免疫共沉淀事項(xiàng)

最近我們實(shí)驗(yàn)室想做這個(gè)試驗(yàn)，以前也沒有做過，如果有戰(zhàn)友做過這個(gè)試驗(yàn)，希望介紹點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，謝謝樂。應(yīng)戰(zhàn)友要求，在網(wǎng)上找樂一下基礎(chǔ)資料，方便大家查看，雖然下面也列出了試驗(yàn)方法，但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)室可能并不一樣，希望戰(zhàn)友們較少些自己的親身體會(huì)，讓大家和我本人在即將進(jìn)行的試驗(yàn)中少走彎路。先謝謝各位了免疫共沉淀免疫共沉淀(Co-lmmunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。其優(yōu)點(diǎn)為：(1)相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài)；(2)蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的,可以避免人為的影響；(3)可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為：(1)可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；(2)兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,而可能有第三者在中間起橋梁作用；(3)必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么,以選擇最后檢測(cè)的抗體,所以,若預(yù)測(cè)不正確,實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果,方法本身具有冒險(xiǎn)性。實(shí)驗(yàn)流程為：轉(zhuǎn)染后24-48h可收獲細(xì)胞,加入適量細(xì)胞裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑),冰上裂解30min,細(xì)胞裂解液于4°C,最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清；取少量裂解液以備Westernblot分析，剩余裂解液加1pg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液,4°C緩慢搖晃孵育過夜；取10plproteinA瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000rpm離心3min；將預(yù)處理過的10plproteinA瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與proteinA瓊脂糖珠偶連；免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C以3,000rpm速度離心3min,將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3—4次；最后加入15pl的2xSDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；SDS,Westernblotting或質(zhì)譜儀分析。注意的問題：細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑(NP40或TritonX-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用使用對(duì)照抗體：?jiǎn)慰寺】贵w：正常小鼠的lgG或另一類單抗兔多克隆抗體：正常兔lgG在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中要保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；要確?？贵w的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀；確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。