基因工程的主要操作技術(shù)及原理

基因工程的主要操作技術(shù)及原理第1頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四DNA提取總DNA提取1、植物總DNA提取2、動(dòng)物總DNA提取3、大腸桿菌總DNA提取4、質(zhì)粒DNA提取第2頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四總DNA提取DNA的應(yīng)用構(gòu)建基因組文庫：100kbSouthern雜交(包括RFLP)50kbPCR分離基因等50kb第3頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四因材施提根據(jù)不同研究需要，保證結(jié)構(gòu)的相應(yīng)完整性盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)保證提取樣品中不含對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑及高濃度的金屬離子在DNA提取過程中應(yīng)做到第4頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四1、植物細(xì)胞總DNA提取總原則：取材（盡量新鮮）液氮研磨裂解去蛋白和細(xì)胞物濃縮。第5頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四（1）CTAB法：CTAB(cetyltriethylammoniumbromide)(十六烷基三甲基溴化銨)原理：CTAB是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜并能與核酸形成復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到0.3mol/LNaCl時(shí)，從溶液中沉淀，通過離心就可將其與蛋白，多糖類物質(zhì)分開，在經(jīng)過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA。CTAB溶于乙醇或異丙醇進(jìn)而除去在高離子強(qiáng)度的溶液中(>0.7mol/LNaCl)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，不能沉淀核酸。CTAB溶液在低于15℃時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此，在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。另外，它還能保護(hù)DNA不受內(nèi)源核酸酶的降解。第6頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四高鹽提取低鹽沉淀高鹽溶解乙醇沉淀經(jīng)典的CTAB法使用兩種緩沖液，高鹽提取緩沖液：1％（冷凍干燥材料）或2％CTAB（新鮮材料）、0.7mol或1.4mol/LNaCl沉淀緩沖液：1％CTAB，不含Nacl第7頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四操作步驟1、取幼嫩的植物葉片（3-5g）剪碎液氮研磨成粉，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管內(nèi)。加入等體積的65℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液置于65℃的恒溫水浴搖床上1-2h(1.5h)。2、加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)，輕輕上下顛倒5分鐘，靜置5分鐘，之后于12000rpm離心10分鐘。3、吸取上層水相，重復(fù)步驟2一次。4、吸取上層水相，加入預(yù)冷2/3體積的異丙醇，輕緩顛倒2分鐘并置-20℃冰箱內(nèi)10min，待DNA沉淀后于12000rpm離心收集，收集的DNA于70%乙醇中洗2-3次。將棄去乙醇風(fēng)干后的DNA加適量水使其溶解。第8頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5、待DNA完全溶解后加入1-2μl不含RNAaseA（10mg/ml），37℃保溫1h以除去DNA中的RNA。6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿：異戊醇（24：1）輕輕上下顛倒10分鐘后10000rpm離心10分鐘。7、吸取上層水相并先后加入1/10體積的3M醋酸鈉及2倍總體積的預(yù)冷的無水乙醇，接著置于-20℃冰箱，10分鐘后10000rpm離心10分鐘，棄去無水乙醇，加入70％乙醇洗滌2-3次，風(fēng)干，最后將DNA溶于適量（200-500μl）TE中。8、待DNA完全溶解后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢查DNA的質(zhì)量并據(jù)已知的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)其濃度。調(diào)整濃度后的DNA置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

第9頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四CTAB法的優(yōu)點(diǎn)能很好地去除糖類雜質(zhì)對(duì)于含糖較高的材料可優(yōu)先使用。在提取時(shí)能同時(shí)得到高質(zhì)量的DNA及RNA?？筛鶕?jù)需要分別進(jìn)行純化，如只需要DNA，則可用RNase（核糖核酸酶）水解掉RNA。第10頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

