基因的分離與鑒定

基因的分離與鑒定第1頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DNA克隆片段的產(chǎn)生和分離重組體DNA分子的構(gòu)建及導(dǎo)入受體細(xì)胞基因克隆的實(shí)驗(yàn)方案克隆基因的分離重組子的選擇與鑒定第2頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四克隆的概念

克隆,是英文Clone

的音譯,它是由一個(gè)個(gè)體經(jīng)無(wú)性繁殖所產(chǎn)生后代的總稱，也可以是指用其它方式產(chǎn)生無(wú)性繁殖后代的技術(shù)。有兩個(gè)缺一不可的特征：既是無(wú)性生殖，又是遺傳同質(zhì)（相同的遺傳物質(zhì)）。第3頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一、目的基因的分離1.從生物基因組分離目的基因利用基因文庫(kù)篩選目的基因基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)利用mRNA或cDNA釣取目的基因第4頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.利用基因表達(dá)產(chǎn)物來(lái)獲取目的基因使用探針從cDNA文庫(kù)中篩選目的基因3.用酶學(xué)或化學(xué)方法合成目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶法合成目的基因PCR法合成目的基因化學(xué)合成目的基因胰島素基因、干擾素基因等市場(chǎng)化第5頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四二、目的基因的來(lái)源1.基因組DNA的非特異性斷裂2.染色體DNA的限制性內(nèi)切酶酶解3.通過(guò)mRNA合成cDNA4.人工體外合成DNA片段5.PCR擴(kuò)增特異性基因片段第6頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四三、DNA克隆片段分離的方法1.利用限制性內(nèi)切酶片段化基因組DNA

鳥槍法（shotgunapproch）：用限制性內(nèi)切酶消化給體基因組DNA，這種消化產(chǎn)物，不經(jīng)過(guò)凝膠電泳分部分離，就直接用來(lái)同載體分子作連接反應(yīng)的克隆方法。2.凝膠電泳法和蔗糖梯度離心法分離第7頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四重組DNA分子的構(gòu)建第8頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四構(gòu)建重組DNA分子的途徑第9頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第10頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四重組子分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）第11頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)化（transformation）：

將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制－修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。第12頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)化的方法：化學(xué)的方法(熱擊法)；使用化學(xué)試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)熱擊處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。第13頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四感受態(tài)細(xì)胞(Competentcells):

受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)

第14頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)：

Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)第15頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化100ml菌體培養(yǎng)至OD600=0.5，離心收集菌體用10ml冰冷的10mMCaCl2溶液懸浮菌體，離心用1ml冰冷的75mMCaCl2溶液懸浮菌體冰浴放置12-24小時(shí)，備用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：第16頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四取100μl感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50ng載體的重組DNA連接液，混勻冰浴放置半小時(shí)在42℃保溫2分鐘（熱脈沖）快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1-2分鐘加入1ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1小時(shí)（擴(kuò)增）涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第17頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟MDNA分子酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化第18頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長(zhǎng)在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性。在制備過(guò)程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無(wú)水無(wú)去污劑細(xì)菌原生質(zhì)體的制備第19頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四取0.2-1ml的原生質(zhì)體懸浮液（108-109個(gè)原生質(zhì)體），加入10-20μlDNA重組連接液，同時(shí)加入含有PEG1000和Ca2+的等滲溶液，混勻細(xì)菌原生質(zhì)體的再生：原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁。在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：第20頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四E.coli的電穿孔轉(zhuǎn)化

在高壓電場(chǎng)下使細(xì)胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個(gè)穿孔足夠大并可維持足夠的時(shí)間，使外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染第21頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)電穿孔轉(zhuǎn)化第22頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)染

是指轉(zhuǎn)化感染（Transfection來(lái)自于transfomation與infection）凡是以噬菌體（如M13）或病毒為載體，以轉(zhuǎn)化的方法將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法均稱為轉(zhuǎn)染。因此轉(zhuǎn)染就方法來(lái)說(shuō)與轉(zhuǎn)化是一樣的。第23頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5吸附：加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30℃保溫10分鐘轉(zhuǎn)染裂解：加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2小時(shí)，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選λ噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)第24頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四體外包裝顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)

將重組的λ噬菌體DNA或重組的柯斯載體DNA經(jīng)體外包裝成具有感染能體力的λ噬菌體顆粒，然后經(jīng)由在受體細(xì)胞表面上的λDNA接受位點(diǎn)，使這些帶有目的基因序列的重組體DNA注入大腸桿菌。第25頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)化率的定義：轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納DNA的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不長(zhǎng)）轉(zhuǎn)化率第26頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4X1011個(gè)分子（6.02X1017