ChIP是個(gè)很郁悶的實(shí)驗(yàn)，時(shí)間花費(fèi)N長(zhǎng)，如果做的不好非常打擊人，我也談不上什么成功經(jīng)驗(yàn)?zāi)?） 顯然抗體來源要可靠，很多在WB上很好的商業(yè)化抗體并不能成功使用到ChIP上。2） 超聲處理要充分，處理完呢以后DNA一定要跑膠檢測(cè)看看，如果片段都很大，結(jié)果受到的影響很大，特別是如果ChIP組蛋白謝謝alixtardxy現(xiàn)在好多大牛文章上面都用IP，做的也很漂亮，摸索好了條件，應(yīng)該是不難做的，有個(gè)疑問，為什么在WB上能用的在IP上就不能用樂?。繉?duì)不起，我直接想到ChIP上去了,所以才出現(xiàn)了上面的那些說法。你的意思應(yīng)該是chip用的抗體是特殊的吧？即便和WB試驗(yàn)一樣，抗同樣的抗原。樓主是否把免疫共沉淀的定義和實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼f下，這樣方便討論，呵呵這個(gè)試驗(yàn)太陌生了，還望各位多多指教啊ChIP是ChIp（染色質(zhì)免疫沉淀），不是樓主說的Co-IP（免疫共沉淀），二者是風(fēng)馬牛不相及的兩個(gè)試驗(yàn)和概念，原理和目的都不一樣，樓上很多人將二者搞混了.染色質(zhì)免疫沉淀的作用是鑒定蛋白與DNA的結(jié)合，相當(dāng)于EMSA（凝膠滯留試驗(yàn)）的體內(nèi)試驗(yàn)。基本原理是用抗體將目標(biāo)蛋白及其它可能結(jié)合的DNA沉淀下來，然后用引物擴(kuò)增DNA的序列。因此這個(gè)目標(biāo)蛋白通常具備轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，能夠結(jié)合DNA，目前也有做結(jié)合RNA的Chip。免疫共沉淀的作用是鑒定蛋白與蛋白的相互作用。用抗體將蛋白（A）及其可能結(jié)合的目標(biāo)蛋白（B）沉淀下來。因此這個(gè)A蛋白可以是任何蛋白。"共”指反過來用B的抗體也能將A/B復(fù)合物沉下來。如果是單向的，通常叫免疫沉淀。樓主的帖子“免疫共沉淀的具體注意事項(xiàng)”不適合放在核酸版塊，更適合放在蛋白質(zhì)版塊。相反，“染色質(zhì)免疫沉淀CHIP”適合在該版塊。我做的不是很多，但是有幾點(diǎn)提出來和大家討論下。我想這個(gè)試驗(yàn)最關(guān)鍵的就是細(xì)胞的處理和抗體來源。如二樓所說，的確很多WB的抗體是不一定可以用到ChIP上的，這個(gè)應(yīng)該是和抗體的制作過程有關(guān)系的。至于多抗還是單抗，我認(rèn)為各有優(yōu)缺點(diǎn)。比如說單抗是特異性的針對(duì)某種表位的，這樣可以選擇幾種單抗混合使用效果會(huì)好些，而且背景也低很多。多抗雖然比較復(fù)雜，最主要的是非特異性反應(yīng)比較多，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不好判斷，但是經(jīng)過合理的純化，應(yīng)該會(huì)將這個(gè)缺點(diǎn)變小。做ChIP的抗體應(yīng)該是能夠針對(duì)空間表位的，雖然某些針對(duì)線性表位的抗體也能夠運(yùn)用其中，但是那只是小部分，所以我認(rèn)為抗體的來源很關(guān)鍵，無論是購買還是自己制作，都需要對(duì)其的特性比較了解。ChIP還有一個(gè)問題是細(xì)胞的處理，雖然很多公司都提供了現(xiàn)成的試劑可供選擇，但是那只是通用性的試劑，真正適合自己細(xì)胞的還需要做預(yù)試驗(yàn)摸索下。其次是細(xì)胞內(nèi)相互作用的蛋白，可能會(huì)由于處理導(dǎo)致不發(fā)生作用等等因素導(dǎo)致相應(yīng)值變低，所以我覺得處理時(shí)間，溫度等等外部條件還是很重要的。以上是個(gè)人觀點(diǎn)，僅供參考！看來我也看錯(cuò)了，不好意思！目前個(gè)人認(rèn)為生物醫(yī)學(xué)研究的瓶頸就是是否能制備高質(zhì)量的適合多種用途的抗體。很多所謂的主流研究方法都要依賴抗體。例如Westernblot，免疫熒光，流式分析，ELISA，IP，CoIP,ChIP。個(gè)人對(duì)抗體制備的原理和方法不是很清楚，但是實(shí)際過程中很多并不想說明書上說的那樣，結(jié)果是否漂亮，只有用了才知道。Westernblot應(yīng)該是抗體的最基本功能，他的最后原理是抗體結(jié)合到膜上的抗原，然后通過二抗來顯示其位置。免疫共沉淀的抗體就不一樣了，他要保證能夠?qū)⒛愕哪繕?biāo)蛋白及其復(fù)合物牢固的結(jié)合并通過蛋白A或G將其沉下來。