(2)SDS法

利用高濃度的SDS，在較高溫度(55～65℃)條件下裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的做法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀(最常用的是加入5mol／L的KAc于冰上保溫，在低溫條件下KAC與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成不溶物)，離心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚／氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。第11頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四操作步驟1.將1g植物材料于液氮速凍，然后在研缽中將其磨碎，將粉末轉(zhuǎn)至2ml離心管中。2.加入1.2ml預(yù)熱至65℃的提取緩沖液(3V)，輕緩振蕩混勻，加入120μl20%SDS(達(dá)到終濃度2%)，混勻，置65℃水浴中放置30分鐘，不時(shí)顛倒混勻。3.加入0.45ml5M的醋酸鉀（1/10V），混勻，冰浴20分鐘，在10000rpm離心20min。需要的話，Miracloth紗布過濾除去沉淀，取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。4.加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻，12000rpm離心15min。第12頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四5.轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中，加入0.7V冰預(yù)冷異丙醇，輕輕顛倒混勻，（見絲狀沉淀）-20℃放置30分鐘沉淀核酸。6.25℃，12000rpm，離心10min，收集沉淀。7.棄上清，70％乙醇洗兩次。8.涼干DNA，溶于50μlddH2O（或TEbuffer），4℃保存?zhèn)溆?。?3頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四SDS法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：SDS法操作簡(jiǎn)單、溫和，也可提取到分子量較高的DNA。缺點(diǎn)：產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多。該方法所得的DNA樣品也可直接用于Southern雜交，但在限制性內(nèi)切酶消化時(shí)需加大酶用量，并適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。第14頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四2、動(dòng)物細(xì)胞總DNA提取取材，液氮研磨，裂解，去蛋白和細(xì)胞物，濃縮。裂解采用：SDS和蛋白酶K。第15頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四操作步驟切取組織5g左右,剔除結(jié)締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細(xì)越好)。倒入液氮,磨成粉末,加10ml分離緩沖液。加1ml10%SDS,混勻,此時(shí)樣品變得很粘稠。加50ul或1mg蛋白酶K,37℃保溫1-2小時(shí),直到組織完全解體。加1ml5mol/LNaCl,混勻,10000rpm離心數(shù)秒鐘。取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后,10000rpm離心5分鐘。第16頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

取上清加1/10體積3mol/LNaAc,及2倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。4℃，12000g離心10分鐘，棄上清。70%乙醇洗滌；4℃，12000g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)本步驟1次。自然干燥后加入1×TE或超純水30-50μl，4℃or-20℃保存。第17頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四3、大腸桿菌總DNA提取基本思路：（1）acultureofbacteriaisgrownandthenharvested（2）thecellsarebrokenopentoreleasetheircontents第18頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四裂解機(jī)械裂解化學(xué)裂解：溶菌酶orEDTAorbothSDS第19頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四(3)thiscellextractistreatedtoremoveallcomponentexcepttheDNA去蛋白：酚氯仿抽提(4)TheresultingDNAsolutionisconcentrated濃縮：乙醇，加單價(jià)陽離子，如Na+-20℃放置,離心。第20頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第21頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四操作步驟100ml細(xì)菌過夜培養(yǎng)液,5000rpm離心10分鐘,去上清液。加9.5mlTE懸浮沉淀,并加0.5ml10%SDS,50μl20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K,混勻,37℃保溫1小時(shí)。加1.5ml5mol/LNaCl,混勻。加1.5mlCTAB/NaCl溶液,混勻,65℃保溫20分鐘。用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm離心10分鐘,將上清液移至干凈離心管。用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干凈管中。第22頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四操作步驟加1倍體積異丙醇,顛倒混合,室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。4℃，12000g離心10分鐘，棄上清；70%乙醇洗滌；4℃，12000g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)本步驟1次;自然干燥后加入1×TE或超純水30-50μl，4℃or-20℃保存。第23頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四4、質(zhì)粒DNA提取如何區(qū)分細(xì)菌和質(zhì)粒DNA?二者DNA分子的構(gòu)型不同大腸桿菌染色體DNA構(gòu)型：線性的或開環(huán)的DNA分子質(zhì)粒：共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA(cccDNA)分子第24頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四堿法提取質(zhì)粒的原理pH值12.0～12.6。線性的DNA會(huì)被變性，兩條鏈徹底分開。而cccDNA則不會(huì)被變性。但氫鍵會(huì)被斷裂，互補(bǔ)的兩條鏈仍然會(huì)緊密地結(jié)合在一起。中性pH值cccDNA:迅速地復(fù)性。線性的染色體DNA:不能復(fù)性,聚集形成網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)。離心:在上清液cccDNA。沉淀中：線性DNA和細(xì)胞殘骸蛋白。第25頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四提取的主要步驟細(xì)菌的培養(yǎng)質(zhì)粒DNA的分離和純化細(xì)菌的收集和裂解第26頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四試劑溶液Ⅰ:50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0）溶液Ⅱ:0.2MNaOH，1%SDS溶液Ⅲ:醋酸鉀（3MKAc）緩沖液，pH4.8TE：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)苯酚/氯仿/異戊醇（25:

24:

1）乙醇（無水乙醇、70%乙醇）第27頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，接種于2.0mLLB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37℃、250g振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）。用2ml離心管收集培養(yǎng)菌液；4℃，12000g離心1分鐘，棄上清。加入100μl冰浴的質(zhì)粒提取液I，渦旋混勻。加200μl新配制的質(zhì)粒提取液II，蓋緊管口，輕輕顛倒數(shù)次，冰浴5分鐘。加150μl冰浴的質(zhì)粒提取液III，輕輕顛倒數(shù)次，冰浴5分鐘。操作步驟第28頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四操作步驟4℃，12000g離心5~10分鐘，將上清移至新離心管中，加入10μlRNA酶(1μg/μl)，37℃處理2小時(shí)。用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提，充分混勻；4℃，12000g離心5分鐘，將上清移入新的離心管中。加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)，充分混勻；4℃，12000g離心5分鐘，將上清移入新的離心管中。加2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，-20℃放置30分鐘~1小時(shí)。4℃，12000g離心10分鐘，棄上清。70%乙醇洗滌；4℃，12000g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)本步驟1次。自然干燥后加入1×TE或超純水30-50μl，4℃or-20℃保存。第29頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四氯化銫密度梯度離心法純化質(zhì)粒DNA

