谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶課件

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶2011級食品科學目錄第一、介紹第二、分離與純化第三、理化性質(zhì)的研究第四、應用前景第一、介紹

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase，EC2．3．2．13，簡稱TGase)是一種催化酰基轉(zhuǎn)移反應的轉(zhuǎn)移酶。它具有多種催化功能，能催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間發(fā)生交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解反應，從而直接改變蛋白質(zhì)本身及蛋白質(zhì)所附著的細胞、組織等的結(jié)構(gòu)和功能特性。因此，TGase在食品、生物醫(yī)藥、組織工程、紡織和皮革工業(yè)中都有著廣泛的應用前景。1.2谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活測定方法

Grossowicz比色法測定酶活力，以Nα-CBZ-Gln-Gly和羥胺為作用底物，以L-谷氨酸-γ-單羥肟酸作標準曲線。一個谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活力單位定義為：37℃時每分鐘催化形成1μmolL-谷氨酸γ-單羥肟酸的酶量為一個酶單位。從標準曲線求出酶活：酶活力/（U/mL）=7.9835×A525×稀釋倍數(shù)/101.3提取經(jīng)過初步試驗，確定食用菌中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是一種胞外酶。從新鮮香菇子實體中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶的工藝流程為：分別測定香菇、平菇、金針菇、杏鮑菇的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗提液的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性，結(jié)果分別為0.261、0.116、0.115、0.276U/mL。可見不同菌種的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性有較大的差異，香菇和杏鮑菇的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性較強，平菇、金針菇的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的酶活性較弱，從它們的比活性來看，杏鮑菇最高，但市場上杏鮑菇的價格遠遠比香菇貴，且香菇容易獲得，所以選用香菇作為以后的試驗材料。乙醇沉淀取粗提取液100mL，按V（提取液）∶V（乙醇）=1∶1；V（提取液）∶V（乙醇）=1∶1.5；V（提取液）∶V（乙醇）=1∶2體積分數(shù)比分別加入經(jīng)預冷至0℃的95％乙醇，迅速攪拌，將混和液離心（3℃，10000r/min，10min），所得沉淀用0.2mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.0）溶解，再次以相同的條件離心，取上清液定容于100mL，測定酶活，計算酶活收率。（酶活收率分別為40％、38．7％、40．8％）丙酮沉淀法實驗方法與乙醇相同。（酶活收率為59.2％）飽和硫酸銨沉淀室溫下，加不同量的硫酸銨到100mL經(jīng)超濾后的提取液（預冷至0℃）中，形成濃度為20％、40％、60％、80％的硫酸銨溶液，保持6h后，離心（10000r/min、3℃、5min），將所得沉淀用0.2mol/LTris-HCl緩沖液（pH6.0）溶解，再次以相同的條件離心，取上清液定容于100mL，測定酶活，計算酶活收率。（在60%時酶活最高，達到56.9%）不同沉淀法對酶收率的影響分別采用60%飽和硫酸銨沉淀、95%乙醇與丙酮沉淀法對粗酶進行沉淀分離，3種沉淀法的酶活收率分別為56．9%、43．6%、59.2%。結(jié)果表明用丙酮和飽和硫酸銨沉淀的酶活收率要比乙醇沉淀酶活收率稍高一些。但是飽和硫酸銨沉淀法在酶液中引入了水溶性無機鹽，需要進行脫鹽等步驟，較繁瑣。有機溶劑沉淀法則不需脫鹽及多次分離等步驟，過程短，且其為揮發(fā)性液體，在干燥中可揮發(fā)成氣體而不殘留，或僅留其痕跡。而考慮到作為食品用酶，最好不用丙酮沉淀法，所以最終采用乙醇沉淀。3.5金屬離子對酶活的影響在酶反應體系中分別加入相同濃度（1mg/L）的各種金屬離子（Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Cu2+），37℃保溫10min測定谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶酶活。以不加任何金屬離子的酶活為參照。3.6底物濃度對反應速度影響分別加入底物（0.03mol/L）0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，每支試管各加入0.2mL濃縮酶液，37℃反應10min，各管加0.2mol/LTris-HCl緩沖液至1.6mL，分別測定酶活性，求出反應速率，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法求得米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vmax。3.7純酶的最適溫度取濃縮酶液，分別在20、30、40、50、60℃下測定酶活，以最高點酶活為100%。

