基因工程體外重組帶動畫

基因工程體外重組帶動畫第1頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四外源DNA載體DNA重組分子擴增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射原核細(xì)胞真核細(xì)胞受體細(xì)胞？1.基因文庫2.PCR3.基因差異表達(dá)1.克隆載體2.表達(dá)載體第2頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第3頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組限制酶—分子剪刀限制酶—分子剪刀連接酶—分子膠水重組DNA分子粘性末端連接效率最高！第4頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四

黏性末端黏性末端1、粘性末端的連接

第5頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第6頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第7頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組1.粘性末端連接創(chuàng)造互補粘性末端的方法有哪些？同種酶同尾酶第8頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組（1）兩端具有相同粘末端的DNA分子之間的連接

第9頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組

堿性磷酸酶：去掉其5’末端的磷酸基，以防質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。注意：目的基因正反向插入；載體與多個目的基因片段重組。1231234434第10頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組

（2）兩端具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接

兩種不同的限制性內(nèi)切酶

兩端會產(chǎn)生非互補的突出端

定向重組體第11頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI對載體酶切HindIIIEcoRI對基因酶切質(zhì)粒載體的定向重組堿性磷酸酶？避免了目的基因正反向插入第12頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四2.平頭末端連接第一節(jié)DNA的體外重組第13頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四平末端平末端SmaI限制酶第一節(jié)DNA的體外重組第14頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四

T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。

5’端與3’端并列靠近的時間太短，不容易被連接酶連接。

（1）直接連接第15頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組

（2）人工加尾形成“粘性末端”

a）同聚加尾法

DNA末端轉(zhuǎn)移酶

DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸,

利用DNA末端轉(zhuǎn)移酶分別給載體和插入片斷加上互補的核苷酸。

第16頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組非酶切位點

a）同聚加尾法

缺點：不能把插入片段再切下來。第17頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組第18頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四還有哪些方法能夠創(chuàng)造粘性末端？第19頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組b）銜接物(linker)連接

Linker:用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點序列的平端雙鏈。

GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：第20頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組銜接物(linker)連接第21頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組銜接物(linker)連接優(yōu)點：

1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。

2）能給載體連接上Polylinker缺點：如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點，不能切下完整的插入片段第22頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組c)DNA接頭

(adapter)連接法

adapter:一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點序列）。

adapter的作用:用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter第23頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組缺點：接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。防止自我連接：先用堿性磷酸酶（CIP）處理接頭以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。DNA接頭(adapter)連接法第24頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四平頭末端連接（1）直接連接（2）人工加尾形成“粘性末端”

a)同聚加尾法

b)銜接物連接

c)DNA接頭連接法小結(jié)PCR?第25頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)重組DNA分子的構(gòu)建

3.PCR產(chǎn)物的連接

（1）在引物的5’端設(shè)計酶切位點GCAGAATTC

互補序列3’端15~20bp與模板互補；5’端6~10bp是某個內(nèi)切酶的識別序列（5’端多余的3~5bp屬保護(hù)堿基）引物第26頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組引物1

GCAGAATTC

互補序列模板EcoRI位點5’--3’GCAGAATTC

互補序列5’--3’3’模板GCAGAATTC

互補序列

PCR產(chǎn)物5’--3’3’復(fù)性延伸模板模板3’第27頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組GCTAGCCGG

互補序列模板BamHI位點-5’3-’復(fù)性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG

互補序列3’-模板GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物互補序列引物23’3’第28頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組BamHIEcoRIBamHIEcoRI對載體酶切BamHIEcoRI質(zhì)粒載體的定向重組PCR第29頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組

（2）與T載體直接連接

TaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3’端再加上一個多余的核苷酸（優(yōu)先加A）,因此PCR產(chǎn)物兩個3’端一般都有一個A

T載體的兩個3’端人為地各加一個T：利用TaqDNA聚合酶，當(dāng)原料中只有dTTP時，被迫在平端載體上添加T！TaqDNA聚合酶第30頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組T載體圖第31頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA

3.PCR產(chǎn)物的連接

（2）與T載體直接連接第32頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第33頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第34頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四1.粘性末端連接（1）兩端具有相同粘末端的DNA分子之間的連接（2）兩端具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接2.平頭末端連接（1）直接連接（2）人工加尾形成“粘性末端”

a)同聚加尾法

b)銜接物連接

c)DNA接頭連接法3.PCR產(chǎn)物的連接（1）在引物的5’端設(shè)計酶切位點（2）與T載體直接連接第一節(jié)DNA的體外重組第35頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四思考：怎樣進(jìn)行有效的DNA體外連接？第36頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組

二、DNA體外連接應(yīng)注意的事項

1.插入片斷與載體的酶切位點互補相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。BamHIBamHISau3AI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個堿基的粘性末端。第37頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組2.插入基因的開放閱讀框（ORF）正確

（1）DNA定向插入由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。雙酶切EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第38頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA的體外重組

（2）起始密碼

尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！第39頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四

3.防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5’磷酸被除去，