/2686X660），也就是說(shuō)，每3400個(gè)pUC18分子才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞另一方面，在實(shí)際操作過(guò)程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2X1010個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說(shuō)，每200個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)細(xì)胞能接納pUC18DNA第27頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模。例如，某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/μg載體，經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個(gè)重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個(gè)重組克隆需要：104

/107

X10-2

==0.1μg載體DNA考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為：0.1/20%=0.5μg載體DNA載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5μg），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)化率的用途第28頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

載體及DNA重組分子方面：載體本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí)插入片段的大?。簩?duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低轉(zhuǎn)化率的影響因素第29頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

受體細(xì)胞方面：受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對(duì)大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高

轉(zhuǎn)化方法方面：受體細(xì)胞的預(yù)處理：影響最大供受體的比例：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化0.1ml感受態(tài)細(xì)胞50ngDNA原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化109

個(gè)原生質(zhì)體50ngDNA轉(zhuǎn)化方法：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化106

-107

/μgDNA原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105

-106

/μgDNAλ-DNA轉(zhuǎn)染107

-108

/μgDNA電穿孔轉(zhuǎn)化106-109

/μgDNA第30頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的37℃培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過(guò)程λ噬菌體轉(zhuǎn)染后的30℃培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增第31頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定擴(kuò)增操作的目的第32頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1.基因文庫(kù)的構(gòu)建2.cDNA基因克隆3.基因組DNA克隆4.基因定位克隆

基因克隆的實(shí)驗(yàn)方案第33頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

基因工程或DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能，或建立高效表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因工程菌（細(xì)胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。一般來(lái)說(shuō)，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個(gè)體的基因文庫(kù)，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫(kù)中挑出含有目的基因的重組克??；另一類是利用PCR擴(kuò)增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)。第34頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

基因文庫(kù)（genelibrary）：用重組DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的總DNA或染色體DNA的所有片段隨機(jī)地連接在載體上，然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中通過(guò)細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的克隆。當(dāng)制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就稱為某種生物的基因文庫(kù)。第35頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

同一定義也適用于線粒體或葉綠體ＤＮＡ的基因文庫(kù)。由于制備ＤＮＡ片段的切點(diǎn)是隨機(jī)的，所以每一克隆內(nèi)所含的ＤＮＡ片段即可能是一個(gè)或幾個(gè)基因，也可能是一個(gè)基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側(cè)的鄰近ＤＮＡ順序。第36頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

基因文庫(kù)的構(gòu)建就是利用所謂的“鳥搶法”，使基因組的DNA片段隨機(jī)地插入適當(dāng)?shù)妮d體中，引入細(xì)胞進(jìn)行大量繁殖而構(gòu)建的。第37頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略第38頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷超聲波處理：片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端全酶切：片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切：片段長(zhǎng)度可控，含有粘性末端，目的基因完整與載體連接如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇表達(dá)型載體第39頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞篩選含有目的基因的目的重組子菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法（篩選模型的建立）第40頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四鳥槍法操作的改進(jìn)使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率第41頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四在連接前將DNA片段進(jìn)行分級(jí)分離第42頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四凝膠DNA片段回收技術(shù)第43頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)不能獲得的最小長(zhǎng)度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)鳥槍法克隆目的基因的局限性第44頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因庫(kù)（genepool）

特定生物體全基因組的集合（天然存在）基因文庫(kù)（genelibraryorgenebank）

從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫(kù)分為：

基因組文庫(kù)（含有全部基因）

cDNA文庫(kù)（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）基因文庫(kù)的基本概念基因庫(kù)與基因文庫(kù)第45頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫(kù)，材料來(lái)自染色體DNA用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫(kù)，材料來(lái)自mRNA

在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時(shí)段的mRNA種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫(kù)一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫(kù)或胚胎組織cDNA文庫(kù)等。很顯然，cDNA文庫(kù)的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫(kù)基因文庫(kù)構(gòu)建的基本戰(zhàn)略第46頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因文庫(kù)的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫(kù)中任一基因存在的概率，它與基因文庫(kù)最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文庫(kù)中）的概率(一般期望99%)f=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小例如，人的單倍體DNA總長(zhǎng)為2..9x109

bp，基因文庫(kù)中克隆片段的平均大小為15kb，則構(gòu)建一個(gè)完備性為0.9的基因文庫(kù)至少需要45萬(wàn)個(gè)克?。欢?dāng)完備性提高到0.9999時(shí)，基因文庫(kù)至少需要180萬(wàn)個(gè)克隆基因文庫(kù)的完備性第47頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Forexample:

期望值為0.99，插入片斷為20kb的

E.coli(4.6×106bp)和human(3×109bp)基因組的克隆數(shù)的計(jì)算N

E.coli==1.1×103ln(1-0.99)ln[1-(2×104/4.6×106)]Nhuman==6.9×105

ln(1-0.99)ln[1-(2×104/3×109)]

這個(gè)例子說(shuō)明用質(zhì)粒載體（插入片斷5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文庫(kù)，只需要幾千個(gè)克隆；而真核生物則需要更大承載能力的載體。第48頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因文庫(kù)應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過(guò)大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度，避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域，以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選基因文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)第49頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

為了最大限度地保證基因在克隆過(guò)程中的完整性，用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過(guò)度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高基因組DNA的制備用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長(zhǎng)度一般在100kb左右。如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000kb大小的DNA片段基因文庫(kù)的構(gòu)建程序第50頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因組DNA的切割用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)第二，保證DNA片段大小均一超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對(duì)堿基識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機(jī)連為一體！第51頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四載體和受體的選擇

為了壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的λ-DNA或考斯質(zhì)粒；對(duì)于大型基因組（如動(dòng)植物和人類）需使用YAC或BAC載體由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)粒15kbλ-DNA25kb考斯質(zhì)粒45kbBAC300kbYAC400kb用于基因文庫(kù)構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌第52頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

大型基因組文庫(kù)一般由數(shù)十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)個(gè)重組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫(kù)篩選均需多輪操作步驟從基因文庫(kù)中篩選目的基因第53頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四從基因文庫(kù)中篩選目的基因第54頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因文庫(kù)構(gòu)建的技術(shù)性問(wèn)題在基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中，最應(yīng)引起重視的問(wèn)題是：嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接！??！為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合：將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級(jí)分離用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團(tuán)用TdT酶在DNA片段的末端上增補(bǔ)同聚尾末端第55頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四cDNA基因克隆cDNAlibraries第56頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四cDNA基因克隆

cDNA文庫(kù)是指得到足夠多的分別克隆的cDNA片段，匯集這些克隆應(yīng)包含某種細(xì)胞中各種mRNA的相應(yīng)順序，每種順序至少有一份拷貝，這種克隆片段的匯集體稱為某種細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。

第57頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

cDNAlibrariesmRNAisolation,purificationChecktheRNAintegrity

FractionateandenrichmRNA

SynthesisofcDNA

TreatmentofcDNAends

Ligationtovector第58頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四cDNA文庫(kù)特點(diǎn)沒(méi)有原核生物的cDNA文庫(kù)原核生物的mRNA非常不穩(wěn)定；原核生物的基因組文庫(kù)比較容易構(gòu)建，能包含所有基因的序列。第59頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四cDNA文庫(kù)對(duì)于真核生物的基因分析cDNA文庫(kù)是只含有編碼蛋白的基因文庫(kù)cDNAs沒(méi)有內(nèi)含子基因可以在E.coli

中直接表達(dá)用于新基因的鑒別組織或特殊類型細(xì)胞（基因的特異表達(dá)）第60頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四cDNA文庫(kù)-mRNA分離

大部分真核生物的mRNAs有3’poly（A）尾巴oligo(dT)能與poly(A)尾巴互補(bǔ)，由此來(lái)獲得mRNA.AAAAAAAAAAn5’cap第61頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第62頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四用纖維素純化poly(A)mRNA的流程圖第63頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四方法:mRNA的翻譯

:用體外蛋白質(zhì)合成檢測(cè)mRNAs。（麥胚無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)譯體系或兔網(wǎng)織細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)譯體系）通過(guò)凝膠電泳分析mRNAs:用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳cDNA文庫(kù)-檢測(cè)mRNA的完整性確定mRNA沒(méi)被降解第64頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四克隆特殊的mRNAs克隆一個(gè)特殊的基因比建立完整的cDNA文庫(kù)更有用凝膠分離:

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收

mRNAs（根據(jù)mRNA的大?。?/p>

富集:

通過(guò)雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)第65頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略cDNA第一鏈的合成G5’PPP’5GAAAAAAAAOH3’引物退火mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPG5’PPP’5GAAAAAAAAOH3’G5’PPP’5GAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTp5’第66頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失cDNA第二鏈的合成G5’PPP’5GAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTp5’NaOH煮沸TTTTTTTTTp5’OH3’KlenowdNTPsTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAOH3’S1AAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTp5’第67頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失cDNA第二鏈的合成G5’PPP’5GAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTp5’RNaseHDNApoldNTPTTTTTTTTTp5’5’TTTTTTTTTp5’S1T4DNAligaseTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAOH3’第68頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列cDNA第二鏈的合成核酸末端轉(zhuǎn)移酶G5’PPP’5GAAAAAOH3’TTTTTTp5’TdTdCTPG5’PPP’5GAAAAACCCCCCOH3’CCCCCC3’OHTTTTTp5’NaOHTTTTTp5’CCCCCC3’OH退火TTTTTp5’CCCCCC3’OH5P’GGGGGGklenowdNTPsTTTTTp5’CCCCCC3’OH5P’GGGGGGAAAAAOH3’第69頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四對(duì)cDNA末端的處理平末端的片斷需要加入特殊的核苷酸序列形成粘性末端，才能進(jìn)行克隆步驟

:移去突出的

3’-ends(strand-specialnuclease)填充缺失

3’核苷酸

(klenowfragmentofDNApolyIand4dNTPs)銜接物和平末端的連接(T4DNAligase)限制性內(nèi)切酶的消化

(E.coRI)第70頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四與載體的連接

任何一個(gè)含有E.coRI

酶切位點(diǎn)的載體都可以用來(lái)克隆cDNA步驟

:載體末端脫磷酸（堿性磷酸酶）用T4DNA連接酶連接載體和cDNA(plasmidorlphagevector)第71頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

提取細(xì)胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子篩選時(shí)，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達(dá)型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等

cDNA法分離目的基因的基本程序完備分離程序第72頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四cDNA法分離目的基因的基本程序

提取細(xì)胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進(jìn)行克隆特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆。如血紅蛋白基因等特異分離程序第73頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

利用兩組細(xì)胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對(duì)應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達(dá)的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進(jìn)而研究其生物學(xué)功能cDNA法分離目的基因的基本程序差異分離程序第74頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四差異分離程序多瘤病毒感染的FR3T3細(xì)胞正常的FR3T3細(xì)胞提取mRNA總mRNA共價(jià)交聯(lián)提取mRNA總mRNA合成cDNAcDNA合成第二鏈單鏈cDNA克隆原位雜交病毒誘導(dǎo)表達(dá)的cDNA克隆上柱雙鏈cDNA第75頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1.以mRNA為材料；

（一些RNA病毒，不經(jīng)過(guò)DNA中間體，對(duì)其研究，cDNA是唯一可行的方法）

2.與基因文庫(kù)的篩選比較，更簡(jiǎn)單易行；

3.由于每一個(gè)cDNA克隆都含有一種mRNA序列，在選擇中出現(xiàn)假陽(yáng)性的幾率比較低；

4.克隆在細(xì)菌中表達(dá)的基因，用作基因序列的測(cè)定和發(fā)育過(guò)程中或組織中基因特異表達(dá)

cDNA克隆的優(yōu)越性第76頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)細(xì)菌或原核生物的mRNA半衰期很短

mRNA在細(xì)胞中含量少，對(duì)酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因cDNA法克隆目的基因的局限性第77頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因組DNA克隆

Genomiclibraries第78頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因組DNA文庫(kù)純化基因組DNA

基因組DNA的片斷化物理切割和限制性內(nèi)切酶eukaryotesprokaryotes與載體連接第79頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

構(gòu)建基因文庫(kù)的基因組DNA必須進(jìn)行純化后，才能用來(lái)制備適用于載體插入片斷大小的隨機(jī)片斷基因組DNA的純化

原核生物:直接從細(xì)胞中體取基因組DNA去除蛋白（蛋白酶消化）,脂類和其它“雜質(zhì)”。真核生物

:從細(xì)胞核中第80頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Hae：5’-

…GG

/CC…

3’,

Sau3A:5’-/GATC-3’,

Alu:5’-

…AG/CT…3’,

BamH1:5’-G/GATCC限制性內(nèi)切酶消化將片斷的末端(粘性或平頭)和酶消化的載體連接酶切位點(diǎn)是否被修飾內(nèi)切酶消化的時(shí)間和用量取決于要插入片斷的大小范圍。第81頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四載體選擇

根據(jù)基因組的大小選擇合適的載體構(gòu)建DNA文庫(kù)

載體

PlasmidphageλcosmidBACYAC

插入片斷

(kb)

523453501000最常用的載體是phageλ第82頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Hae、Alu第83頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第84頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

有一些序列不能被克隆

Example:1.序列缺乏酶切位點(diǎn);2.目的基因包容在一個(gè)其大小范圍超出載體承載能力的DNA片斷上Toolongforthevectorused第85頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因定位克隆Map-basedcloning第86頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

是用于分離其編碼產(chǎn)物上不知道的目的基因的一種有效的方法。從理論上講，任何一種可鑒定出有一個(gè)突變的基因，都可以通過(guò)基因定位克隆技術(shù)予以分離。

基因定位克隆第87頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

步驟：

1.先將目的基因定位到染色體上，并在目的基因的兩側(cè)確定一對(duì)緊密連接的RFLP分子標(biāo)記；

2.