由圖2可見，香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶的最適溫度在40℃左右，在30℃～50℃范圍內(nèi)有較高活性，當溫度大于50℃后活性急劇下降。從圖3可見，香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶在50℃以下保持其穩(wěn)定性，高于50℃時酶的穩(wěn)定性變差，活性喪失較快。這是因為酶在穩(wěn)定升高到一定限度時，就會發(fā)生高級結(jié)構(gòu)的變化失去部分催化活性，酶發(fā)生的肽鏈伸展隨穩(wěn)定不同而有不同的伸展速度，溫度越高，肽鏈伸展加深，直至變性，完全失去活性。從圖5可看出，粗酶在pH5.0~7.0左右穩(wěn)定性最好。結(jié)果如表2所示，離子強度對酶活的影響不大由圖6可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增加，酶促反應速度顯著加快，當?shù)孜餄舛却笥?.5g/L時反應速度不再顯著增加，酶促反應速率接近Vmax。

做Lineweaver-Burk圖（圖7），根據(jù)測定結(jié)果得到米氏方程1/V=74.593×1/[S]+49.07，Vmax=0.020g/（L·min），米氏常數(shù)Km=1.520g/L。3.8結(jié)論香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶和純酶酶學性質(zhì)研究結(jié)果顯示：香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶最適溫度為40℃，溫度穩(wěn)定范圍在50℃以下，最適pH6.0，pH穩(wěn)定范圍為pH5.0~7.0。香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶促反應的Vmax為0.020g/（L·min），米氏常數(shù)Km為1.520g/L。Na+、Ca2+、Pb2+、K+、Mg2+、Cu2+等離子對谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶酶活影響甚微，該酶為非Ca2+依賴性酶。第四、應用前景

谷氨酰胺酶在食品、醫(yī)藥（研究癌細胞方面）、紡織（如改善羊毛制品性能）等方面都有廣闊的應用前景，其中在食品行業(yè)應用最受關(guān)注。4.1在肉制品中的應用肌球蛋白和肌動蛋白是肌肉的重要組成成分，是谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用的良好底物。在肉制品加熱時，彼此間能夠形成二硫鍵，對維持肉制品的保水性和粘彈性等方面起著重要的作用。在肉制品中加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，經(jīng)催化反應在肌肉蛋白質(zhì)分子間形成的共價鍵的作用力遠遠大于二硫鍵，能使蛋白質(zhì)更緊密地結(jié)合在一起，形成致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顯著提高了產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、改善了肉制品品質(zhì)、增加了產(chǎn)品的附加價值。4.2在乳制品中的應用乳制品中的酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白等是谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用的良好底物，所以谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在乳制品加工中具有很高的應用價值。牛乳酪蛋白是重要的食品蛋白質(zhì)，在許多食品的加工中，加入酪蛋白可以改善產(chǎn)品的品質(zhì)[9]。經(jīng)過谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶改性后的酪蛋白，在功能性質(zhì)方面得到顯著增強，是優(yōu)良的食品添加劑，可應用于焙烤食品、冰淇淋，也可作為脂肪的替代物，用于香腸、重組肉制品、魚制品。4.3在水產(chǎn)品中的應用魚肉在低溫下可形成凝膠，這與其內(nèi)源性谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的含量有關(guān)。新鮮的魚含有較多的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，可以生產(chǎn)出高品質(zhì)的魚凝膠制品，但經(jīng)過冷凍貯藏后的魚，其內(nèi)源性谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的含量隨新鮮程度的下降而減少，因此可以通過加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶提高一些產(chǎn)品的凝膠強度，加