微生物蛋白酶的分

微生物蛋白酶的分第1頁/共32頁微生物蛋白酶的分子和生物技術(shù)方面的概述MolecularandBiotechnologicalAspectsofMicrobialProteases第2頁/共32頁

第3頁/共32頁一.蛋白酶的來源蛋白酶來源廣，數(shù)量多，用途廣。蛋白酶是重要工業(yè)酶之一，約占世界范圍酶總量的60%。根據(jù)蛋白酶來源，可將其分為植物蛋白酶（PlantProteases），動物蛋白酶（AnimalProteases），微生物蛋白酶（MicrobialProteases）。第4頁/共32頁第5頁/共32頁第6頁/共32頁細(xì)菌蛋白酶主要為芽孢桿菌屬產(chǎn)生的酸性和堿性蛋白酶。中性蛋白酶最適pH5~8，耐熱性相對較低。一些中性蛋白酶是金屬蛋白酶，其活性需金屬二價離子；而一些是絲氨酸蛋白酶，不受螯合物影響。堿性蛋白酶最適pH為堿性，有很寬的底物特異性。廣泛用于洗滌工業(yè)。第7頁/共32頁真菌蛋白酶真菌產(chǎn)蛋白酶多于細(xì)菌。eg：Aspergillusoryzae（米曲霉）產(chǎn)生酸性，中性，堿性蛋白酶。但是真菌蛋白酶的反應(yīng)速率和耐熱性都低于細(xì)菌。酸性蛋白酶最佳pH4~4.5，用于奶酪制作行業(yè)。中性蛋白酶是金屬蛋白酶，在pH為7時有活性，可被螯合物抑制。用于食品行業(yè)中蛋白脫苦。堿性蛋白酶也用于食品中蛋白的改造。第8頁/共32頁病毒蛋白酶已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種病毒中含ser，asp，cys蛋白酶。主要用于病毒自身蛋白的加工。所有病毒編碼的都是內(nèi)肽酶，無金屬蛋白酶。研究最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒的天冬氨酰蛋白酶。它是病毒組裝和復(fù)制必須的，是病毒多聚蛋白前體的一部分。前體經(jīng)過自我催化成為成熟的蛋白酶。第9頁/共32頁

二.蛋白酶的分類1.按作用部位分為2.按活性部位的功能基分為

﹛外肽酶內(nèi)肽酶第10頁/共32頁

外肽酶外肽酶分Aminopeptidase和carboxypeptidase。氨肽酶多為胞內(nèi)酶，廣泛存在于細(xì)菌和真菌中。它從多肽鏈N端水解下一個氨基酸殘基，二肽或是三肽。羧肽酶作用于多肽鏈的C端，水解下一個氨基酸或是二肽。據(jù)酶活性位點氨基酸殘基的特點，可將羧肽酶分為:絲氨酸羧肽酶，金屬羧肽酶，半胱氨酸羧肽酶。第11頁/共32頁

內(nèi)肽酶

據(jù)催化機制可分為ser蛋白酶，asp蛋白酶，cys蛋白酶和金屬蛋白酶。1.Ser蛋白酶：其四個家族（糜蛋白酶簡寫SA，枯草桿菌蛋白酶簡寫SB，羧肽酶C簡寫SC,大腸桿菌D-Ala–D-Ala肽酶A簡寫SE）基本結(jié)構(gòu)完全不相關(guān)，表明ser蛋白酶至少有四個獨立的進(jìn)化來源。Ser蛋白酶第一大亞類是ser堿性蛋白酶，底物特異性與糜蛋白酶類似但沒它嚴(yán)格。第二大亞類是枯草桿菌蛋白酶，已發(fā)現(xiàn)兩種，有共同活性位點ser221，his64，asp32。第12頁/共32頁2.Asp蛋白酶：是一類催化活性依賴asp的內(nèi)肽酶。多數(shù)在低pH時表現(xiàn)最大活性?；钚晕稽cAsp-Ser/Thr-Gly。被胃酶抑素抑制。3.Cys/巰基蛋白酶：催化活性包括Cys和His催化二分體。通常只在有還原基團(tuán)（HCN或Cys）存在下才有活性。中性至堿性pH。對巰基化合物敏感，但不受DFP和金屬螯合物影響.4.金屬蛋白酶：活性依賴二價金屬離子?；钚砸妆或衔锉热鏓DTA抑制，但不受巰基化合物或DFP的影響。研究最多的是嗜熱菌蛋白酶和膠原酶。第13頁/共32頁三.蛋白酶的應(yīng)用Proteaseshavealargevarietyofapplications,mainlyinthedetergentandfoodindustries.Inviewoftherecenttrendofdevelopingenvironmentallyfriendlytechnologies,proteasesareenvisagedtohaveextensiveapplicationsinleathertreatmentandinseveralbioremediationprocesses.例如：用于洗滌劑的堿性蛋白酶應(yīng)有1）廣泛的底物特異性，以加速多種污跡的去除。2）在洗滌劑各種助劑如螯合劑、氧化劑等共存下穩(wěn)定。納豆激酶：溶栓作用。第14頁/共32頁四.蛋白酶動力學(xué)機制研究蛋白酶動力學(xué)，必先純化，純化方法有親和層析，離子交換層析，凝膠過濾層析等。1.絲氨酸蛋白酶：據(jù)其底物偏好可分為：類胰蛋白酶，類糜蛋白酶和類彈性蛋白酶。絲氨酸蛋白酶含有Ser-His-Asp催化三聯(lián)體。

