臨床樣本的采集運輸和保存及核酸提取資料

臨床樣本的采集運輸和保存及核酸提取資料研究背景樣本的采集、處理樣本的保存樣本的運輸

DNA的提取

RNA的提取2021/1/122研究背景一、樣本的采集、處理、保存及運輸2021/1/123臨床標(biāo)本的正確采集、運送、保存

的重要性臨床檢驗的質(zhì)量保證關(guān)鍵性環(huán)節(jié)解決涉及實驗室檢驗的醫(yī)患糾紛的方法之一2021/1/124〔一〕、樣本的采集地貧檢測樣品采集：外周血:≥5mL

臍帶血:0.5~1mL

羊水：20～30mL

絨毛：≥15mg

唾液組織2021/1/125標(biāo)本采集的本卷須知所有標(biāo)本的采集、運送和處理應(yīng)在無菌操作，防止污染的原則下進(jìn)展已采集標(biāo)本都應(yīng)置于防漏、密封的無菌容器中運送采集足夠量標(biāo)本每份標(biāo)本都應(yīng)標(biāo)記患者姓名、送檢號碼、標(biāo)本來源、詳細(xì)部位、日期、時間及相關(guān)臨床信息2021/1/126全血以全血作為待測標(biāo)本時，必須注意抗凝劑的選擇，一般使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉，不可使用肝素全血樣本如用于DNA提取檢測，可4℃下短期保存,如用于RNA檢測，則應(yīng)在取血后，盡快提取RNA2021/1/127血清〔漿〕DNA測定，可按照一般的血清標(biāo)本處理程序，對測定影響不大RNA測定，標(biāo)本的獲取和保存方式對測定結(jié)果，可能有決定性影響。最好是使用EDTA抗凝(嚴(yán)禁使用肝素)全血標(biāo)本，抗凝后6小時內(nèi)別離血漿，如使用血清標(biāo)本，則需盡快(2小時內(nèi))別離血清，標(biāo)本的短期〔1～2周〕保存可在-20℃下，較長期保存應(yīng)在-70℃下2021/1/128肝素的作用機(jī)理

肝素對MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQDNA聚合酶均很強的抑制作用，假如臨床標(biāo)本為肝素抗凝，則在核酸純化過程中，標(biāo)本中的肝素可結(jié)合于DNA和RNA上對標(biāo)本進(jìn)展煮沸、凝膠過濾、酸堿處理后凝膠過濾、反復(fù)乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用每μg核酸標(biāo)本中參加0.1U的肝素，即可100%的抑制酶活性在標(biāo)本中參加肝素酶I或Ⅱ1~3U/μg核酸在于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNasin25℃下作用2小時可去除肝素的抑制作用2021/1/129〔二〕、樣本的運送樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測實驗室樣本中如參加了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，如用于DNA測定的EDTA抗凝血等，則可在室溫下運送或郵寄建議：將全血標(biāo)本或DNA樣本用冰袋加泡沫盒快遞運送。如需提取RNA的樣本需預(yù)處理后加lmlTrizol在低溫運送2021/1/1210〔三〕、樣本的保存常規(guī)外周血標(biāo)本，采集后做血常規(guī)，常溫24小時內(nèi)，4℃可保存1周；做血紅蛋白電泳常溫1周，電泳4℃可保存15天；DNA提取樣本常溫24小時，4℃保存1個星期，－20℃保存3個月，－70℃保存半年～3年；RNA提取樣本常溫6小時，4℃保存12小時，－70℃保存3個月，羊水在12小時內(nèi)離心可保存同上。2021/1/1211研究背景

二、核酸的提取2021/1/1212核酸提取的重要性核酸提取是臨床PCR檢驗最為關(guān)鍵的部分，亦是手式操作的主要部分核酸提取的成敗關(guān)系到臨床PCR檢驗的正確與否臨床PCR檢驗操作中最易出問題的環(huán)節(jié)2021/1/1213〔一〕、提取核酸總的原則

保證核酸一級構(gòu)造的完好性；其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；其他核酸分子，如提取DNA中的RNA，也應(yīng)盡量去除。2021/1/1214〔二〕、核酸提取的根本步驟1、核酸的釋放：破裂細(xì)胞釋放核酸機(jī)械法與非機(jī)械法〔非機(jī)械法中溶胞法是應(yīng)最廣泛的方法〕2021/1/1215各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法

應(yīng)用

Ⅰ機(jī)械法1.勻漿法機(jī)體軟組織2.搗碎法動物韌性組織3.研磨法細(xì)菌、酵母

Ⅱ物理法1.超聲法細(xì)胞混懸液2.反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3.冷熱交替法細(xì)菌、病毒4.低滲裂解紅細(xì)胞