舉個(gè)簡(jiǎn)單的例子說明二者的不同，不知道是否正確，一男（抗體）與一女（抗原）熱情的接吻，在床上（膜）可能很容易辦到，上述過程類似WB，抗體的功能只是識(shí)別固定物（轉(zhuǎn)膜）上的抗原，風(fēng)平浪靜。相反，一男（抗體）與一女（抗原）熱情的接吻，在激流中就不容易辦到，上述過程類似免疫沉淀，是動(dòng)態(tài)環(huán)境下的識(shí)別，而且必須特異性的牢固結(jié)合，這種接吻要求是熱吻，緊密結(jié)合，并且最終用一個(gè)鉤子（免疫沉淀中叫蛋白A或G）將男的勾下來后，要保證男的還熱吻者那個(gè)女的（即抗原）。因此要求這個(gè)男的（抗體）要緊緊的抱住那個(gè)女的（抗原）?？上攵ち髦校庖叱恋恚?duì)男的質(zhì)量要求更高，一定要保證不與女的分手。如果男的還三心二意，可能抱的是其他的女人，這在免疫沉淀中就會(huì)產(chǎn)生非特異性條帶。因此，免疫沉淀一定要設(shè)置對(duì)照IG抗體來沉淀，如果隨便一個(gè)男的（對(duì)照IG）也能將某個(gè)女的抱下來，那這個(gè)女的就是“博愛”，不是真正需要的最愛（特異條帶）。鑒于目前很多男的（抗體）質(zhì)量不可靠或者不能滿足，因此大量的文獻(xiàn)喜歡采用標(biāo)簽蛋白（例如，HIS,HA,GFP，MYC等）作為“特異男”來勾引“女”的。個(gè)人認(rèn)為需要一個(gè)個(gè)試，看那個(gè)能夠用于免疫沉淀，有的抗體是針對(duì)男的“嘴巴”來設(shè)計(jì)的，這種抗體當(dāng)然能夠容易將女的抱下來，相反有的是針對(duì)其他部位設(shè)計(jì)制備抗體的，功能也就不一樣了。Co-Ip成功的關(guān)鍵主要有兩個(gè)：1）男的質(zhì)量。2）男女接吻時(shí)的環(huán)境（例如是否有其他干擾因素，沉淀的時(shí)間，溫度，比例，旋轉(zhuǎn)強(qiáng)度等）不對(duì)指正。tangdl2000的比喻很有意思，呵呵再次建議樓主把免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼f下，這樣方便討論，呵呵想說下免疫沉淀，免疫沉淀是用你的抗體富集目的抗原，然后用WESTERN顯示，你的抗體是否結(jié)合抗原。由于是富集了目的抗原，WESTERN不容易做出來的，用免疫沉淀可能容易出結(jié)果，但是也容易出雜帶。如果看兩個(gè)分子是否相互作用，可以用免疫共沉淀。染色質(zhì)免疫沉淀（EMSA）主要用于研究轉(zhuǎn)錄因子的。實(shí)驗(yàn)技巧是為了實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆?wù)的，撇開實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，單純討論?shí)驗(yàn)技巧，似不可取。另外建議：發(fā)現(xiàn)很多戰(zhàn)友發(fā)貼，不注明實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，這樣討論，可能最后發(fā)現(xiàn)所討論的實(shí)驗(yàn)技術(shù)并不是為你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆?wù)的。GOODLUCK呵呵，由于我的疏忽，把這個(gè)帖子置頂了。關(guān)于抗體的問題，我的看法是。1） 對(duì)應(yīng)WB而言，使用的抗體識(shí)別的抗原應(yīng)該是線性化的抗原（SDS）的作用，因此它識(shí)別的不是蛋白在具有正?？臻g結(jié)構(gòu)時(shí)的抗原決定簇，而是在蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)上相臨的幾個(gè)AA組成的抗原決定簇。2） 對(duì)應(yīng)FACS而言，多數(shù)情況下，它識(shí)別的是具有正常高級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白的抗原決定簇，這些抗原決定簇可能是由相鄰近的AA組成的或者是由于蛋白折疊后原本在一級(jí)結(jié)構(gòu)上相距比較遠(yuǎn)的幾個(gè)AA組成的，因此WB和FACS的抗體有時(shí)能夠通用，有時(shí)不能通用。3） Co-IP的情況，我認(rèn)為和FACS是相類似的。