利用最緊密連鎖的一對(duì)兩側(cè)分子標(biāo)記作探針，通過(guò)染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)分子標(biāo)記之間的含目的基因組片斷克隆并分離出來(lái)；

3.

最后根據(jù)其同突變體發(fā)生遺傳互補(bǔ)的能力從此克隆中鑒定出目的基因。第88頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

1.以酵母人工染色體為載體構(gòu)建含有大片斷DNA的YAC文庫(kù)。

2.有可用的同目的基因緊密連鎖的DNA探針，（距離幾百bp）分離目的基因的必要條件第89頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四主要內(nèi)容：

1.擬南芥簡(jiǎn)介

2.RFLP分子標(biāo)記

3.RFLP作圖的原理與步驟

4.

染色體步移

5.大尺度基因組物理圖譜的構(gòu)建第90頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

1.植株小，便于篩選突變體；

2.時(shí)代時(shí)間短（5個(gè)星期左右），可以積累大量遺傳數(shù)據(jù)）；

3.種子產(chǎn)率高，每株可產(chǎn)生4104粒以上的種子；

4.基因組小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，總長(zhǎng)度7107bp適合于用染色體步移技術(shù)克隆目的基因；

5.天然自花授粉，可得到突變基因的純合子，同時(shí)也可通過(guò)人工雜交授粉，以便給基因定位。擬南芥簡(jiǎn)介第91頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

DNA限制片斷長(zhǎng)度多態(tài)性，它是指應(yīng)用特定的核酸內(nèi)切酶切割有關(guān)的DNA分子，所產(chǎn)生的DNA片斷在長(zhǎng)度上的簡(jiǎn)單變化。由于核酸內(nèi)切酶是以一種序列特異的方式切割DNA分子，來(lái)自一個(gè)完整的純合子個(gè)體（所有的基因及DNA序列）的每一種同源DNA分子，都會(huì)在同樣的位點(diǎn)被準(zhǔn)確地切割。RFLP分子標(biāo)記第92頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

它所代表的是基因組DNA在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生片段在長(zhǎng)度上差異，由于不同個(gè)體等位基因之間堿基的互換、重排、缺失等變化導(dǎo)致限制內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變，從而造成基因型間限制性片段長(zhǎng)度的差異。第93頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

當(dāng)這些大小不等的片段通過(guò)凝膠電泳時(shí)，就形成不同帶，通過(guò)與克隆的DNA探針進(jìn)行Southren雜交和放射自顯影后，即獲得反映個(gè)體特異性的RFLP圖譜。第94頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGCTTAAGGAATTCEcoRCTTAAGGAATTCCCTAAGGGATTCGAATTCCTTAAGEcoREcoR生態(tài)型A的DNA生態(tài)型B的DNAEcoR分別切割兩種生態(tài)型DNA電泳后作Southen雜交同放射性同位素標(biāo)記的基因A克隆雜交ab基因A基因A第95頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

abX探針A探針B探針B探針AF1雜合子探針B探針AF2代CNHRFLP作圖的原理和步驟第96頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2:1:1不連鎖AB緊密連鎖HCN自由組合需要篩選相當(dāng)大量的F2代群體，通過(guò)重組子計(jì)算基因A與B之間的遺傳距離。第97頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四缺點(diǎn)：1.克隆可表現(xiàn)基因組多態(tài)性的探針較為困難2.實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本費(fèi)用高3.用反射性同位素及核酸雜交技術(shù)，既不安全又不易自動(dòng)化特點(diǎn)：1.共顯性2.標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)量不受限制，可檢測(cè)1~4個(gè)基因座位數(shù)第98頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

這種技術(shù)通過(guò)逐一克隆來(lái)自染色體基因DNA的彼此重疊的序列，而慢慢靠近目的基因，因此形象的稱為染色體步移染色體步移（chrosomewalking）第99頁(yè)，共111頁(yè)，2023年，2月20日，星期四先構(gòu)建起點(diǎn)RFLP標(biāo)記克隆