Ⅲ化學(xué)法1.有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母、血液2.去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞、血液3.酶解法細(xì)菌、酵母、血液2021/1/12162、核酸的別離與純化：將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其他物質(zhì)別離非核酸的大分子污染物〔蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子〕、非需要的核酸分子、試劑和溶液2021/1/12173、核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子參加一定的鹽類〔醋酸鈉、氯化鈉等〕后使用有機(jī)溶劑〔如乙醇、異丙醇等〕少數(shù)鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌2021/1/12184.核酸的鑒定濃度鑒定純度鑒定完好性鑒定2021/1/1219濃度鑒定DNA：1〕紫外分光光度法：測定DNA在A260nm的光吸收值。如計算DNA濃度A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml的核酸溶液。(A值等于1時，相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，20μg/ml單鏈寡核苷酸〕2021/1/1220RNA：紫外吸光光度法:A260×稀釋倍數(shù)×40＝μg/ml(OD260-OD320)×稀釋倍數(shù)×40＝μg/ml

2021/1/12212〕熒光光度法熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析〔1-5ng〕2021/1/1222EB與DNA的結(jié)合2021/1/1223純度鑒定紫外分光光度法：在260nm和280nm處測定DAN溶液的光吸收，純的DNAA260與A280之比應(yīng)在1.80(1.60~1.80)，低于此值說明制備物中留有蛋白質(zhì)成份。高于此值說明有RNA的殘留量純的RNAA260與A280之比應(yīng)在2.0(1.0),Ratio<1.8:蛋白質(zhì)污染;Ratio>2.2:RNA可能已經(jīng)水解成單核苷酸A260/A280比值是純度檢測的重要指標(biāo)！注：測定吸光值，稀釋液應(yīng)使用ＴＥ2021/1/1224完好性鑒定凝膠電泳法：基因組DNA電泳，在電場中泳動慢，假如發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象；總RNA電泳，觀測各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。2021/1/1225DNA完好性鑒定：2021/1/1226

正常時，28SRNA的熒光強度約為18SRNA的2倍，否則提示RNA的降解RNA完好性鑒定：2021/1/12275、核酸的貯存——DNA保存

1〕短期貯存：4℃或-20℃存放于TE〔tris和EDTA〕緩沖液中。TE緩沖液的PH與DNA貯存有關(guān)，PH為8時，可減少DNA脫氨反響，PH低于7.0時DNA容易變性。2〕長期貯存：TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。2021/1/1228核酸的貯存——RNA保存：的醋酸鈉溶液或雙蒸水，在-70℃保存。RNA可溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，可在-20℃保存。RNA假如以DEPC〔焦碳酸二乙酯〕可以抑制RNA酶對RNA的降解2021/1/1229三、基因組DNA的別離與純化2021/1/1230〔一〕、DNA樣品準(zhǔn)備常見的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等生物組織：最好新穎組織，假設(shè)不能馬上提取，應(yīng)貯存－70℃或液氮2021/1/1231DNA提取前樣本采集、預(yù)處理和保存：全血抗凝劑：

EDTA-Na2或枸櫞酸鈉作為抗凝劑不宜使用肝素

抗凝劑處理血肝素檸檬酸*EDTA*-80℃保存2個月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室溫提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差2021/1/1232〔二〕、DNA提取〔一〕酚抽提法：先用EDTA、SDS、蛋白酶K破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進(jìn)展沉淀。獲DNA大小為100－150kb。2021/1/1233酚抽提法提取步驟：2021/1/1234DNA酚抽提法示意圖2021/1/1235主要試劑的作用：

EDTA：1.二價金屬螯合劑，抑制核酸酶；2.降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性2021/1/1236SDS的作用：1.溶解膜蛋白和脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂2.溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來3.對RNA、DNA酶有抑制作用4.與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3….R蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性2021/1/1237蛋白酶K：水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時仍保持較高活性，可同時使用2021/1/1238苯酚：蛋白質(zhì)強變性劑、抑制DNA酶活性苯酚溶于有機(jī)溶劑，微溶于水提取DNA前苯酚用Tris-Hcl飽和，防止吸收過多DNA，降低DNA的損失率氧化苯酚會破壞DNA2021/1/1239DNA的沉淀：1〕無水乙醇沉淀沉淀前往往參加NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子外表的負(fù)電荷，有助于分子之間的聚集。無水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，無水乙醇使用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過程釋放熱量對DNA的損傷。2〕異丙醇沉淀除了使DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的RNA分子2021/1/1240〔二〕甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚屢次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品。可得DNA200kb左右。2021/1/1241〔三〕磁珠法：磁珠在高鹽低pH值下吸附核酸，在低鹽高pH值下與核酸別離，再通過挪動磁珠來獲取DNA2021/1/1242〔四〕微柱法：利用DNA在高鹽、低pH的特定溶液環(huán)境下可吸附在固相介質(zhì)〔如硅膠膜〕上，洗滌去除雜質(zhì)后，再改變?nèi)芤涵h(huán)境使DNA溶解到純水或TE中2021/1/1243〔三〕、DNA的濃縮