Itinvolvesatwo-stepreactionforhydrolysis.Thisacylationstepisfollowedbyadeacylationprocesswhichoccursbyanucleophilicattackontheinterme-diatebywater,resultinginhydrolysisofthepeptide.2.天冬氨酸蛋白酶：通過晶體結(jié)構(gòu)分析可得出催化特異性。酸堿催化分析得出活性位點有Asp-Thr-Gly基團(tuán)。第15頁/共32頁第16頁/共32頁3.金屬蛋白酶：X射線晶體結(jié)構(gòu)分析得出，其活性依賴于一個二價金屬離子（通常是鋅離子）結(jié)合到His-Glu-Xaa-Xaa-His基團(tuán)。金屬蛋白酶活性可因透析或加入螯合物而失掉。4.半胱氨酸蛋白酶：植物中木瓜蛋白酶被認(rèn)為是半胱氨酸蛋白酶的原始類型和這類酶的很好例子。它們催化肽，巰基酯和硫羰基酯鍵的水解。水解機制與絲氨酸蛋白酶非常相似。第17頁/共32頁第18頁/共32頁五.蛋白酶的生理學(xué)功能Ingeneral,extracellularproteasescatalyzethehydrolysisoflargeproteinstosmallermoleculesforsub-sequentabsorptionbythecellwhereasintracellularproteasesplayacriticalroleintheregulationofmetabolism.1.蛋白更新：例如大腸桿菌中，ATP依賴性蛋白酶負(fù)責(zé)非正常蛋白的水解。真核生物胞內(nèi)蛋白酶的更新也受到ATP依賴性蛋白酶的影響。第19頁/共32頁2.芽孢和孢子釋放：用蛋白酶抑制劑證實芽孢形成需要蛋白酶。提高蛋白酶A的活性與酵母二倍體子囊孢子的形成有關(guān)。3.休眠孢子的萌發(fā)：休眠孢子中，絲氨酸內(nèi)肽酶降解蛋白質(zhì)生成的氨基酸和氮為新蛋白質(zhì)和核苷酸類的生物合成提供原料。4.酶的修飾：許多蛋白酶是以酶原的形式存在。

Kex-2蛋白酶是真核酶前體加工處理的典型。通過特異性裂解羧基末端殘基對，催化激素原和分泌途徑的完整膜蛋白的水解。第20頁/共32頁

腸激酶胰蛋白酶原————————

胰蛋白酶

胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶原—————胰凝乳蛋白酶疏水氨基酸存在下胃蛋白酶原——————————自我催化為胃蛋白酶胃蛋白酶激活或自我催化凝乳酶原——————————————凝乳酶第21頁/共32頁5.細(xì)胞營養(yǎng)：蛋白酶水解較大肽鏈為小肽和氨基酸，有助于被細(xì)胞吸收。胞外酶由于脫聚合化活性在細(xì)胞營養(yǎng)中占重要作用。6.基因表達(dá)調(diào)控：ATP依賴性蛋白酶有新的生理學(xué)功能，可作為蛋白分子伴侶，介導(dǎo)蛋白水解，蛋白絡(luò)合物的分解和聚合化。此外，蛋白酶還介導(dǎo)許多調(diào)節(jié)蛋白的分解。第22頁/共32頁六.微生物蛋白酶的基因改造基因工程—基因工程微生物—目的：提高產(chǎn)量，闡明結(jié)構(gòu)，蛋白工程。1.細(xì)菌1）芽孢桿菌屬：一些芽孢桿菌屬分泌兩種主要的工業(yè)用蛋白酶，即枯草桿菌蛋白酶（堿性蛋白酶）和金屬蛋白酶（中性蛋白酶）?？莶菅挎邨U菌是芽孢桿菌屬蛋白酶基因克隆的宿主。第23頁/共32頁2）乳鏈球菌屬：其蛋白酶基因主要在質(zhì)粒上，分為PI型蛋白酶和PIII型蛋白酶。3）鏈霉菌屬：分泌兩種胞外蛋白酶A和B。DNA序列分析表明，這兩種蛋白酶都是先產(chǎn)生酶前體，然后再切去N末端前肽。兩種蛋白酶編碼區(qū)域的高度同源性表明sprA和sprB肯定來源于基因復(fù)制。4）假單胞菌屬