大腸桿菌染色體DNA構(gòu)型：線性的或開環(huán)的DNA分子因其具有游離的末端而易于解旋，故可結(jié)合相當(dāng)大量的EB分子浮力密度小。質(zhì)粒共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA(cccDNA)分子，由于沒有游離的末端，只能發(fā)生有限的解旋反應(yīng)，便限制了EB分子的結(jié)合數(shù)量，浮力密度大。第30頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四RNA的提取第31頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四防止RNA降解，抑制RNAse活性所有的組織中均存在RNA酶，人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染。需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時(shí)以上。材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,高壓滅菌。

DEPC:一種高活性的烷基化試劑。常用做核酸酶抑制劑(特別是用于滅活廣泛存在的核糖核酸酶)、組氨酸殘基修飾劑等。第32頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四DEPC使用方法DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物,因而使用時(shí)需小心。試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC處理水配制。第33頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四提取方法異硫氰酸胍熱苯酚法Trizol法mRNA3’末端含有多聚(A)+吸附純化第34頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四動(dòng)植物組織mRNA提取

1、無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶裝蒸餾水，然后加入0.1%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。

2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。第35頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四（一）動(dòng)植物總RNA提取-Trizol法

[適用范圍]:人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，(mg-g)[優(yōu)點(diǎn)]：無蛋白和DNA污染。[用途]：Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交，Poly(A)+分離。體外翻譯RNase封阻分析。分子克隆。第36頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

組織液氮研磨加Trizol（50-100mg/1mlTrizol）室溫放置5分鐘0.2ml氯仿/1mlTrizol離心取上清每mlTrizol液加0.5ml異丙醇室溫放置10min，離心取沉淀75%乙醇洗沉淀，干燥劇烈搖晃15秒，室溫放置2-3分鐘

12000×g，10minutes，4℃第37頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四（二）mRNA純化原理：mRNA3’末端poly(A)+，oligo(dT)纖維素oligd(T)高鹽緩沖液，mRNA特異的吸附低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA洗脫兩次oligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA第38頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四植物病毒RNA提取

取提純的病毒顆粒TMV等體積酚/氯仿抽提取上清等體積酚/氯仿抽提取上清等體積氯仿抽提乙醇沉淀第39頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四核酸電泳PCR擴(kuò)增分子雜交測(cè)序主要檢測(cè)技術(shù)第40頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四基本原理DNA或者RNA中磷酸基團(tuán)是呈離子態(tài)的，可以說DNA和RNA的多核苷酸鏈可以叫做多聚陰離子，在電場(chǎng)下會(huì)向正極移動(dòng)。

核酸電泳第41頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四DNA/RNA的瓊脂糖凝膠檢測(cè)第42頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四一、實(shí)驗(yàn)原理

電泳是現(xiàn)在用于分離和純化DNA/RNA片段的最常用技術(shù)。當(dāng)制備好的一塊“膠”即一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)并把它置于靜電場(chǎng)中，DNA/RNA分子將向陽極移動(dòng)，這是因?yàn)镈NA/RNA分子沿其雙螺旋骨架兩側(cè)帶有富含負(fù)電荷的磷酸根殘基。第43頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四當(dāng)DNA/RNA長(zhǎng)度增加時(shí)，來自凝膠的阻力就會(huì)增加，不同長(zhǎng)度的DNA/RNA片段就會(huì)出現(xiàn)不同的遷移率。因而就可依據(jù)DNA/RNA分子的大小使其分離。第44頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四分離長(zhǎng)度凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳200bp—近50kb聚丙烯酰胺凝膠電泳5—500bp分辨率高采用不同濃度的凝膠可以分辨范圍廣泛的DNA分子。第45頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四不同濃度瓊脂糖凝膠的分離范圍

凝膠中的瓊脂糖含量[%（W/V）]DNA/RNA分子的分離范圍（kb）0.35—600.61—200.70.8—100.90.5—71.20.4—61.50.2—320.1—2第46頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四EB染料溴化乙錠（EB）是一種吖啶類染料，它在紫外燈照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍，電泳后就可直接紫外燈照射下檢測(cè)瓊脂糖中的DNA。

第47頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四電泳緩沖液的組成

Tris—乙酸（TAE）Tris—硼酸（TBE）Tris—磷酸（TPE）其濃度約為50mmoL/L，PH為7.5—7.8，這些緩沖液均含有EDTA。這些緩沖液通常配制成濃縮液（母液），貯存于室溫。

