法,而分子式的確定對化合物的結(jié)構(gòu)鑒定是至關(guān)重要的四、高效液相液相色譜法(HPLC)(highperformanceliquidchromatography)

HPLC的概念、分類、特點(diǎn)及應(yīng)用HPLC系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測定的色譜方法。

根據(jù)分離機(jī)制不同，分為液固吸附色譜、液液分配色譜、化學(xué)鍵合色譜、離子交換色譜、分子排阻色譜等概念分類利用保留值作為定性參數(shù)；利用在樣品中加入對照品，通過峰值增高來確認(rèn)；利用LC-MS聯(lián)用儀，通過被分離物的質(zhì)譜圖與譜庫的譜圖對比來定性；利用二極管陣列檢測器給出UV光譜與對