固體聚乙二醇〔PEG〕濃縮：用透析袋外敷PEG至適宜量丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積2021/1/1244〔四〕、DNA回收主要是從電泳中別離回收DNA片段回收原則：盡量進(jìn)步回收率去除回收DNA樣品中的污染物2021/1/1245DNA降解的原因樣本不夠新穎，采集材料過陳舊樣本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因組DNA鹽濃度過高基因組DNA中乙醇未去除凈基因組DNA中可能存在其他抑制因素提取基因組DNA，有時參加蔗糖的原因參加多糖，保護(hù)DNA長度影響DNA質(zhì)量的因素2021/1/1246四、RNA的別離與純化

2021/1/1247〔一〕、樣本來源理論上所有有核真核細(xì)胞、細(xì)菌、病毒都可以提取RNA樣本選擇取決于試驗?zāi)康娜腔蚪M提取RNA最常見的樣本2021/1/1248每個細(xì)胞的RNA量約為10-5

μg80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA…2021/1/1249組織材料起始樣品量TotalRNA提取量blood1ml15~20μgleukocytes1×107個約100μgLivertissue1g約5000μgCulturecells1×107個約100μgRenaltissue1g約3000μgSkeletontissue1g約1500μgCerebraltissue1g約1500μg2021/1/1250〔二〕、RNA提取的獨特性

—關(guān)于RNase酶臨床標(biāo)本及實驗室環(huán)境中,存在大量對RNA具有強烈降解作用的RNase，而RNase較耐高溫,不易失活如何防止RNase對標(biāo)本的污染及防止RNase對提取的RNA的降解,是保證RNA成功提取的關(guān)鍵之所在2021/1/1251RNase酶RNA易被RNase水解，RNase除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中RNase具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵RNase分子構(gòu)造中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復(fù)2021/1/1252去除RNase的污染及強有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關(guān)鍵必須在總RNA提取別離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性1.內(nèi)源性RNA酶〔intrinsicRNase〕2021/1/12532.外源性RNA酶(extrinsicRNase)主要來源：被污染的緩沖液細(xì)菌或微生物污染，高壓不能去除RNA酶自動移液裝置2021/1/12543.實驗室采取防止RNA酶污染的措施設(shè)置專門RNA移液裝置小份保存緩沖液設(shè)置專門的RNA電泳裝置準(zhǔn)備溶液或緩沖液時，使用無RNA酶的器皿、DEPC處理水等別離RNA過程中使用RNA酶抑制劑2021/1/12554.RNA酶的去除DEPC〔焦碳酸二乙酯〕高度活化的烷基化試劑，破壞RNA酶活性。用來滅活緩沖液或器皿中的RNA酶。

OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O==DEPC水制備：0.1%DEPC在37°C處理1h，并高壓滅菌15min。玻璃制品和塑料制品應(yīng)浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，37°C處理1h或室溫下過夜。DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和RNA，且與一些緩沖液不相容，故在別離和純化RNA的過程中不使用DEPC2021/1/12565.RNA提取所用器皿的處理經(jīng)高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管,離心管等根本上無RNase,可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA實驗室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染,使用前必須于180℃干烤8小時以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯,試管和其它用品DEPC是RNase的強烈抑制劑。灌滿DEPC的器皿于37℃下放置2小時，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進(jìn)展修飾2021/1/12576.RNA提取所用溶液的準(zhǔn)備

對于RNA提取所需溶液的配制,必須用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液,用干烤過的藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNase的玻璃器皿?？赡艿脑?溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37℃至少處理12小時,然后于100℃加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15分鐘須注意的是,DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反響,因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液,因此可存幾瓶新的,未開封的Tris試劑以制備無RNase的溶液2021/1/12587.RNA提取中RNase污染的控制實驗操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來源。策略是：在準(zhǔn)備用于RNA純化的實驗材料和溶液時,以及在涉及RNA的整個提取操作過程中,都應(yīng)戴一次性手套在RNA提取實驗中，應(yīng)勤換手套2021/1/1259〔三〕、用于提取RNA的血樣的處理取新穎抗凝血2－3ml入15ml無菌塑料管，600g離心5分鐘，棄上清。參加6倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液〔約12ml〕，輕輕吹打混勻，本步驟在室溫或4度操作均可。裂解時間至4-5分鐘，并且裂解過程中宜適當(dāng)偶爾搖動以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。600g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。一般情況下，裂解1次紅細(xì)胞應(yīng)該裂解的差不多，假如有較多紅細(xì)胞沒有裂解的話，可以再加點紅細(xì)胞裂解液約5ml裂解1次。步驟同3。向得到的細(xì)胞團(tuán)中加Trizol，彈勻，將細(xì)胞團(tuán)打散，轉(zhuǎn)入無菌塑料管，封好蓋。標(biāo)上號，纏上封口膜，－20℃或－70℃保存。2021/1/1260〔四〕、RNA提取的常用方法外表活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法胍鹽提取結(jié)合氯仿-酚抽提法胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