4） ChIP的情況最為頭痛，因?yàn)樗婕傲艘粋€(gè)crosslink的過程，這個(gè)可能造成一些抗原決定簇被封閉掉，而且在免疫共沉淀使用的buffer中含有一些變性劑，進(jìn)一步影響了抗原抗體的結(jié)合，因此WB可以用的抗體并不一定能用于ChIP，按照現(xiàn)在的說法，如果不是被validated過的抗體，做ChIP可能需要對(duì)多個(gè)抗體進(jìn)行優(yōu)化評(píng)估靈敏性和特異性。至于是固相雜交還是液像雜交我覺得到不是重點(diǎn)，事實(shí)上，和固態(tài)的蛋白芯片相比較，液態(tài)蛋白芯片（luminex）的效率更高，因?yàn)榭乖贵w有更加充分的機(jī)會(huì)接觸。我們一般都稱之為IP試驗(yàn)，這樣就包括染色質(zhì)和蛋白及蛋白和蛋白了謝謝版主的建議，我也是進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室不到一年的時(shí)間，接觸IP的時(shí)間更短，試驗(yàn)設(shè)計(jì)也是在完善階段，現(xiàn)在主要是實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面的知識(shí)太欠缺了另外實(shí)驗(yàn)的目的，不便說的太詳細(xì)，因?yàn)檫@個(gè)實(shí)驗(yàn)有可能投今年的基金，請(qǐng)各位戰(zhàn)友諒解謝謝LZ把你的經(jīng)驗(yàn)?zāi)贸鰜泶蠹曳窒恚罱苍诖蛩阕雒庖叱恋?，學(xué)習(xí)了各位戰(zhàn)友的經(jīng)驗(yàn)，受益匪淺。我有個(gè)問題想請(qǐng)問大家，我的目的蛋白是個(gè)跨膜蛋白，表達(dá)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上我最終的目的是想把這個(gè)蛋白提出來作為抗原去檢測(cè)患者血清中的抗體，所以對(duì)蛋白的量有一定要求。原來標(biāo)書寫的步驟是用免疫沉淀的方法來純化蛋白，但我認(rèn)為這個(gè)方案不可行，原因是一、哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白表達(dá)量少、膜蛋白提取的量也少，二、免疫沉淀其實(shí)就是用抗體去抓取目的蛋白，代價(jià)較大，不可能獲得大量目的蛋白來作為抗原去行Elisa檢測(cè)抗體。三、就算我不惜花錢，免疫沉淀最后洗脫的是Beads，得到的是抗原抗體復(fù)合物，會(huì)不會(huì)影響目標(biāo)蛋白的抗原性，因?yàn)槟繕?biāo)蛋白的抗原表位已經(jīng)被確定的一抗結(jié)合了。請(qǐng)各位戰(zhàn)友幫忙看看，給些建議，謝謝了。IP本身的假陽性和假陰性和多，具體的操作過程上面的幾位談的挺多了。我想說的是不管是co-IP還是Chip—定要有陰性control，也就是和一抗相同來源的normalIgG。因?yàn)橹樽颖旧砜梢晕揭欢ǖ牡鞍缀虳NA,包括一些抗原抗體的非特異性結(jié)合，所以很多時(shí)候陰性control和實(shí)驗(yàn)組時(shí)間是量的差別，而不是有或無的關(guān)系。這樣的結(jié)果還是可信的嗎？正好今天我也在第一次做這個(gè)實(shí)驗(yàn)，步驟按著這個(gè)程序做的，有經(jīng)驗(yàn)的人幫我看看。1、 Add3mlicecoldRIPAbuffertocellmonolayerandincubateat4°Cfor10minutes.Forsuspensioncells,addtheRIPAbuffertowashedcellpelletina15mlconicalcentrifugetube.2、 Disruptcellsbyrepeatedaspirationthrougha21gaugeneedleandtransfertoa15mlconicalcentrifugetube.3、 Pelletcellulardebrisbycentrifugationat10,000xgfor10minutesat4°C.Transfersupernatanttoafresh15mlconicalcentrifugetubeonice.Preclearlysate(optionalstep)byadding1.0pgoftheappropriatecontrolIgG(normalmouse,rat,rabbitorgoatIgG,correspondingtothehostspeciesoftheprimaryantibody),togetherwith20plofresuspendedvolumeofProteinA/GPLUS-Agarose.Incubateat4°Cfor30minutes.Pelletbeadsbycentrifugationat2,500rpm(approximately1,000xg)for5minutesat4°C.Transfersupernatant(celllysate)toafresh15mlconicalcentrifugetubeonice.4、 