：P.

aeruginosa分泌兩種蛋白酶，一種堿性蛋白酶和彈性蛋白酶。菌株P(guān)AO1的編碼堿性蛋白酶基因片段在啟動子tac控制下可在大腸桿菌中表達(dá)。第24頁/共32頁5）大腸桿菌：1>膜蛋白酶：跨膜蛋白酶以一個大的前體形式存在，它的氨基末端有信號肽。前體的加工包括兩個連續(xù)的過程，一是通過內(nèi)切將信號肽去掉。二是消化切去的信號肽。2>ATP依賴的蛋白酶:大腸桿菌中有三個家族，細(xì)胞提取物的體外分析表明主要的ATP依賴活性是lon蛋白酶。6）蛋白酶的IgA家族：核酸序列分析表明酶以大的前體形式存在，它有三個結(jié)構(gòu)域，即N末端前肽，蛋白酶，和C末端”協(xié)助“肽。這些酶前體的前肽部分（信號肽）作用是幫助酶的跨膜轉(zhuǎn)運。

第25頁/共32頁2.真菌：絲狀真菌1）酸性蛋白酶：毛霉屬和根霉屬大量分泌asp蛋白酶。2）堿性蛋白酶

：曲霉菌屬，支頂胞屬，鐮刀菌屬

分泌堿性蛋白酶。3）絲氨酸蛋白酶：蛋白酶K是真菌分泌的絲氨酸外肽酶。4）金屬蛋白酶：酵母：1）酸性蛋白酶：釀酒酵母的PEP4基因編碼一種asp蛋白酶，是一種翻譯后調(diào)控的酵母液泡水解酶。2）堿性蛋白酶

3）絲氨酸蛋白酶3.病毒：研究最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒?；蛴虚L末端重復(fù)序列。第26頁/共32頁小結(jié)

研究目的

采用相應(yīng)的策略1.有效提高蛋白酶表達(dá)量

更換相應(yīng)蛋白酶的強啟動子。2.研究某一基因的表達(dá)調(diào)控克隆具高度同源性的基因，用基因敲除和基因突變技術(shù)。3.某一基因的同源性分析

克隆和測定DNA序列，同源性分析可找到共同祖先。4.某一基因的定位和定向

可通過基因敲除分析技術(shù)確定。第27頁/共32頁

七.蛋白質(zhì)工程快速發(fā)展歸功于重組DNA技術(shù)和定點突變技術(shù)。兩大主要任務(wù):基因鑒定和蛋白三維結(jié)構(gòu)分析。細(xì)菌中以枯草桿菌蛋白酶為例，二硫鍵的引入增強了其熱穩(wěn)定性。真菌中以天冬氨酸蛋白酶為例，用定點突變技術(shù)對其活性部位asp76突變?yōu)閟er，確定此此酶的底物結(jié)合位點特異性。第28頁/共32頁八.蛋白酶的序列同源性及進(jìn)化關(guān)系測定蛋白酶核苷酸和氨基酸序列—對比–闡明結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系。例如在四種中性蛋白酶中，17個殘基的氨基酸序列（包括活性位點his）高度保守，表明其活性位點有共同的三維結(jié)構(gòu)。同源性與許多因素有關(guān)，如結(jié)構(gòu)，功能，來源，活性部位等。序列同源性越高，表明進(jìn)化關(guān)系越近。第29頁/共32頁九.現(xiàn)存問題和解決方案1.增強熱穩(wěn)定性：位點特異性突變技術(shù)引入二硫鍵；用疏水氨基酸替換極性氨基酸。2.防止蛋白自