第48頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四常用的電泳緩沖液的配制緩沖液使用液濃貯存液（每升）Tris—乙酸（TAE）1×：0.04moL/LTris—乙酸

0.001moL/LEDTA50×：242gTris堿57.7mL冰乙酸100mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)Tris—磷酸（TPE）1×：0.09moL/LTris—磷酸

0.002moL/LEDTA10×：108gTris堿15.5mL85%磷酸40mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)Tris—硼酸（TBE）0.5×0.045moL/LTris—硼酸

0.001moL/LEDTA5×：54gTris堿27.5g硼酸20mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)第49頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四電泳緩沖液比較緩沖液緩沖容量遷移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度復(fù)雜DNA混合物；超螺旋DNATBE很高較慢低分子量高價(jià)格昂貴，不常用TPE第50頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四加樣緩沖液

緩沖液類型

6×緩沖液貯存溫度I

0.25%溴酚藍(lán)

0.25%二甲苯青FF40%（W/V）蔗糖水溶液4℃II

0.25%溴酚藍(lán)

0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖水溶液室溫III

0.25%溴酚藍(lán)

0.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液4℃IV

0.25%溴酚藍(lán)

40%（W/V蔗糖水溶液）4℃V（堿性加樣緩沖液）

300mmoL/LNaoH6mmoL/LEDTA18%聚蔗糖水溶液

0．15%溴甲酚綠

0．25%二甲苯青FF4℃第51頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四加樣緩沖液可以增大樣品密度，以確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)，還可以使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操作更為便利。溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速率約為二甲苯青FF的2.2倍，

溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速率約與長(zhǎng)300bp的雙鏈線性DNA相同，而二甲苯青FF在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速率則與4kb雙鏈線性DNA相同。

第52頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)記

DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)記通常叫作DNAMarker,實(shí)驗(yàn)使用的DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)記，一般包括250bpladder，DL2000，DL5000，DL10000等，DNAMarker不僅可以作為凝膠中DNA片段長(zhǎng)度的一個(gè)標(biāo)記，還可以作為電泳的對(duì)照。第53頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第54頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第55頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四第56頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四將溫?zé)岘傊堑谷肽z床中，凝膠的厚度在3—5mm之間，凝固20—60min。第57頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四凝膠制備的注意事項(xiàng)1、配膠和電泳需要使用同一批次的緩沖液（一些限制酶緩沖液含有高濃度鹽，能減慢DNA的遷移，并可使臨近孔泳帶變斜）2、瓊脂糖要徹底熔化，時(shí)間不宜過長(zhǎng)3、EB含量要適當(dāng)4、凝膠應(yīng)存放在陰涼處，再次用時(shí)加入少量電泳液，再熔化5、檢查梳子6、拔取梳子時(shí)應(yīng)均勻用力，檢查凝膠孔的整齊度7、凝膠稍厚些，避免樣品溢出第58頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四注意事項(xiàng)與實(shí)驗(yàn)技巧制膠和加樣過程中要防治氣泡的產(chǎn)生。EB具有強(qiáng)誘變性，可致癌。必須戴手套操作，嚴(yán)格注意防護(hù)。凝膠一定要加熱熔解完全，均勻，可以對(duì)著光亮的地方看看清澈不清澈；一般情況下，梳子越薄而長(zhǎng)，條帶越好看；上樣量不宜過多，會(huì)造成條帶的相互擠壓；如果點(diǎn)樣孔多余，將樣點(diǎn)到中間，盡量避免邊緣效應(yīng)，中間電場(chǎng)比較均勻；做膠的緩沖液和跑膠的緩沖液濃度應(yīng)該一致；加樣時(shí)不要太快，讓其自然沉底，均勻分布在電泳孔內(nèi)，Tip頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否則樣品滲漏或DNA帶型不整齊；電泳開始時(shí)可以采用低電壓使其跑出孔后，再調(diào)高電壓。第59頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四遷移速率的決定因素

DNA的分子大小

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比。瓊脂糖濃度

一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。

DNA分子的構(gòu)象

超螺旋DNA移動(dòng)〉環(huán)狀〉線狀雙鏈DNA第60頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四電源電壓在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng),片段越大,因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍減小。電壓不得超過5v/cm。嵌入染料的存在

EB嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。。第61頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四

離子強(qiáng)度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。第62頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四聚丙烯酰胺凝膠電泳第63頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四原理

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N—tetramethylethylenediamine，簡(jiǎn)稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，簡(jiǎn)稱AP)或核黃素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE)。第64頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定；幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g；凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。第65頁，共79頁，2023年，2月20日，星期四凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)

分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

蛋白質(zhì)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5

核酸(RNA) 104 15–20 104–105