Transfer1mloftheabovecelllysate,orapproximately100-500pgtotalcellularprotein,toa1.5mlmicrocentrifugetube.Add1-10pl(i.e.,0.2-2pg)primaryantibody(optimalantibodyconcentrationshouldbedeterminedbytitration)andincubatefor1hourat4°C.5、 Add20plofresuspendedvolumeofProteinA/GPLUS-Agarose.Captubesandincubateat4°Conarockerplatformorrotatingdevicefor1hourtoovernight.6、 Collectimmunoprecipitatesbycentrifugationat2,500rpm(approximately1,000xg)for5minutesat4°C.Carefullyaspirateanddiscardradioactivesupernatant.7、 Washpellet4timeswith1.0mlRIPAbuffer(morestringent)orPBS(lessstringent),eachtimerepeatingcentrifugationstepabove.8、 Afterfinalwash,aspirateanddiscardsupernatantandresuspendpelletin40plof1xelectrophoresissamplebuffer.9、 Boilsamplesfor2-3minutesandanalyze20plaliquotsbySDSandautoradiography.Unusedsamplesmaybestoredat-20°C.10、 Optional:Afterboiling,samplesmaybecentrifugedtopellettheagarosebeadsfollowedbySDSanalysisofthesupernatant.不能理解第三步中Preclearlysate(optionalstep)byadding1.0pgoftheappropriatecontrolIgG(normalmouse,rat,rabbitorgoatIgG,correspondingtothehostspeciesoftheprimaryantibody),togetherwith20plofresuspendedvolumeofProteinA/GPLUS-Agarose.Incubateat4°Cfor30minutes.Pelletbeadsbycentrifugationat2,500rpm(approximately1,000xg)for5minutesat4°C.Transfersupernatant(celllysate)toafresh15mlconicalcentrifugetubeonice.這是什么作用？肯定不是對(duì)照了啰?。?！第五步，照上面戰(zhàn)友的說法孵育的溫度、時(shí)間、搖床的轉(zhuǎn)速都是很重要的哦？我還準(zhǔn)備就在室溫呢，會(huì)增加非特異性結(jié)合？抗體的量以及總蛋白的量(或者說他們的比值)重要不？需要嚴(yán)格控制不？還是需要調(diào)整？買的是santacruz的抗體，聽說是沒有驗(yàn)證過的，但說明書上寫明了是可以進(jìn)行免疫共沉淀的。心里沒底阿。謝謝BecausesomeproteinssuchascomplementcomponentsmaybindtotheFcregionoftheIgG,step3candepletetheseproteinsfromyoursamples.大家的發(fā)言都很精彩，我對(duì)IP的了解也是最近才開始的，受益匪淺啊這個(gè)protocol繁瑣而且效果很差。1?做co-IP是不宜采用變性能力強(qiáng)的去垢劑的lysisbuffer,所以不能用RIPA應(yīng)采用NP40等弱去垢為基礎(chǔ)的lysisbuffer.而且‘protocol中沒有說明多少的細(xì)胞加入3ml的lysisbuffer,我個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)是每組一個(gè)10cmplate的細(xì)胞足夠了，加入1mllysisbufferwithcompleteproteaseinhibitorcocktails。步驟3中的預(yù)處理需不需要的問題。我個(gè)人認(rèn)為，如果抗體質(zhì)量足夠好(沒有明顯的雜帶，或者雜帶確實(shí)不會(huì)產(chǎn)生影響)，則沒有必要。protocol中為什么有"radioactivesupernatant"?co-IP和CHIP都不會(huì)用同位素啊。而且protocol中離心的轉(zhuǎn)速我感覺太低了，通常5000-10000rpm均可，10000rpm30s或者5000rpm2min都不會(huì)對(duì)抗體抗原-beads復(fù)合物產(chǎn)生影響。4?所有的步驟均需要在4度，主要是抑制蛋白酶活性；抗體的量0.2ug-2ug之間可以，蛋白表達(dá)的量最好盡可能的高。santacruz的抗體既然寫了可以做IP,那說明還是沒有問題的。呵呵，devil19840一棒子把這個(gè)操作步驟打得這么死啊。明天看看結(jié)果就知道了。建議：有一種免疫沉淀的方案是有"radioactivesupernatant”，我們一般做的是不用同位素的免疫沉淀方案的，看具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧恕antacruz的抗體寫了可以做IP,但是出廠不檢驗(yàn)，看你的運(yùn)氣了，要多摸索條件。你的抗原是在細(xì)胞膜上還是在細(xì)胞核上，可根據(jù)情況選擇裂解液。4?免疫沉淀的結(jié)果最好同時(shí)有WESTERN對(duì)照，這樣可以知道是否成功沉淀了特異性條帶。免疫沉淀本身還有個(gè)陰性對(duì)照。5.實(shí)驗(yàn)注意低溫，操作細(xì)心。GOODLUCK無以為報(bào)，投上一票，謝謝。我做的目的蛋白是做成了轉(zhuǎn)基因小鼠了，在肝細(xì)胞的胞漿和胞核均有表達(dá)的。這次只是預(yù)試驗(yàn)一下，熟悉整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，沉淀得到的產(chǎn)物和提取的總蛋白一起做了個(gè)western看有沒有特異性條帶，但沒有陰性對(duì)照。沉淀得到的產(chǎn)物和提取的總蛋白sds電泳后考染效果還行，至少沉淀得到的產(chǎn)物除了抗體的兩條粗條帶還有一些細(xì)條帶，盡管現(xiàn)在還不能排除是否為非特異性的。但好像在目的蛋白的位置沒有條帶哦，太少？太弱？Godblessme!!作了快半年IP了，都不好意思說，到現(xiàn)在也沒得到好的結(jié)果，同樣也是第一次接觸這個(gè)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室沒人做過，只好在網(wǎng)上找方法，**里比較少，只有幾個(gè)帖子轉(zhuǎn)貼的方法，未見有討論的。我的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菣z測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染一種蛋白之后，培養(yǎng)基中的該蛋白分泌情況，在人體中這種蛋白分泌量極低，而且對(duì)培養(yǎng)基直接westernblot未見條帶，但對(duì)細(xì)胞裂解物作western有很強(qiáng)的條帶。該蛋白有信號(hào)肽，應(yīng)該分泌出細(xì)胞，因無抗體，構(gòu)建載體時(shí)在尾部加上了myc和his片段，我的大致試驗(yàn)過程是：1。 轉(zhuǎn)染該蛋白入HepG2細(xì)胞，3小時(shí)之后換有或無血清培養(yǎng)基（擔(dān)心血清里蛋白影響IP過程），24小時(shí)之后收集細(xì)胞和培養(yǎng)基。2。 westernblot檢測(cè)細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基中表達(dá)情況，每次細(xì)胞中表達(dá)都很好。培養(yǎng)基中都沒有見條帶。3。 對(duì)培養(yǎng)基的IP：a。1/1000的anti—myc50ul加入到1000ul培養(yǎng)基（直接1000ul,500ul培養(yǎng)基加500ulRIPAbuffer，500ul培養(yǎng)基加500ulTBS都試過），3小時(shí)和過夜都嘗試過，boProteinG凝膠50ul加入，1一3小時(shí)，（在加抗體之前precl